閆 婷 ,烏日恒 ,魯 敏 ,楊 榮 ,王美珍 ,劉雪鋒,3
(1 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院,呼和浩特 010010;2 內(nèi)蒙古自治區(qū)黑果枸杞工程[技術(shù)]研究中心,呼和浩特 010010;3 內(nèi)蒙古自治區(qū)沙地[沙漠]生態(tài)系統(tǒng)與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010010)
黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)屬于茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium),主要分布在中國寧夏賀蘭山、青海東部、新疆北部、內(nèi)蒙古西部、陜西北部、甘肅和西藏等干旱、鹽堿化程度較高的荒漠與半荒漠地區(qū)[1]。黑果枸杞漿果富含花色苷、多酚、多糖等物質(zhì),尤其是原花青素類物質(zhì)含量高達(dá)5%左右[2]。隨著黑果枸杞抗逆基因挖掘、果實(shí)發(fā)育機(jī)制以及花青素合成與積累等研究的深入,其基因功能及種質(zhì)遺傳改良成為研究熱點(diǎn)。目前,已報(bào)道的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系效率普遍偏低(約為16%左右)[3-4]。此外,在黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化過程中,會(huì)產(chǎn)生大量玻璃化幼苗,其組織結(jié)構(gòu)異常,生根移栽成活十分困難,對組培資源造成極大浪費(fèi),是遺傳轉(zhuǎn)化工作中亟待解決的一大難題[5-6]。任紅旭等[7]報(bào)道,在農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系研究中愈傷組織分化之后的再生幼苗產(chǎn)生了大量玻璃化現(xiàn)象;戴逢斌等[8]配制了一系列黑果枸杞快繁培養(yǎng)基,雖然克服了以莖段為外植體產(chǎn)生的玻璃化現(xiàn)象,但并未明確在遺傳轉(zhuǎn)化過程中是否可以用同樣方法克服黑果枸杞玻璃化;張佳琪等[9]發(fā)現(xiàn)添加適量濃度精胺可以顯著降低黑果枸杞幼苗的玻璃化率,但并未在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行進(jìn)一步探討。因此,建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系,有效降低黑果枸杞再生幼苗玻璃化率,突破靶標(biāo)基因低效遞送的遺傳轉(zhuǎn)化瓶頸,是黑果枸杞基因功能研究和遺傳改良的重要前提條件。為此,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑果枸杞幼苗葉片遺傳轉(zhuǎn)化的方法,優(yōu)化改進(jìn)黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化組合培養(yǎng)基,并篩選到合適的農(nóng)桿菌種類及適宜的侵染條件和侵染方法,使黑果枸杞的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)65%以上,降低再生幼苗玻璃化率至10%以下,為黑果枸杞分子育種奠定了基礎(chǔ)。
黑果枸杞果實(shí)采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣黑果枸杞資源圃,以新鮮果實(shí)中分離出的種子作為試驗(yàn)材料;質(zhì)粒p BI121-p35s∷GUS為內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院哈達(dá)教授惠贈(zèng);農(nóng)桿菌熱激感受態(tài)LBA4404、EHA105購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;卡那霉素(Kanamycin,Kan)、特美汀(Timentin,Tim)、頭孢霉素(Cefotaxime Solution,Cef)、利福平(Rifampicin,Rif)等抗生素及β-葡萄糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUS)染色試劑盒購自北京酷來博科技有限公司。
1.2.1 種子萌發(fā)及葉片外植體預(yù)培養(yǎng)
將黑果枸杞種子用70%乙醇浸泡30 s,再用0.1%氯化汞處理6~8 min,然后用滅菌的dd H2O 沖洗種子4~5次,播種于WPM(woody plant medium)培養(yǎng)基(p H=6.0)中萌發(fā)。培養(yǎng)30 d后,將黑果枸杞無菌幼苗葉片剪成1 cm 方塊,正面朝上,接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(pre-culture medium,PM)中預(yù)培養(yǎng)2 d。
1.2.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
取1μL(200 ng/μL)pBI121-p35s∷GUS(簡稱,pBI121)大腸桿菌質(zhì)粒分別混入20μL LBA4404或EHA105農(nóng)桿菌熱激感受態(tài)中,進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化;對轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行PCR 陽性檢測,根據(jù)GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶編碼基因)序列設(shè)計(jì)引物,引物擴(kuò)增長度398 bp,擴(kuò)增片段退火溫度為60℃。引物序列:GUS-F,5′-TCACAGCCAAAAGCCAGACA-3′,GUS-R,5′-TTGCTGAGTTTCCCCGTTGA-3′。篩選出含有pBI121 載體的陽性LBA4404和EHA105單克隆菌株,侵染備用。
1.2.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)與外植體侵染
將-80℃凍存的農(nóng)桿菌菌液LBA4404(包含pBl121載體)和EHA105(包含pBl121 載體)接種到添加相應(yīng)抗生素的YEB(yorkshire electricity board)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。28℃條件下,180 r/min搖菌24~48 h,待農(nóng)桿菌濃度達(dá)到OD600>1.0時(shí),離心收集農(nóng)桿菌菌體,棄上清,并用侵染液輕柔重懸菌體,用紫外分光光度計(jì)測定農(nóng)桿菌菌液濃度。50 m L侵染液配制方法:添加1/4 MS(1/4 Murashige&Skoog medium)液體培養(yǎng)基約49 m L,1 mol/L MES 0.5 m L,1 mol/L MgCl20.5 m L,200 mmol/L乙酰丁香酮50μL。試驗(yàn)設(shè)置農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度和侵染時(shí)間3個(gè)因素。其中,侵染所用農(nóng)桿菌選用LBA4404菌株和EHA105 菌株;農(nóng)桿菌侵染液終濃度(OD600)設(shè)定為0.4、0.6、0.8 3個(gè)水平;侵染時(shí)間設(shè)定15 min、25 min、35 min 3個(gè)梯度。3個(gè)因素共組成18個(gè)組合處理(2×3×3),每個(gè)侵染處理10瓶預(yù)培養(yǎng)的葉片外植體,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.4 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化
制備不同濃度的農(nóng)桿菌侵染液,浸泡預(yù)培養(yǎng)2 d后的葉片外植體,以不同侵染時(shí)間進(jìn)行侵染,侵染結(jié)束后,收集侵染葉片,在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(co-culture medium,COM)中放入1張滅菌濾紙,將葉片外植體置于該濾紙之上,26℃避光共培養(yǎng)3 d;共培養(yǎng)結(jié)束后,將共培養(yǎng)物先用滅菌水清洗5~6次,再用移液槍吹打500 mg/L頭孢溶液清洗2次,每次3~4 min,最后用無菌水沖洗3 次,繼而用濾紙將水吸干,轉(zhuǎn)移至含有抗生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(callus-induction medium,CIM)上培養(yǎng)約28 d;將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化選擇培養(yǎng)基(differentiation and selective medium,DSM)中,每個(gè)處理接種10瓶,每瓶接種3~4個(gè)愈傷,試驗(yàn)重復(fù)3次,培養(yǎng)28 d左右;將再生幼苗從愈傷組織上切下,插入生根培養(yǎng)基(rooting medium,RM)中,每次接種10瓶,每瓶接種4~5個(gè)愈傷,試驗(yàn)重復(fù)3次,生根培養(yǎng)時(shí)間14~28 d;將適宜大小的再生植株移土煉苗。試驗(yàn)采用的遺傳轉(zhuǎn)化用組合培養(yǎng)基主要包括預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化選擇培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基組成如表1所示。
表1 黑果枸杞葉片外植體遺傳轉(zhuǎn)化用組合培養(yǎng)基Table 1 The combined media for genetic transformation of leaf explants of L.ruthenicum
1.2.5 再生植株移栽煉苗
將黑果枸杞再生幼苗從培養(yǎng)瓶中取出,剝離培養(yǎng)基,再將生根幼苗移栽至營養(yǎng)土中,置于光照培養(yǎng)箱中,用扎眼的透明塑料杯覆蓋幼苗保持周圍環(huán)境濕潤,10 d后去除塑料杯,植株可以正常存活。培養(yǎng)箱內(nèi)的環(huán)境條件:光周期為16 h/8 h(晝/夜),相對濕度為60%,溫度為22~24℃,日光燈光照強(qiáng)度2 000 lx。從培養(yǎng)瓶中移苗的同時(shí)另取幼苗葉片檢測GUS活性,驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽性植株。
1.2.6 GUS活性檢測
在遺傳轉(zhuǎn)化的每一個(gè)過程(侵染后外植體葉片、愈傷組織、再生抗性芽、移植幼苗葉片等),均分別取相關(guān)組織進(jìn)行GUS活性檢測。按GUS 染色試劑盒(貨號:SL7160)說明書進(jìn)行GUS染色液配制及染色,最后用95%乙醇進(jìn)行脫色,直到將全部葉綠素洗脫干凈后,拍照。
將移植幼苗葉片進(jìn)行3次重復(fù)檢測,認(rèn)定3次檢測均為陽性的植株為最終轉(zhuǎn)基因陽性苗,通過轉(zhuǎn)基因陽性苗推測陽性愈傷的數(shù)量,并計(jì)算轉(zhuǎn)化率[(陽性愈傷數(shù)量/轉(zhuǎn)化總接種葉片數(shù))×100%]。
1.2.7 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)采用Origin 2017軟件統(tǒng)計(jì)分析。
將大腸桿菌質(zhì)粒p BI121以熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株LBA4404和EHA105,挑取農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行PCR,鑒定陽性菌株。結(jié)果(圖1)顯示,經(jīng)GUS-F/R引物PCR擴(kuò)增后獲得398 bp大小的條帶。取2號和3號單菌落保菌,-80℃凍存,用于后續(xù)黑果枸杞葉片的侵染試驗(yàn)。
M.100 bp PlusⅡDNA 標(biāo)記;1.大腸桿菌p BI121;2.轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404-PBI121單菌落;3.轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌EHA105-PBI121單菌落;W.dd H2 O;P.p BI121質(zhì)粒GUS序列擴(kuò)增圖。圖1 陽性農(nóng)桿菌LBA4404-PBI121和EHA105-PBI121菌株鑒定M,100 bp PlusⅡDNA marker.1,Escherichia coli pBI121.2,single colony of transformed LBA4404-PBI121.3,single colony of transformed EHA105-PBI121.W,dd H2 O.P,amplification of GUS fragment of pBI121 plasmid.Fig.1 Identification of the positive LBA4404-PBI121 and EHA105-PBI121 strains
確定侵染條件是遺傳轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要的一步,不僅涉及到侵染后的葉片狀態(tài)、死亡率(包括污染率和侵染濃度過大后外植體軟爛個(gè)體),還需綜合考慮外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上抗性愈傷產(chǎn)生的數(shù)目和狀態(tài)。本研究中使用1/4 MS液體培養(yǎng)基代替dd H2O以調(diào)節(jié)侵染液的滲透壓,而乙酰丁香酮的加入可以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化與表達(dá),從而使農(nóng)桿菌TDNA更易進(jìn)入植物基因組,并與其整合[10]。
從表2可知,在農(nóng)桿菌濃度(OD600)為0.6,侵染時(shí)間為25 min 時(shí),農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121 和EHA105-p BI121侵染外植體死亡率分別為5.8%和13.2%,而抗性愈傷誘導(dǎo)率分別為96%和78.2%。
表2 不同農(nóng)桿菌侵染條件下黑果枸杞葉片外植體愈傷誘導(dǎo)情況Table 2 The callus-induction rate of leaf explants of L.ruthenicum infected by A grobacterium strains under different conditions
通常情況下,EHA105 菌株比LBA4404 菌株具有較強(qiáng)的侵染毒性[11],而本研究中黑果枸杞葉片外植體受到農(nóng)桿菌EHA105-p BI121 和LBA4404-pBI121侵染表現(xiàn)出的存活率及抗性愈傷大小的差異也可以證明這一點(diǎn)。所以,以侵染后外植體死亡率(或存活率)和抗性愈傷誘導(dǎo)率作為評價(jià)指標(biāo),黑果枸杞葉片外植體農(nóng)桿菌侵染的最適條件是農(nóng)桿菌終濃度(OD600)為0.6,侵染時(shí)間為25 min,在此條件下共培養(yǎng)后的供試葉片外植體移入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,抗性愈傷誘導(dǎo)率為78.2%~96%。
在抗性愈傷組織形成之后,再生幼苗的形成、正常分化和發(fā)育是提高遺傳轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素。本研究將抗性愈傷組織接種到以MS(DSM1)、MSF(DSM2)、WPM(DSM3)和WPF(DSM4)為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中,各培養(yǎng)基均附加激素6-BA 0.25 mg/L,以此在抗性愈傷組織中檢測其培養(yǎng)和分化效果。
結(jié)果(表3)表明,經(jīng)農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121和EHA105-pBI121 侵染過后,愈傷組織出芽數(shù)量與愈傷數(shù)量的比值在DSM2 培養(yǎng)基中分別達(dá)到3.20和4.82,與DSM1、DSM3、DSM4培養(yǎng)基差異顯著;尤其是在卡那霉素的篩選壓力下,農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121 和EHA105-p BI121 處理后 在DSM2培養(yǎng)基中形成的再生芽增殖倍數(shù)分別達(dá)3.20倍和5.63倍,與在DSM1、DSM3、DSM4培養(yǎng)基上幼芽的發(fā)育情況具有顯著差異。
表3 不同農(nóng)桿菌侵染后黑果枸杞葉片外植體在不同分化選擇培養(yǎng)基中出芽情況Table 3 Comparisons of budding of leaf explants of L.ruthenicum on different differentiation and selection media after infection with different Agrobacterium tumefaciens
因此,DSM2培養(yǎng)基在抗性愈傷組織芽體分化和選擇水平上極具優(yōu)勢。同時(shí),以農(nóng)桿菌EHA105-pBI121侵染后的葉片外植體生長狀態(tài)為例(圖2),DSM1與DSM2 培養(yǎng)基上再生幼苗的數(shù)量明顯多于DSM3和DSM4培養(yǎng)基。此外,DSM1與DSM2培養(yǎng)基上再生幼苗葉片顏色呈現(xiàn)綠色而非紫色,其原因可能是由于DSM1 與DSM2 培養(yǎng)基比DSM3和DSM4培養(yǎng)基中添加了更多的氮素,而氮素的豐缺與葉片中葉綠素的含量有著密切的關(guān)系。袁海靜等[12]研究表明,枸杞具有較強(qiáng)鐵元素吸收和積累能力。本研究中將Fe鹽母液添加到分化培養(yǎng)基中,意外發(fā)現(xiàn)在不影響再生苗發(fā)生率的同時(shí),幼苗變得更綠更茁壯。
A.DSM1培養(yǎng)基;B.DSM2培養(yǎng)基;C.DSM3培養(yǎng)基;D.DSM4培養(yǎng)基。圖2 黑果枸杞葉片外植體在不同分化選擇培養(yǎng)基中再生幼苗發(fā)育情況A.DSM1 medium.B.DSM2 medium.C.DSM3 medium.D.DSM4 medium.Fig.2 Development of the regenerated seedlings from leaf explants of L.ruthenicum on different differentiation and selection media
因此,以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,配合相應(yīng)的植物激素,再添加Fe鹽母液等成分,組成了黑果枸杞最適分化選擇培養(yǎng)基,即DSM2培養(yǎng)基。
再生幼苗從愈傷組織上切下后,分別接種到以1/2 MS、WPM 和MS為基礎(chǔ)的RM1、RM2和RM3培養(yǎng)基中,各培養(yǎng)基均附加激素IBA 0.25 mg/L,以此篩選最適生根培養(yǎng)基。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中,更高的生根率、更好的植株生長和發(fā)育狀態(tài)可以極大提高植株成活率。本研究中將農(nóng)桿菌EHA105-pBI121侵染后的黑果枸杞再生幼苗剪切下來,分別接種到RM1、RM2和RM3生根培養(yǎng)基中,其再生幼苗生長情況如圖3所示。黑果枸杞再生幼苗培養(yǎng)7 d后即可顯示出不同生根培養(yǎng)基在幼苗生長中產(chǎn)生的差異。其中,從幼苗生長狀態(tài)來看,RM2培養(yǎng)基中葉片顏色正常;從再生苗根部發(fā)育情況看,RM1與RM2培養(yǎng)基中,再生幼苗已經(jīng)開始發(fā)育出不定根,尤其以RM2生根培養(yǎng)基中根系發(fā)育最為旺盛,而生根組合RM3培養(yǎng)基中幼苗在接種7 d內(nèi)幾乎無根系生長。
A1、B1、C1.再生苗7 d的葉片發(fā)育情況;A2、B2、C2.再生苗7 d的生根情況;A3、B3、C3.再生苗21 d的生根情況。圖3 黑果枸杞再生幼苗在不同生根培養(yǎng)基(RM1,RM2,RM3)中生根及發(fā)育情況A1,B1,C1.Leaves development of the regenerated seedlings for 7 days.A2,B2,C2.Rooting of the regenerated seedlings for 7 days.A3,B3,C3.Rooting of the regenerated seedlings for 21 days.Fig.3 Rooting and development of the regenerated seedlings of L.ruthenicum on different rooting media(RM1,RM2,RM3)
從黑果枸杞再生幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后的根系發(fā)育統(tǒng)計(jì)情況(表4)來看,再生幼苗生根率在RM2 培養(yǎng)基中為81.23%,分別比RM1 和RM3培養(yǎng)基顯著提高94.93%和274.84%;而再生苗生根數(shù)量與生根苗數(shù)量之比在RM2培養(yǎng)基中為14.37,同樣顯著高于RM1和RM3培養(yǎng)基。
表4 黑果枸杞再生幼苗在不同生根培養(yǎng)基中根系發(fā)育情況Table 4 Root development of the regenerated seedlings of L.ruthenicum on different rooting media
同時(shí),RM1培養(yǎng)基上再生幼苗生根率及生根數(shù)量與生根苗數(shù)量之比均顯著高于RM3培養(yǎng)基。因此,以WPM 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加IBA 激素0.25 mg/L的RM2為黑果枸杞再生幼苗最適生根培養(yǎng)基。
由于菌株侵染毒性有所不同,農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121和EHA105-p BI121在侵染外植體后的愈傷誘導(dǎo)階段,在愈傷形成率和愈傷組織的大小方面顯示出差異(表1);在最適分化選擇培養(yǎng)階段,二者農(nóng)桿菌處理形成的抗性愈傷出芽率分別為100.00%和85.70%(表3)。但值得關(guān)注的是,雖然供試農(nóng)桿菌毒性有所差異,但在一定范圍內(nèi),農(nóng)桿菌EHA105-pBI121的活性似乎強(qiáng)于農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121:盡管經(jīng)過農(nóng)桿菌EHA105-pBI121處理的葉片外植體產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量較農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121處理少,但其黑果枸杞抗性愈傷組織產(chǎn)生了更多的再生幼芽;而在再生幼芽發(fā)育成幼苗階段,農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121侵染的葉片外植體產(chǎn)生的黑果枸杞幼苗玻璃化率約為65.03%,而農(nóng)桿菌EHA105-p BI121侵染的葉片外植體產(chǎn)生的幼苗玻璃化率僅為9.30%左右(表3、圖4)。
A.農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121;B.農(nóng)桿菌EHA105-p BI121。圖4 不同農(nóng)桿菌侵染對黑果枸杞再生芽發(fā)育的影響A.Agrobacterium LBA4404-pBI121.B.Agrobacterium EHA105-p BI121.Fig.4 Effects of infection by different Agrobacterium strains on the development of the regenerated buds of L.ruthenicum
幼苗生根與植株移栽成活率密切相關(guān)。從圖5可看出,在不同農(nóng)桿菌侵染過后,黑果枸杞再生幼苗在最適生根培養(yǎng)基上生根率和生根苗數(shù)均無顯著差異,而農(nóng)桿菌EHA105-p BI121 侵染處理的幼苗數(shù)量和生根總數(shù)與生根苗數(shù)量比值均顯著高于農(nóng)桿菌LBA4404-pBI121處理。其中,再生苗生根總數(shù)與生根苗數(shù)量的比值在農(nóng)桿菌EHA105-pBI121和LBA4404-pBI121侵染處理后分別為14.6 和3.07,EHA105-pBI121具有明顯優(yōu)勢。
圖5 在最適生根培養(yǎng)基上不同農(nóng)桿菌侵染黑果枸杞再生幼苗的生根情況Fig.5 Rooting of the regenerated seedlings of L.ruthenicum infected with different Agrobacterium strains on the optimal rooting media
本研究在農(nóng)桿菌侵染黑果枸杞葉片外植體后第3天(A 階段)、抗性愈傷組織形成后(B 階段)、再生幼芽(C階段)及再生幼苗煉苗移栽后(D 階段)的4個(gè)時(shí)期,分別對植物組織進(jìn)行GUS活性檢測,結(jié)果(圖6)在上述4個(gè)階段中,每一階段測試的植物組織均有GUS表達(dá)。其中,在侵染結(jié)束后3 d,外植體葉片上即產(chǎn)生深藍(lán)色斑點(diǎn),說明兩種測試農(nóng)桿菌侵染效果良好(圖6,A1、A2);接著又隨機(jī)挑取已經(jīng)在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長21 d的愈傷組織進(jìn)行GUS染色,在愈傷組織邊緣可見藍(lán)色組織塊(圖6,B1、B2),這說明在愈傷組織形成過程中,帶有GUS活性的細(xì)胞進(jìn)行了大量增殖,并在增殖細(xì)胞中GUS基因持續(xù)表達(dá);在分化選擇培養(yǎng)期間,再生幼芽開始發(fā)育,切取幼芽進(jìn)行GUS活性檢測,發(fā)現(xiàn)再生幼芽細(xì)胞當(dāng)中也產(chǎn)生了有活性的GUS蛋白(圖6,C1、C2);再生幼苗煉苗后,將每株再生植株進(jìn)行標(biāo)號,取其葉片,分別進(jìn)行GUS染色,從而確定轉(zhuǎn)基因植株。
A1、B1、C1、D1分別為農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121侵染后葉片外植體、抗性愈傷組織、再生芽GUS染色及其再生幼苗,而A2、B2、C2、D2分別為農(nóng)桿菌EHA105-p BI121侵染后葉片外植體、抗性愈傷組織、再生芽GUS染色及其再生幼苗。E為轉(zhuǎn)基因陽性植株煉苗移栽。F1和F2分別為農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121和EHA105-p BI121侵染后轉(zhuǎn)基因植株葉片GUS穩(wěn)定表達(dá)。圖6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑果枸杞葉片外植體遺傳轉(zhuǎn)化各階段中GUS活性檢測A1,B1,C1,D1 are GUS staining of leaf explants,callus,regeneration bud and regeneration seedlings after infection with LBA4404-p BI121 Agrobacterium,while A2,B2,C2,D2 are GUS staining of leaf explants,callus,regeneration bud and regeneration seedlings after infection with EHA105-p BI121 Agrobacterium.E are positive transformation lines transferred to soil.F1 and F2 stand for stable GUS expression in the leaves of transgenic lines infected with LBA4404-pBI121 and EHA105-p BI121 Agrobacterium,respectively.Fig.6 GUS activity assay in different stage of Agrobacterium-mediated transformation of L.ruthenicum leaf explants
為了確定整個(gè)黑果枸杞組合培養(yǎng)體系的遺傳轉(zhuǎn)化率,從愈傷組織上切割幼苗時(shí),將同一個(gè)愈傷組織產(chǎn)生的幼苗單瓶培養(yǎng)并標(biāo)記,直至最終移栽后,通過統(tǒng)計(jì)陽性幼苗數(shù)量,計(jì)算轉(zhuǎn)基因陽性愈傷數(shù)量。將陽性的愈傷數(shù)量/總接種葉片數(shù)比值作為本體系遺傳轉(zhuǎn)化效率評價(jià)指標(biāo)。結(jié)果(表5)表明,農(nóng)桿菌LBA4404-p BI121 侵染后幼苗成活率為93%(80/86),遺傳轉(zhuǎn)化率約為51.02%;農(nóng)桿菌EHA105-p BI121侵染后幼苗成活率為96%(96/100),遺傳轉(zhuǎn)化率為65.22%。因此,農(nóng)桿菌EHA105-pBI121侵染后幼苗無論從成活率還是遺傳轉(zhuǎn)化率方面都為優(yōu)選農(nóng)桿菌。
表5 2種農(nóng)桿菌菌株處理下黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化情況Table 5 Genetic transformation of L.ruthenicum infected by two different Agrobacterium strains
侵染過程是遺傳轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要的一步,在保證外植體處于正常生長狀態(tài)的同時(shí),需要將農(nóng)桿菌中攜帶目的基因的T-DNA 盡可能地與外植體細(xì)胞進(jìn)行整合,同時(shí)在整合的過程中需要外植體與農(nóng)桿菌密切配合,才能達(dá)到最佳平衡狀態(tài)。而不適宜或較為敏感的外植體會(huì)因農(nóng)桿菌侵染強(qiáng)度過大,導(dǎo)致侵染之后即產(chǎn)生軟、爛形態(tài),無法形成愈傷組織;若農(nóng)桿菌菌液濃度太低,雖外植體發(fā)育正常,但容易導(dǎo)致抗性愈傷弱小或遺傳轉(zhuǎn)化率下降。在植物基因工程中,農(nóng)桿菌LBA4404[3,13]、GV3101[4,14-15]、EHA101[13]、EHA105[3,16]均為常用遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株。其中,農(nóng)桿菌GV3101、EHA101和EHA105菌株均為C58型遺傳背景,而農(nóng)桿菌EHA105菌株是一種侵染毒性稍強(qiáng)的根癌農(nóng)桿菌類型[11],農(nóng)桿菌LBA4404菌株為Ach5型遺傳背景,這種類型侵染毒性較弱。本研究參考前人已報(bào)道的枸杞遺傳轉(zhuǎn)化效率較好的菌株類型[3-4,13-16],并且根據(jù)這些不同類型菌株的侵染毒性和遺傳背景差異,最終篩選出2 種農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105菌株進(jìn)行試驗(yàn)。
本研究中,黑果枸杞葉片外植體在最適侵染條件下,經(jīng)過農(nóng)桿菌EHA105-p BI121 侵染的外植體成活率較LBA4404菌株的略低,抗性愈傷組織生長形態(tài)相對較小,但在本研究中發(fā)現(xiàn),前期抗性愈傷組織的形態(tài)大小似乎并不影響外植體在分化選擇階段再生幼苗的發(fā)育。在黑果枸杞再生幼苗的形成、分化和發(fā)育過程中,可能需要大量的氮素,而MS培養(yǎng)基中更多氮素的添加給幼苗提供了更多可以產(chǎn)生葉綠素的原料,因此以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的分化選擇培養(yǎng)基更適于再生幼苗的分化。袁海靜等[12]研究表明,將寧夏枸杞生根培養(yǎng)基中添加2倍的鐵鹽溶液和有機(jī)成分可誘導(dǎo)寧夏枸杞外植體生根,并且對其生長起到明顯的促進(jìn)作用。本研究中也發(fā)現(xiàn),黑果枸杞在再生芽分化和選擇培養(yǎng)階段,也顯示出了較強(qiáng)的鐵吸收特性,因此DSM2培養(yǎng)基為最適分化選擇培養(yǎng)基。
WPM 培養(yǎng)基是用于木本植物組織培養(yǎng)的低鹽培養(yǎng)基。WPM 培養(yǎng)基相對MS培養(yǎng)基而言,用硫酸鉀替換了硝酸鉀,硝酸銨含量降低到了MS培養(yǎng)基的1/4,氮素主要以硝酸鈣的形式供應(yīng)。包振華等[17]研究發(fā)現(xiàn),寧夏枸杞莖段外植體在1/2 MS培養(yǎng)基中的生根率高于MS培養(yǎng)基,相關(guān)研究也證明了這一點(diǎn)[8,18]。而本研究表明,黑果枸杞再生幼苗在WPM 低鹽培養(yǎng)基中的生根率是1/2 MS培養(yǎng)基生根率的2倍左右。
在黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化過程中,大量玻璃化幼苗是在組織培養(yǎng)過程中引起的生理失調(diào)現(xiàn)象[16]。目前,黑果枸杞或枸杞組培苗玻璃化的影響因素主要有6-BA 濃度[8,20]、蔗糖濃度[8,20]、瓊脂濃度[8,20]、培養(yǎng)溫度[8,19-20]、光照時(shí)間[8,19-20]。在考慮到以上環(huán)境因素影響的前提之下,本研究用同屬于細(xì)胞分裂素的激動(dòng)素6KT 代替了部分芐氨基嘌呤(6-BA),防止6BA 濃度過高引起的玻璃化現(xiàn)象;在優(yōu)化黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的過程中,發(fā)現(xiàn)遺傳背景不同的農(nóng)桿菌可能會(huì)影響黑果枸杞幼苗玻璃化形成率。本研究結(jié)果表明,農(nóng)桿菌LBA4404 和EHA105 均適用于黑果枸杞的遺傳轉(zhuǎn)化,其遺傳轉(zhuǎn)化率均可獲得50%以上的轉(zhuǎn)基因植株,但綜合考慮時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本,農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系應(yīng)為最適方案,該方案可使黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%以上,分化幼苗玻璃化率降低至10%以下。
黑果枸杞葉片高效組合培養(yǎng)體系包括:葉片外植體遺傳轉(zhuǎn)化用菌株為農(nóng)桿菌EHA105,最適侵染農(nóng)桿菌終濃度(OD600)為0.6,侵染時(shí)間為25 min;預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基為WPM+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L+6KT 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L;最適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+肌醇50 mg/L+煙酸0.25 mg/L+維生素B60.25 mg/L+Fe鹽母液1 m L/L+甘氨酸1.0 mg/L+維生素B10.05 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L+6KT 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+Kan 30 mg/L+Tim 300 mg/L(p H=6.0);再生幼芽最適分化與誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+肌醇50 mg/L+煙酸0.25 mg/L+維生素B60.25 mg/L+鐵鹽母液1 m L/L+甘氨酸1.0 mg/L+維生素B10.05 mg/L+6-BA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+Kan 30 mg/L+Tim 300 mg/L(p H=6.0);再生幼苗最適生根培養(yǎng)基為WPM+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+Kan 30 mg/L+Tim 300 mg/L (p H=6.0)。