趙 榕,王 猛,趙雅杰,朱孔艷,溫玉潔,包海柱

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,呼和浩特 010019)

向日葵(Helianthus annuusL.)是中國主要的油料作物之一,廣泛種植于內(nèi)蒙古、新疆、東北三省以及甘肅、河北、寧夏、陜西等地,并以內(nèi)蒙古的種植面積最大,占全國種植面積50%以上[1]。近年來向日葵列當(dāng)在中國已經(jīng)大面積發(fā)生,部分地區(qū)已經(jīng)造成向日葵絕收,成為中國向日葵穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)最大的隱患之一[2],因此,向日葵列當(dāng)?shù)姆乐我呀?jīng)成為內(nèi)蒙古地區(qū)向日葵生產(chǎn)中亟待解決的問題。

向日葵列當(dāng)(Orobanche cumana)又稱毒根草,是列當(dāng)科列當(dāng)屬的一年生全寄生草本植物,株高15～54 cm 不等[3],主要寄生在向日葵的根上,嚴(yán)重影響向日葵的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明,向日葵列當(dāng)寄生后顯著降低向日葵灌漿期植株葉面積指數(shù),降低向日葵群體光合速率,進(jìn)而影響干物質(zhì)的合成與積累[4]。研究發(fā)現(xiàn),在向日葵第7號(hào)染色體上存在1個(gè)列當(dāng)抗性基因HaOr7,該基因編碼富含亮氨酸的受體樣激酶,可防御向日葵列當(dāng)?shù)募纳鶾5];黃瓜被列當(dāng)寄生后可發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),通過提高過氧化氫酶、過氧化物酶、酚類化合物活性來一定程度上增強(qiáng)對(duì)列當(dāng)?shù)目剐訹6];生長(zhǎng)素(IAA)和水楊酸(SA)處理能顯著降低番茄幼苗被列當(dāng)感染引起的氧化損傷;SA處理的番茄種子可以通過增加抗氧化防御標(biāo)志物(包括抗氧化代謝物類胡蘿卜素、酚類物質(zhì)、類黃酮、ASC、GSH、生育酚以及和抗氧化酶CAT、POX、GPX、SOD、GR、APX、MDHAR、DHAR)來提高列當(dāng)抗性[7]。Sisou等[8]認(rèn)為,當(dāng)列當(dāng)種子萌發(fā)后,向日葵抗性材料的初級(jí)防御系統(tǒng)會(huì)感知到列當(dāng)幼苗對(duì)根部的附著,進(jìn)而激活PR基因,產(chǎn)生β-葡聚糖酶,分解列當(dāng)細(xì)胞壁,同時(shí)木質(zhì)素和其他酚類化合物在寄生區(qū)域積累形成物理屏障,從而阻止列當(dāng)與向日葵建立連接,導(dǎo)致列當(dāng)死亡。Yang等[9]通過對(duì)向日葵感(TK0409)、抗(JY209)列當(dāng)材料接種列當(dāng),并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)刺激列當(dāng)萌發(fā)的向日根系分泌物在2個(gè)向日葵品種之間無顯著差異,并且發(fā)現(xiàn)PAR1(蛋白酶激活受體)可能是潛在的植物防御反應(yīng)的物質(zhì)。近年來隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)因具有高通量、高靈敏度、高分辨率等諸多優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于植物抗逆研究中[10]。本研究以轉(zhuǎn)錄組學(xué)和植物生理學(xué)為基礎(chǔ),通過分析向日葵抗、感材料在列當(dāng)寄生下的代謝通路和生理響應(yīng),明確向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)募纳剐苑磻?yīng),以期揭示向日葵對(duì)列當(dāng)寄生的抗性分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

向日葵供試材料分別是抗列當(dāng)材料s41和高感列當(dāng)材料s26,其抗性分級(jí)依據(jù)向日葵抗列當(dāng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)《向日葵品種抗列當(dāng)?shù)燃?jí)田間鑒定技術(shù)規(guī)程》(DB 15/T 1946—2020)[11],并依據(jù)技術(shù)規(guī)程,將向日葵種質(zhì)資源對(duì)列當(dāng)抗性分為5個(gè)等級(jí),分別為免疫[寄生程度(parasitism degree,AD)與寄生率(parasitism rate,F)均 為0]、高 抗(010,70%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年7-8月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室中進(jìn)行,采用盆栽法種植抗、感列當(dāng)向日葵材料,盆高18 cm、直徑17 cm。準(zhǔn)備好培養(yǎng)土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶砂土=1∶1∶1混合)、接種土(列當(dāng)種子∶培養(yǎng)土=0.02 g∶500 g混合),先在盆底裝1/3盆體積的培養(yǎng)土,再裝入1/3盆體積的接種土,而后用培養(yǎng)土裝滿,用水澆透,備用。選取大小均勻,顆粒飽滿的向日葵種子播種在盆中,每個(gè)向日葵材料各接種5盆(s26、s41),以不接種列當(dāng)?shù)?盆為對(duì)照組(s26CK、s41CK),4株/盆。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法

在向日葵長(zhǎng)出5對(duì)真葉后,分別采集接種組和對(duì)照組5盆向日葵全部根系,用蒸餾水洗凈,混樣后將向日葵根樣分為兩部分,采用液氮速凍后將其放入-80℃冰箱保存,分別用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生理指標(biāo)測(cè)定,每個(gè)指標(biāo)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.1 生理生化指標(biāo)

向日葵根系谷胱甘肽、水楊酸含量及苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、抗壞血酸過氧化物酶活性的測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫吸附法,試驗(yàn)步驟按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)。總酚含量檢測(cè)采用福林比色法,試驗(yàn)步驟參照試劑盒的說明書的方法進(jìn)行(南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 總RNA提取、文庫構(gòu)建及測(cè)序

提取樣品總RNA(mir VanaTMmiRNA ISOlation Kit,Ambion-1561試劑盒)并使用DNase消化DNA 后,用帶有Oligo(d T)的磁珠富集真核生物m RNA;加入打斷試劑將mRNA 打斷成短片段,以打斷后的m RNA 為模板,用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA,然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA,并使用試劑盒純化雙鏈cDNA;純化的雙鏈cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭,然后進(jìn)行片段大小選擇,最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增;構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后,使用Illumina HiSeq TM 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

為了得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(reads),需要對(duì)原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)量過濾。首先使用Trimmomatic[13]軟件去除接頭,過濾低質(zhì)量堿基,得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)(clean reads)。使用Cufflinks[14]軟件對(duì)基因FPKM[15]表達(dá)量定量。計(jì)算基因的表達(dá)量差異,通過Htseqcount[16]軟件獲取落到各個(gè)樣本中基因的reads數(shù)目,使用DESeq R package[17]的estimateSizeFactors函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并使用nbinom Test函數(shù)計(jì)算差異比較的P值和差異倍數(shù)。挑選出P<0.05,差異倍數(shù)>2的差異基因,進(jìn)行差異基因的GO和KEGG[18]分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種列當(dāng)對(duì)向日葵根系和植株形態(tài)的影響

列當(dāng)寄生向日葵后,向日葵的根系形態(tài)被破壞(圖1)。其中,列當(dāng)寄生的高感向日葵材料(s26)根系數(shù)量明顯少于其對(duì)照(s26CK)和列當(dāng)寄生的高抗材料(s41),s41的根系數(shù)量與其對(duì)照(s41CK)則無明顯差別。

圖1 高感(s26)、高抗(s41)列當(dāng)向日葵材料接種和對(duì)照根部、植株形態(tài)及列當(dāng)形態(tài)Fig.1 Morphology of roots,seedlings,and broomrapes of the resistant(s41)and susceptible(s26)sunflowers under inoculations

向日葵根系被破壞,嚴(yán)重影響其正常生發(fā)發(fā)育,且列當(dāng)從向日葵根部吸取水分和營(yíng)養(yǎng),導(dǎo)致高感材料(s26)植株高度同時(shí)明顯低于其對(duì)照(s26CK),也明顯低于高抗材料(s41),高抗材料(s41)植株高相較于對(duì)照(s41CK)則無明顯差別。

2.2 接種列當(dāng)向日葵根系轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量分析

對(duì)全部樣本進(jìn)行有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(表1),共獲得85.77 G 的Clean數(shù)據(jù),各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在6.56～7.45 G 之間,Q30堿基分布在90.61%～93.63%之間,平均GC含量為45.23%,通過將reads比對(duì)到參考基因組上,得到各個(gè)樣本的基因組比對(duì)情況,比對(duì)率為77.23%～86.31%,數(shù)據(jù)顯示向日葵根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量良好,可進(jìn)行后續(xù)代謝通路及GO 分析。

表1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量分析Table 1 Analysis of transcriptome sequencing quality

2.2.2 感、抗材料差異基因表達(dá)分析

差異基因篩選分析結(jié)果(圖2)顯示,向日葵感、抗材料接種列當(dāng)后共篩選出差異表達(dá)基因23 930個(gè)。其中,感列當(dāng)材料對(duì)照(s26CK)與抗列當(dāng)材料對(duì)照(s41CK)相比,差異基因共有6 362個(gè),其中上調(diào)3 073個(gè),下調(diào)3 289 個(gè);感、抗列當(dāng)材料接種列當(dāng)(s26、s41)后,兩者差異基因共有6 609個(gè),其中上調(diào)3 294個(gè),下調(diào)3 315個(gè);s41與s41CK相比,差異基因共有5 490個(gè),包括上調(diào)3 075個(gè),下調(diào)2 415個(gè);s26與s26CK相比,差異基因共有5 469個(gè),包括上調(diào)3 298個(gè),下調(diào)2 171個(gè)。s41-s41CK差異基因總數(shù)較s26-s26CK多21個(gè)(0.38%),上調(diào)基因數(shù)較s26-s26CK少223個(gè),下調(diào)基因數(shù)較s26-s26CK多244個(gè)。s26-s41差異基因總數(shù)較s26CK-s41CK多247個(gè)(3.18%),上調(diào)基因數(shù)和下調(diào)基因數(shù)分別較s26CK-s41CK多221個(gè)和26個(gè)。綜上表明,接種列當(dāng)處理相較于對(duì)照而言,無論是抗性材料還是高感材料,差異表達(dá)基因數(shù)中上調(diào)基因數(shù)均明顯多于下調(diào)基因數(shù)。

圖2 接種列當(dāng)與對(duì)照向日葵材料差異表達(dá)基因數(shù)量Fig.2 Number of differential genes between the inoculated and control sunflowers

2.2.3 差異表達(dá)基因GO 功能富集分析

對(duì)列當(dāng)寄生的向日葵根系差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和功能富集分析(表2)可知,4個(gè)比較組均分為3個(gè)主要類型:生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)。其中,s26-s41組富集到的差異基因共有6 452個(gè),上調(diào)3 164個(gè),下調(diào)3 288個(gè),差異基因注釋到GO 分類中,其中生物過程有22個(gè)小類別,細(xì)胞組分有9個(gè)小類別,分子功能有13個(gè)小類別;差異基因數(shù)量位列前10 的小類別分別為:細(xì)胞過程、結(jié)合、細(xì)胞器、代謝過程、催化活性、膜、刺激響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程。s26-s26CK組富集到差異基因共6 455個(gè),上調(diào)3 485個(gè),下調(diào)2 970個(gè),差異基因注釋到GO 分類中,其中生物過程有22個(gè)小類別,細(xì)胞組分有9個(gè)小類別,分子功能有13個(gè)小類別;差異基因數(shù)量位列前10的小類別分別為細(xì)胞過程、結(jié)合、細(xì)胞器、代謝過程、催化活性、膜、刺激響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程。s41-s41CK組富集到差異基因共6 322個(gè),上調(diào)3 407個(gè),下調(diào)2 915個(gè),差異基因注釋到GO分類中,其中生物過程有22個(gè)小類別,細(xì)胞組分有9個(gè)小類別,分子功能有13個(gè)小類別;差異基因數(shù)量位列前10的小類別分別為細(xì)胞過程、細(xì)胞器、結(jié)合、代謝過程、催化活性、膜、刺激響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程。s26CK-s41CK組富集到差異基因共6 565個(gè),上調(diào)3 112個(gè),下調(diào)3 453個(gè),差異基因注釋到GO 分類中,其中生物過程有22個(gè)小類別,細(xì)胞組分有9個(gè)小類別,分子功能有12個(gè)小類別;差異基因數(shù)量位列前10的小類別分別為細(xì)胞過程、細(xì)胞器、結(jié)合、代謝過程、催化活性、膜、刺激響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程的調(diào)節(jié)、發(fā)育過程。

表2 GO 二級(jí)分類數(shù)前10位差異表達(dá)基因Table 2 The top 10 differentially expressed genes of GO secondary classification

2.2.4 差異表達(dá)基因KEGG pathway富集分析

通過對(duì)KEGG 代謝途徑的分析,差異表達(dá)基因總體上被分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息、遺傳信息、代謝和生化系統(tǒng)等5大類,進(jìn)一步可細(xì)分為18個(gè)子類,即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),膜轉(zhuǎn)運(yùn),翻譯,轉(zhuǎn)錄,復(fù)制和修復(fù)、折疊,分選和降解,核苷酸代謝,萜類化合物和酮類化合物代謝,輔酶和維生素代謝,其他氨基酸代謝,脂代謝,多糖的合成和代謝,能量代謝,糖代謝,其他次生代謝產(chǎn)物生物合成,氨基酸代謝,環(huán)境適應(yīng),運(yùn)輸和分解代謝。在接種列當(dāng)條件下,主要影響著感、抗材料的糖代謝、氨基酸代謝、脂代謝、次生代謝物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、折疊、分選和降解、翻譯等過程(表3)。

表3 差異基因KEGG pathway分類Table 3 Differential genes from KEGG pathway

2.2.5 代謝通路分析

在水楊酸代謝途徑(圖3)中,接種列當(dāng)后向日葵根系通過苯丙氨酸代謝途徑生成水楊酸,影響NPR1蛋白相關(guān)基因、TGA 家族相關(guān)基因和病程相關(guān)蛋白PR-1基因表達(dá),表現(xiàn)為植物的抗病性。s26相較于s26CK和s41相較于s41CK,水楊酸代謝途徑編碼NPR1蛋白相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)、轉(zhuǎn)錄因子TGA家族相關(guān)基因表達(dá)均下調(diào),病程相關(guān)蛋白PR-1基因既有上調(diào)又有下調(diào)。s26與s41相比,編碼NPR1基因表達(dá)無顯著變化,TGA 家族相關(guān)基因表達(dá)均有上調(diào)又有下調(diào),而病程相關(guān)蛋白PR-1基因表達(dá)呈下調(diào)。

KEGG通路圖上紅色表示上調(diào)基因,綠色表示下調(diào)基因,黃色表示對(duì)應(yīng)的基因中既有上調(diào)也有下調(diào)。下同。圖3 水楊酸代謝途徑Red color on the KEGG pathway map indicates up-regulated genes,green color indicates down-regulated genes,and yellow color indicates both up and down regulation in the corresponding genes.The same as below.Fig.3 Metabolic pathwaies of the alicylic acid

同時(shí),在木質(zhì)素合成途徑(圖4)中,由酪氨酸和苯丙氨酸經(jīng)過一系酶催化生成對(duì)香豆醇、松柏醇、芥子醇3種木質(zhì)素的單體。苯丙氨酸解氨酶作為苯丙氨酸代謝的第一步,將苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶作用下轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。其中,s26與s41相比,差異基因在第一步反應(yīng)均表現(xiàn)為下調(diào),表明s41差異基因表達(dá)量更高;s41與s41CK相比,苯丙氨酸解氨酶基因的表達(dá)既有上調(diào)也有下調(diào);s26與s26CK相比,苯丙氨酸解氨酶基因的表達(dá)既有上調(diào)也有下調(diào)。肉桂醇脫氫酶作為合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶,參與形成木質(zhì)素的單體反應(yīng)。s26與s26CK相比,肉桂醇脫氫酶的基因表達(dá)為上調(diào),而s41與s41CK相比及s26與s41相比較肉桂醇脫氫酶基因的表達(dá)均為既有上調(diào)又有下調(diào)。

圖4 木質(zhì)素合成途徑Fig.4 Lignin synthesis pathway

另外,在谷胱甘肽合成途徑(圖5)中,通過L-谷氨酸形成谷胱甘肽,并在多種酶的催化下完成氧化型與還原型之間轉(zhuǎn)化。其中,谷氨酰半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽合成酶的基因表達(dá)均無變化。在還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化之中,s41材料谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶基因表達(dá)量上調(diào);s26材料在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸葡萄糖-1-脫氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶基因表達(dá)量上調(diào);s26與s41 相比,6-磷酸葡萄糖-1-脫氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶基因表達(dá)量上調(diào),谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因下調(diào)。

圖5 谷胱甘肽合成途徑Fig.5 Glutathione synthesis pathway

2.3 接種列當(dāng)對(duì)向日葵根系生理指標(biāo)的影響

高抗和高感向日葵材料根系生理指標(biāo)在接種列當(dāng)條件下均不同程度地高于相應(yīng)對(duì)照(圖6)。

其中,s41根系谷胱甘肽含量、苯丙氨酸解氨酶活性、水楊酸含量和總酚含量較s41CK分別顯著提高37.00%、118.01%、96.36%和5.82%;s26根系谷胱甘肽含量、水楊酸含量以及苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、抗壞血酸過氧化物氧酶活性相較于s26CK分別顯著提高45.50%、108.33%、17.61%、9.60%和10.49%;s26根系的谷胱甘肽含量及苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、抗壞血酸過氧化物氧酶活性比s41分別顯著提高99.06%、99.35%、52.76%和17.89%,而s41根系水楊酸含量卻較s26顯著提高52.76%。以上結(jié)果說明,向日葵感、抗材料各生理指標(biāo)在列當(dāng)寄生下均有積極響應(yīng),高感材料雖無法抵御列當(dāng)?shù)募纳?但通過提高水楊酸和谷胱甘肽含量來幫助維持植株體內(nèi)代謝平衡,以減輕列當(dāng)對(duì)向日葵植株的危害;抗性材料通過提高苯丙烷類代謝、增強(qiáng)抗氧化酶活性、增加水楊酸含量來增強(qiáng)對(duì)列當(dāng)?shù)目剐浴?/p>

3 討論

當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí),植物會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)激反應(yīng),最終表現(xiàn)為脅迫抗性和脅迫耐性,這些適應(yīng)和應(yīng)答可以提高植物在逆境下的適應(yīng)性。列當(dāng)是向日葵生長(zhǎng)和生產(chǎn)的主要限制因素之一[19]。由于列當(dāng)?shù)那秩緦?dǎo)致嚴(yán)重的氧化損傷和產(chǎn)量損失,向日葵會(huì)發(fā)生許多生理和生化響應(yīng)[6]。為了應(yīng)對(duì)列當(dāng)?shù)募纳?寄主植物實(shí)施了各種策略,包括利用抗氧化劑、誘導(dǎo)細(xì)胞壁強(qiáng)化、產(chǎn)生茉莉酸(JA)或水楊酸(SA),以對(duì)抗侵染或殺死列當(dāng)[20-21]。

苯丙烷代謝是植物次級(jí)代謝中的重要途徑,苯丙氨酸解氨酶(PAL)作為苯丙烷代謝途徑中的第一種酶,在苯丙烷代謝中占據(jù)著重要的地位,其產(chǎn)物是多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的直接或間接前體,中間產(chǎn)物經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化生成如類黃酮、木質(zhì)素、生物堿等次生代謝產(chǎn)物,這些次級(jí)產(chǎn)物對(duì)植物響應(yīng)脅迫、抗逆防御、提高抗氧化能力等眾多方面具有非常重要的意義[22]。肉桂醇脫氫酶(CAD)在木質(zhì)素合成過程中具有關(guān)鍵性作用。肉桂醇脫氫酶活力降低,會(huì)引起木質(zhì)素含量的減少[23]。本試驗(yàn)中向日葵列當(dāng)抗性材料根系PAL活性比高感材料低,但活性在接種前后變化幅度很大。通過比較分析感、抗材料代謝通路發(fā)現(xiàn),PAL參與苯丙氨酸代謝中生成反式肉桂酸相關(guān)基因表達(dá),高感材料較高抗材料表現(xiàn)為下調(diào),說明抗性材料PAL 基因表達(dá)量更高,這與抗性材料PAL活性在接種列當(dāng)后大幅提升得到互相驗(yàn)證。在接種列當(dāng)條件下,抗、感向日葵材料CAD 活性均有升高,但高感材料活性升高更顯著,可能是由于高感材料的CAD 基因表達(dá)表現(xiàn)為上調(diào),CAD 基因大量表達(dá)提了高感材料CAD 的活性,高抗材料的CAD基因表達(dá)則是既有上調(diào)又有下調(diào),因此高抗材料相應(yīng)酶活性改變不顯著。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)急劇增加是植物面臨各種逆境脅迫時(shí)的一個(gè)共同表現(xiàn),表明ROS 在植物逆境響應(yīng)中起著十分重要的作用[24]。張默靖等[25]和Li等[26]研究表明,向日葵被列當(dāng)寄生后會(huì)產(chǎn)生大量的ROS,導(dǎo)致膜脂過氧化,細(xì)胞膜損傷?？箟难?谷胱甘肽循環(huán)(ASA-GSH)是植物抗氧化系統(tǒng)中最重要的防御機(jī)制,抗壞血酸過氧化物酶是ASA-GSH 循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶,具有將H2O2轉(zhuǎn)化為水的功能,是保護(hù)植物細(xì)胞免受超氧化物氧化脅迫的重要酶類之一。谷胱甘肽含量和抗壞血酸過氧化物酶活性的增加,可以有效清除向日葵體內(nèi)的大量ROS,防止向日葵細(xì)胞膜損傷,達(dá)到保護(hù)向日葵植株的效果。Yang 等[27]研究表明,ROS清除機(jī)制在感抗材料被寄生后都被激活,但作用不同;與對(duì)照相比,在接種列當(dāng)后,抗氧化酶在向日葵中積累并且它們的活性顯著增加,本研究結(jié)果與之相同。此外,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)被認(rèn)為是抗性向日葵響應(yīng)列當(dāng)寄生的ROS 解毒機(jī)制[28],在本研究的谷胱甘肽代謝通路中,向日葵列當(dāng)抗性材料轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量更高,表明抗性材料調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS代謝平衡的能力更強(qiáng)。酚類物質(zhì)是植物中最重要、分布和研究最廣泛的次生代謝物質(zhì),可參與植物生殖發(fā)育,提高抗逆性,且總酚含量增加有助于保護(hù)植物免受氧化損傷[29]。張桂偉等[30]發(fā)現(xiàn)總酚、總黃酮含量與葡萄柚抗氧化能力呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。本研究中向日葵抗性材料總酚含量的變化呈顯著性水平,由此可知,向日葵列當(dāng)抗性材料可能具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

水楊酸(SA)是植物的內(nèi)源性信號(hào)分子,與植物的多種抗性有關(guān)。在擬南芥中,NPR1介導(dǎo)了SA誘導(dǎo)的發(fā)病相關(guān)基因(PRs)和系統(tǒng)獲得性抗性的表達(dá)。NPR1是SA 信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子,NPR1、NPR3和NPR4在SA 介導(dǎo)的植物抗病性中起關(guān)鍵作用[31]。本研究中向日葵列當(dāng)抗、感材料水楊酸含量在接種后均上升顯著;在水楊酸代謝通路中,抗、感材料相較于各自對(duì)照,NPR1表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào),而在病程相關(guān)蛋白的基因表達(dá)上抗性材料高于高感材料,表明抗性材料通過提高調(diào)控蛋白、病程相關(guān)蛋白的基因表達(dá),進(jìn)而提高向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)目剐?。此?Saidi等[32]研究表明,SA 可以直接作為一種抗氧化劑來清除ROS或通過激活抗氧化反應(yīng)間接調(diào)節(jié)氧化還原平衡。

4 結(jié)論

列當(dāng)寄生對(duì)向日葵根系形態(tài)有明顯的破壞作用,從而對(duì)其正常生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響;差異表達(dá)基因富集分析發(fā)現(xiàn),向日葵差異表達(dá)基因數(shù)量位列前10的小類別基本一致,主要包括細(xì)胞過程、結(jié)合、細(xì)胞器、代謝過程、催化活性、膜等,表明列當(dāng)寄生下的向日葵差異表達(dá)基因主要涉及這些方面。進(jìn)一步分析其代謝通路發(fā)現(xiàn),接種列當(dāng)后向日葵根系通過苯丙氨酸代謝途徑生成水楊酸,影響了NPR1蛋白相關(guān)基因、TGA家族相關(guān)基因和病程相關(guān)蛋白PR-1基因的表達(dá),從而表現(xiàn)出植物的抗病性,同時(shí)也使向日葵根系木質(zhì)素合成途徑和谷胱甘肽合成途徑受到影響。分析根系生理指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn),在列當(dāng)寄生下高抗和高感向日葵材料的谷胱甘肽含量、苯丙氨酸解氨酶活性、水楊酸含量以及總酚含量均表現(xiàn)出不同程度增加,表明這些生理指標(biāo)在提高向日葵對(duì)列當(dāng)抗性方面有一定的積極作用。