程志鵬,汪仲毅,匡健華,趙晗茜,陳龍清,胡慧貞

(西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心,昆明 650224)

生長素是最重要的信號分子之一,不僅在植物生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[1],還能調(diào)節(jié)植物對不同生物和非生物脅迫做出反應(yīng)[2],而生長素的調(diào)控功能主要取決于生長素極性運輸建立起的時空不對稱分布[3]。生長素的極性運輸是由生長素轉(zhuǎn)運載體介導(dǎo)的,包括輸入載體AUX/LAX(Auxin 1/like AUX 1)、輸出載體PIN(PIN-formed)和兼具輸入輸出功能載體ABCB/PGP(ATP binding cassette B subfamily/P-glycoprotein)[4]。其中,PIN家族蛋白在生長素定向極性運輸和局部生長素梯度的形成中起著關(guān)鍵作用[5]。PIN 家族蛋白包含保守的N 端和C端跨膜結(jié)構(gòu)域和可變的中央親水環(huán),可分為具有長中央親水環(huán)的經(jīng)典型PIN 蛋白和具有短親水環(huán)的非經(jīng)典型PIN 蛋白[6-7]。

PIN 家族成員在胚胎發(fā)育、根系生長、維管束分化、向光性、向重力性等植物發(fā)育過程的各個方面起著至關(guān)重要的作用[8]。在擬南芥中,At PIN1調(diào)節(jié)莖尖分生組織、根伸長和木質(zhì)部的發(fā)育[9];At PIN2影響根系向重力性[10];At PIN3、4、7參與側(cè)根生長和根系重力響應(yīng)[11-13];At PIN5介導(dǎo)生長素從細(xì)胞質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運并調(diào)節(jié)生長素穩(wěn)態(tài)和代謝[14];At PIN6調(diào)節(jié)側(cè)根形成[7];At PIN8介導(dǎo)生長素從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)[15]。玉米中At PIN1的直系同源基因Zm PIN1a和Zm PIN1b調(diào)控胚乳和胚胎發(fā)育[16],水稻中OsPIN1b在不定根的形成和分蘗中起重要作用[17],在苔蘚植物地錢中,Mp PIN1調(diào)控分生組織的再生、芽向光性和根的向重力性[18]。此外,PIN 也響應(yīng)生物和非生物脅迫。在大豆中,15個Gm PIN基因響應(yīng)干旱脅迫[19];在小麥中,多個Ta PIN基因在生物脅迫(真葉蟲和白粉病)和非生物脅迫下(干旱和高溫)被顯著誘導(dǎo)[20];在甜瓜中,Cm PIN13和Cm PIN18參與了對高溫脅迫的調(diào)控[21];在水稻中,過表達OsPIN3可提高植株的耐旱性[22],且OsPIN9基因可通過調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)植株的耐寒性[23];在擬南芥中,At PIN2可以在鐵脅迫下的早期階段保護其側(cè)根的形成[24]。

荷花(Nelunmbo nucifera)是中國十大傳統(tǒng)名花中唯一的多年生水生花卉,兼具觀賞、食用、藥用和生態(tài)價值,在園林景觀、家庭園藝、環(huán)境改善和生態(tài)治理等方面?zhèn)涫芮嗖A[25]。但荷花在生長過程中會遭受各種脅迫,例如春季倒春寒、秋季低溫、持續(xù)性水淹、水體污染等,這些非生物逆境直接影響其生長發(fā)育及觀賞價值,制約荷花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[25-27]。目前,荷花Nn PIN基因家族成員尚未確定,其在荷花非生物脅迫中的潛在作用尚不清楚。該研究從荷花基因組鑒定了Nn PIN基因家族成員,并通過生物信息學(xué)方法分析了Nn PIN基因的理化性質(zhì)、進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件等,同時還探究了該基因家族成員在脫落酸(ABA)、低溫、水淹脅迫下的表達特性,旨在為深入研究荷花Nn PIN基因家族響應(yīng)逆境脅迫提供理論基礎(chǔ),也為抗逆新品種的選育提供新的基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料和處理

以西南林業(yè)大學(xué)國家荷花種質(zhì)資源庫保存的荷花品種‘太空蓮36號’幼苗作為試驗材料。挑選大小一致、健壯飽滿的‘太空蓮36號’蓮子在破殼后浸泡于純水中,每天換水1～2次,并于25～30℃的全光下浸泡約15 d直至第1枚錢葉(浮葉)完全展開,挑選生長良好、整齊一致的幼苗用于后續(xù)實驗。激素處理:將‘太空蓮36號’幼苗置于3 mmol/L的脫落酸(ABA)溶液中,水位約5 cm,使浮葉完全浮于水面;水淹處理:將‘太空蓮36號’幼苗置于水淹水位約40 cm 的純水中,將浮葉完全淹沒;低溫處理:將‘太空蓮36號’幼苗置于4℃低溫培養(yǎng)箱(光照/黑暗為16/8 h)中,水位約5 cm,使浮葉完全浮于水面。并用在25～30℃的全光照條件下正常水位(水位3～5 cm)、正常生長的幼苗作為對照(CK)。每個處理設(shè)3個重復(fù),在處理6 h后分別取其葉柄(第1枚浮葉基部以下3～5 cm)用液氮冷凍,并置于-80℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 荷花PIN基因鑒定

從荷花基因組中(http://nelumbo.biocloud.net/nelumbo/download/download)下 載genome、GFF、protein等文件,從TAIR 數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)下載AtPIN 蛋白序列,并從水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(https://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)下載OsPIN 蛋白序列。以AtPIN(At-PIN1～8)和OsPIN(OsPIN1a～d、OstPIN2、OstPIN5a～c、OstPIN8、OstPIN9、OstPIN10a～b)作為種子序列,利用TBtools的雙向Blast初步篩選荷花PIN 蛋白。從Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載隱馬爾可夫模型(HMM)配置文件Pfam 03547,將初步篩選出的荷花PIN 蛋白以PF03547模型(膜轉(zhuǎn)運蛋白)進行驗證,手動去除結(jié)構(gòu)域不完整的序列,剩余的序列即為荷花PIN家族成員。

1.2.2 荷花PIN 蛋白的生物信息學(xué)分析

NnPIN蛋白的分子量、等電點(pI)、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂溶性指數(shù)和總平均疏水指數(shù)從ExPASy Prot-Param(https://web.expasy.org/protparam)程序獲得,利用TMHMM 2.0(https://services.healthech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量。分別使用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)、Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)、CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和Loc Tree3(https://rostlab.org/services/loctree3/)進行亞細(xì)胞定位。利用DNAMAN軟件完成荷花、擬南芥的PIN 蛋白序列多重比對,并用Clustalx和MEGA7.0 構(gòu)建擬南芥、水稻和荷花的PIN蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹,進化樹采用鄰接法(neighborjoining,NJ)構(gòu)建,自展值設(shè)為1 000,缺口設(shè)為“Complete deletion”。使用TBtools中Gene structure view和Gene Location功能獲得荷花PIN基因家族結(jié)構(gòu)圖及染色體定位。利用MEME工具(https://memesuite.org/meme/tools/meme)分析蛋白質(zhì)保守基序(motif),motif設(shè)置為12個,其余參數(shù)為默認(rèn)條件,并通過TBtools進行可視化。使用TBtools中One Step MCScanX功能將NnPIN基因家族的基因復(fù)制可視化;并通過其Dual systeny Plot for MC scan X功能分別將荷花與擬南芥及水稻PIN基因家族的共線性可視化。NnPIN基因上游2 000 bp序列的順式作用元件通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)獲得,并使用TBtools進行繪制。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR分析

分別取低溫(4℃)、水淹和3 mmol/L 的脫落酸(ABA)溶液處理6 h后的‘太空蓮36號’葉柄約200 mg,使用艾德萊生物公司的ESAYspain 植物RNA 快速提取試劑盒(貨號:RN09)按照其說明提取總RNA。將1μg 純化后的總RNA 用All-In-One 5×RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,cDNA 置于-20℃保存。q RT-PCR 分析引物在NCBI引物預(yù)測網(wǎng)站上設(shè)計,使用Nn ACT(基因登錄號:XM_010267616.1)作為內(nèi)參基因。Nn PIN和Nn ACT引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 實時熒光定量引物序列Table 1 Primers used in qRT-PCR

qRT-PCR 通過Reche Light Cycler 480實時熒光定量PCR 系統(tǒng)和Blas TaqTM2X qPCR Masteer-Mix 試劑盒進行測定。反應(yīng)體系及程序參照Blas TaqTM2X qPCR Masteer Mix試劑盒操作說明書,qRT-PCR分析至少重復(fù)3次,該家族在不同處理下的相對基因表達值用方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花PIN 基因家族的篩選及蛋白理化性質(zhì)分析

用來自擬南芥和水稻的PIN 蛋白質(zhì)序列作為BLAST 查詢搜索荷花基因組數(shù)據(jù)庫,并以隱馬爾可夫模型文件(Pfam 03547)用于識別NnPIN 蛋白,共鑒定出12個Nn PIN基因,根據(jù)它們在荷花染色體上的位置對Nn PIN進行命名(表2)。對鑒定到的12個荷花NnPIN 蛋白家族成員進行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),12個NnPIN 蛋白家族基因編碼357～644個氨基酸,NnPIN 蛋白分子量為38.96～69.52 k D,等電點介于8.02～9.40間,為堿性氨基酸。12個NnPIN 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)在25.45～43.36 之間,其中3 個成員(NnPIN2、Nn PIN11、NnPIN12)為不穩(wěn)定蛋白,其余9個為穩(wěn)定蛋白。

表2 荷花NnPIN 基因家族信息及編碼蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of proteins encoded by the Nn PIN gene family in N.nucifera

Nn PIN 蛋白的總平均疏水指數(shù)均為正值,表明為疏水蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示,NnPIN 蛋白具有8～9個跨膜結(jié)構(gòu)域,并主要定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其中,NnPIN2、NnPIN3 和NnPIN7定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其余9個NnPIN 均定位在細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2 荷花PIN 基因家族的染色體定位

為明確Nn PIN基因在染色體上的位置,使用TBtools對其進行染色體定位(圖1)分析,發(fā)現(xiàn)Nn PIN基因不均勻分布在6條荷花染色體上,而在5號和6號染色體上則無Nn PIN基因分布。

chr.染色體;Nn PIN.荷花PIN 基因。圖1 荷花NnPIN 家族基因的染色體定位chr,chromosome.Nn PIN,PIN gene in Nelunmbo nucifera.Fig.1 Chromosomal mapping of the Nn PIN gene family in N.nucifera

其中Nn PIN1～3分布在1 號染色體上,Nn PIN7～9分布在4 號染色體上,Nn PIN4和Nn PIN5分布在3 號染色體上,Nn PIN11和Nn PIN12分布在12 號染色體上,而Nn PIN4和Nn PIN10分別定位于2 號和7 號染色體上,未發(fā)現(xiàn)明顯的可識別的基因簇。

2.3 荷花PIN 家族的多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步了解NnPIN 的序列特征,對荷花和擬南芥2個物種進行PIN 蛋白序列多重比對(圖2)。結(jié)果顯示PIN 蛋白的N 端和C 端區(qū)域在荷花和擬南芥中高度保守,NnPIN2、NnPIN3、NnPIN7 與AtPIN5、AtPIN8有短中央親水環(huán),其他NnPIN 和AtPIN 則具長中央親水環(huán)。

At.擬南芥;Nn.荷花。圖2 荷花NnPIN 和擬南芥AtPIN 蛋白的氨基酸多序列比對At,Arabidopsis thaliana.Nn,Nelunmbo nucifera.Fig.2 Multiple sequence alignment of amino acids of NnPIN and AtPIN proteins

此外,還在C 端發(fā)現(xiàn)1 個保守的“NPNTY”結(jié)構(gòu)基序。為了更好地了解荷花與其他代表性物種PIN 基因家族之間的進化關(guān)系,利用擬南芥、水稻共32 個PIN 蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

At.擬南芥;Os.水稻;Nn.荷花。進化樹分支中的數(shù)值為Bootstrap值,用來檢驗計算的進化樹分支可信度。圖3 荷花、擬南芥和水稻PIN 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹At,Arabidopsis thaliana.Os,Oryza sativa.Nn,Nelunmbo nucifera.The numerical value in the evolutionary tree branch is the Bootstrap value,which is used to verify the credibility of the evolutionary tree branch.Fig.3 Phylogenetic tree of the PIN proteins in N.nucifera,A.thaliana and O.sativa

結(jié)果表明,PIN 蛋白家族可分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型2種類型,荷花NnPIN 蛋白在2種類型中均有分布。在經(jīng)典型中NnPIN 成員分布最多,有9 個NnPIN 成員(NnPIN6、NnPIN9、NnPIN4、NnPIN10、NnPIN5、NnPIN8、NnPIN11、NnPIN12、NnPIN1),而在非經(jīng)典型中有則3 個Nn PIN 成員(NnPIN7、NnPIN2、NnPIN3)。

2.4 荷花PIN 家族的保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

為進一步探索荷花NnPIN 蛋白中的保守結(jié)構(gòu),使用MEME 基序搜索工具進行了保守基序的識別。如圖4所示,在NnPIN 蛋白家族中鑒定出12個保守基序,N 端的保守結(jié)構(gòu)域由motif 1、motif 3、motif 10、motif 11組成,而motif 2、motif 4、motif 5、motif 7則組成了C 端的保守結(jié)構(gòu)域,且這8 個motif 在12個荷花NnPINs中均有分布。其中,中央親水環(huán)由motif 6、motif 8、motif 9、motif 12 構(gòu)成,且這4個motif在NnPIN 的2種類型中具顯著差異:在經(jīng)典型中,除NnPIN1外,均具有motif 6、motif 8、motif 9、motif 12;而在非經(jīng)典型中,除NnPIN2外,均無這4個motif,預(yù)示著不同類型的NnPIN 蛋白在植物生長發(fā)育中具有不同的功能。

圖4 荷花NnPIN家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Conserved motifs and genetic structures of the NnPIN family in N.nucifera

基因結(jié)構(gòu)分析(圖4)表明,12個Nn PIN基因包含5～7個外顯子,并在各個小分支內(nèi)具有相似的外顯子數(shù)量和基因長度,而在兩大類型中則存在顯著分化。其中經(jīng)典型Nn PIN(除Nn PIN1和Nn PIN5外)中均具有6 個外顯子,而非經(jīng)典型Nn PIN中各成員的外顯子數(shù)目和基因長度都具有顯著差異,從而預(yù)測兩大類型的Nn PIN基因之間以及非經(jīng)典型Nn PIN基因內(nèi)部可能存在功能上的分化。

2.5 荷花PIN 基因家族的組內(nèi)與種間共線性分析

為了明確荷花Nn PIN基因的進化關(guān)系,對其進行了基因組內(nèi)及其與擬南芥、水稻基因組間的共線性分析。荷花基因組內(nèi)共線性分析(圖5)表明,Nn PIN基因家族在chr3及chr4上共鑒定出2個共線性基因?qū)?Nn PIN6/Nn PIN9和Nn PIN5/Nn PIN8),且這2個基因?qū)υ谶M化關(guān)系上共屬同一分支,預(yù)示著荷花Nn PIN基因可能存在基因復(fù)制事件。

chr.染色體;Nn PIN.荷花PIN 基因。紅線表示Nn PIN 基因的組內(nèi)及種間共線性基因?qū)?。圖5 Nn PIN 家族的基因復(fù)制(A)和種間共線性分析(B)chr,chromosome.NnPIN,PIN gene in N.nucifera.The red line represents the genomic and interspecific collinearity gene pairs of NnPIN.Fig.5 Gene duplication(A)and interspecies collinearity analysis(B)of the Nn PIN family in N.nucifera

種間共線性分析發(fā)現(xiàn),荷花同擬南芥具有8個共線性基因?qū)?Nn PIN1、Nn PIN6、Nn PIN7、Nn PIN8、Nn PIN9分別同At PIN6、At PIN1、At-PIN8、At PIN4、At PIN2具有共線性關(guān)系,而Nn PIN5又分別與At PIN3、At PIN4、At PIN7具有同源性;但并未發(fā)現(xiàn)荷花同水稻OsPIN存在共線關(guān)系,這也進一步表明Nn PIN和At PIN的親緣關(guān)系更為密切,在基因功能上可能與雙子葉植物更相似。

2.6 荷花PIN 基因家族啟動子元件分析

為了更好地預(yù)測Nn PIN的生物學(xué)功能,使用PlantCare對起始密碼子(ATG)上游2 000 bp的部分進行順式作用元件檢測。結(jié)果(圖6)表明,NnPIN基因主要包含光、激素、非生物脅迫和生長發(fā)育相關(guān)響應(yīng)元件。其中,激素反應(yīng)元件包括脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)和生長素相關(guān)元件,非生物脅迫元件主要包括缺氧調(diào)節(jié)、低溫、防御和應(yīng)激反應(yīng)及干旱等元件。每個NnPIN基因的順式作用元件數(shù)量從12個(NnPIN2)～31個(NnPIN4)不等。其中在激素響應(yīng)和非生物脅迫元件中,ABA 和缺氧響應(yīng)元件最多,且12個Nn PIN基因的啟動子均具有脫落酸和缺氧響應(yīng)元件;并且多數(shù)NnPIN成員中都具有低溫、防御及脅迫和生長素等相關(guān)響應(yīng)元件,預(yù)示著NnPIN基因可能介導(dǎo)著荷花對缺氧和低溫等多種非生物逆境的抗性。

圖6 荷花Nn PIN 基因家族的順式作用元件分析Fig.6 Analysis of cis-acting elements of the NnPIN genes in N.nucifera

2.7 荷花PIN 基因在多種非生物脅迫下的表達模式

2.7.1NnPIN基因正向響應(yīng)低溫脅迫

為了探究NnPIN基因是否會響應(yīng)低溫,對荷花幼苗進行了低溫(4℃)處理,并分析了其表達模式(圖7)。與對照(CK)相比,在低溫處理6 h 后,Nn PIN1～12基因(除NnPIN8外)的表達量均顯著上升,其中NnPIN11對低溫響應(yīng)最為顯著,提高了近9倍;而NnPIN1、NnPIN2、NnPIN3、NnPIN5、Nn PIN6、Nn PIN7和Nn PIN10基因的表達量也顯著提高了5倍以上,說明NnPIN基因可正向響應(yīng)低溫脅迫,推測其在抗寒機制中具有正向調(diào)控作用。

**表示基因的表達量在處理與對照間存在顯著差異(P<0.01)。下同。圖7 荷花NnPIN 基因在低溫(4℃)處理6 h后的表達模式**indicates significant difference in gene expression between treatment and control(P<0.01).The same as below.Fig.7 Expression patterns of the Nn PIN genes under low temperature(4℃)for 6 hours

2.7.2NnPIN基因特異性響應(yīng)水淹脅迫

為了探究Nn PIN基因如何響應(yīng)厭氧脅迫,對荷花幼苗進行了水淹處理,并通過qRT-PCR 分析Nn PIN基因在該處理6 h后的表達量模式。結(jié)果(圖8)表明,不同Nn PIN基因在水淹處理下具有不同的表達模式,其中Nn PIN6和NnPIN7的基因表達量顯著上調(diào),而NnPIN1、NnPIN2、NnPIN3、NnPIN4、NnPIN5、NnPIN8、NnPIN9和NnPIN12基因表達量則顯著下調(diào),Nn PIN10和Nn PIN11基因表達量則沒有發(fā)生顯著變化,推測Nn PIN基因在響應(yīng)厭氧脅迫中出現(xiàn)了功能分化。

圖8 荷花Nn PIN 基因在水淹脅迫處理6 h后的表達模式Fig.8 Expression patterns of the Nn PIN genes under flooding stress for 6 hours

2.7.3NnPIN基因正向響應(yīng)外源ABA 處理

對荷花幼苗進行了外源3 mmol/L ABA 處理,并檢測了Nn PIN基因家族各成員在該處理6 h后的表達模式。

結(jié)果(圖9)表明,在經(jīng)外源ABA 處理6 h后,Nn PIN基因與低溫處理有類似的表達模式,即與對照相比,NnPIN基因(NnPIN8除外)的表達量均呈顯著上升趨勢,其中NnPIN1、NnPIN2、NnPIN3、NnPIN4、NnPIN7、NnPIN10、NnPIN11、NnPIN12基因表達量都顯著提高30 倍以上,而Nn PIN5、Nn PIN6、Nn PIN9基因表達量也都顯著提高近20倍,推測Nn PIN基因正向響應(yīng)ABA 脅迫。

圖9 荷花Nn PIN 基因在外源3 mmol/L ABA處理6 h后的表達模式Fig.9 Expression patterns of the NnPIN genes under exogenous 3 mmol/L ABA treatment for 6 hours

3 討論

研究從荷花基因組中鑒定出12個Nn PIN基因,與擬南芥[27-28](8 個)、水稻[29](12 個)、玉米[30](14個)及番茄[31](10個)等多種植物大體相當(dāng)。理化性質(zhì)分析表明:NnPIN 蛋白均為堿性氨基酸,有8～9個跨膜結(jié)構(gòu)域,而且各成員均含有保守結(jié)構(gòu)域Men_Trans(PF03547),與小麥[20]、棉花[32]、葡萄[33]中PIN蛋白的研究結(jié)果一致。有研究表明“NPNTY”結(jié)構(gòu)基序與PIN 蛋白的轉(zhuǎn)運有關(guān),其對于胞吞過程中膜蛋白和受體蛋白之間的相互作用非常重要[33],多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有NnPIN 在C 端都包含“NPNTY”基序,這表明其在荷花中也可能發(fā)揮相類似的功能。通過進化樹分析,可將這12個NnPIN蛋白分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型,多數(shù)NnPIN 與At-PIN 聚在一起,預(yù)示著NnPIN 與AtPIN 的親緣關(guān)系更為密切,也表明了荷花這一古老的雙子葉植物保留了更多雙子葉植物屬性。Gou等[33]發(fā)現(xiàn)葡萄中Vv PIN基因與擬南芥有7對同源基因,與水稻卻只有1對,本研究也發(fā)現(xiàn)荷花同擬南芥具有8對同源基因,但并未在水稻中發(fā)現(xiàn)NnPIN的同源基因,進一步預(yù)示Nn PIN在雙子葉植物的進化過程中更為保守。

PIN 家族蛋白可根據(jù)中央親水環(huán)的長短分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型,在擬南芥中,經(jīng)典型PIN 蛋白(AtPIN1、2、3、4和7)定位于質(zhì)膜(plasma membrane,PM);非經(jīng)典型PIN 蛋白(At PIN5和8)則位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)[6-7]。本研究也發(fā)現(xiàn),經(jīng)典型Nn PIN 蛋白具長中央親水環(huán)(motif 6、motif 8、motif 9和motif 12),定位于細(xì)胞質(zhì)膜;而非經(jīng)典型NnPIN 蛋白則具短親水環(huán),定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),表明2種類型的NnPIN 存在結(jié)構(gòu)和功能上的分化。此外,本研究預(yù)測NnPIN6和NnPIN7蛋白可能定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。多序列比對及進化樹分析發(fā)現(xiàn)荷花NnPIN6與擬南芥At PIN1蛋白的相似度最高,基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)荷花NnPIN6具有經(jīng)典型PIN 特征,且亞細(xì)胞定位預(yù)測工具 Wo LF PSORT、Cell-PLoc和CELLO 都預(yù)測到其定位于質(zhì)膜上,故推測NnPIN6也可能定位在質(zhì)膜上。而荷花NnPIN7與擬南芥AtPIN8的相似度最高且其也符合非經(jīng)典型PIN 特征,但Wo LF PSORT 顯示其可能定位于質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,Loc Tree3、CELLO、Cell-PLoc分別顯示其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)上,所以結(jié)合非經(jīng)典型PIN 特征及其與擬南芥AtPIN8進化關(guān)系,推測NnPIN7定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的可能性更大,但也不排除有定位于質(zhì)膜等其他部位的可能。

分析基因啟動子序列的順式作用元件,對于深入挖掘基因潛在功能具有重要意義。目前在不同植物中已經(jīng)鑒定出多種順式作用元件,它們調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平,影響植物的生長發(fā)育、脅迫抗性等[34]。本研究通過對荷花Nn PIN基因啟動子區(qū)順式元件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件占有重要比重,且12個Nn PIN基因的啟動子均具有脫落酸響應(yīng)和缺氧誘導(dǎo)元件,qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)Nn PIN基因確實可對脫落酸(除Nn PIN8外)和水淹脅迫(除Nn PIN10和Nn PIN11外)做出響應(yīng),表明啟動子順式作用元件預(yù)測結(jié)果基本可靠。尤其是Nn PIN6和Nn PIN7基因的啟動子還包含大量非生物脅迫及分生組織表達等元件,推測水淹脅迫中植物的抗逆和生長會發(fā)生相應(yīng)的變化,因此需要更多相關(guān)的作用元件,這也預(yù)示著Nn PIN6和Nn PIN7基因在響應(yīng)水淹脅迫中有更重要的作用,其作用機理值得進一步研究。

荷花作為多年生挺水植物,其在生長發(fā)育過程中主要面臨低溫、水淹等諸多逆境,而環(huán)境脅迫會促使生長素轉(zhuǎn)運蛋白基因做出響應(yīng)以改變生長素的分布和穩(wěn)態(tài)[35]。在高粱[19]、玉米[36]和大豆[37]中的絕大多數(shù)PIN基因成員對非生物脅迫處理有反應(yīng)。一些研究表明PIN 蛋白與冷應(yīng)激之間存在關(guān)系,冷應(yīng)激會影響生長素轉(zhuǎn)運載體對生長素的轉(zhuǎn)運[38]。王灝等發(fā)現(xiàn)在低溫(0℃)會誘導(dǎo)Dc PIN1a表達上調(diào),會抑制Dc PIN9a和Dc PIN9d的表達[39];而Gou等卻發(fā)現(xiàn)在4℃低溫處理下,葡萄根部Vv PIN1、Vv PIN2、Vv PIN3、Vv PIN4、Vv PIN6、Vv PIN8、Vv PIN10、Vv PIN11和Vv PIN12基 因顯著上調(diào)[33]。在本研究中也得到了與Gou 等相似的結(jié)果,幾乎所有Nn PIN基因(除Nn PIN8外)的表達水平在4℃低溫處理下均顯著提高(圖7),表明Nn PIN基因可以響應(yīng)低溫,預(yù)示Nn PIN基因在增強荷花的冷脅迫耐受性方面發(fā)揮著重要作用。水位自始自終都是影響荷花生長發(fā)育過程的重要因素,其在蓮子萌發(fā)、浮葉開展、立葉及花蕾出水等都扮演著重要的角色,而過高水位產(chǎn)生的厭氧環(huán)境會嚴(yán)重制約著荷花生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn),水淹處理后荷花幼苗葉柄在短時間內(nèi)會迅速伸長,而Nn PIN6和Nn PIN7基因的表達量則顯著上調(diào),其余多數(shù)Nn PIN基因表達量則顯著下降,推測在水淹脅迫下Nn PIN6和Nn PIN7基因可能對于調(diào)控荷花的生長發(fā)育具有重要作用,然而是何種原因?qū)е翹n PIN基因家族成員在水淹脅迫中呈現(xiàn)功能分化以及Nn PIN基因如何調(diào)控水淹脅迫值得進一步研究和探討。

植物激素參與不同信號通路之間的廣泛串?dāng)_,而PIN基因可對多種生理生化過程及激素信號做出反應(yīng)[40]。ABA 是調(diào)節(jié)植物對各種非生物和生物脅迫反應(yīng)的重要植物激素,在介導(dǎo)植物防御反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。Gou等研究發(fā)現(xiàn)ABA 可誘導(dǎo)葡萄多數(shù)Vv PINs的上調(diào)表達[33],Zhang等也發(fā)現(xiàn)辣椒根中的Ca PIN3、Ca PIN5、Ca PIN8、Ca PIN9、Ca PIN10基因正向響應(yīng)ABA[41]。本研究結(jié)果表明,除Nn PIN8外,Nn PIN1～12基因均受ABA 的正向顯著誘導(dǎo),此結(jié)果與Gou等和Zhang等的研究[33,41]基本一致。越來越多的證據(jù)表明ABA 參與了冷應(yīng)激信號的調(diào)控,在CBF 依賴途徑中發(fā)揮新作用[42]。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)Nn PIN基因在外源ABA 和4℃低溫處理下的表達圖譜基本一致,預(yù)示著荷花Nn PIN基因?qū)Φ蜏睾虯BA 的響應(yīng)存在協(xié)同作用,推測其可能在介導(dǎo)ABA 在荷花抗低溫方面發(fā)揮著調(diào)控作用,外源施加ABA 可能具有提高荷花抗寒性的潛力。

4 結(jié)論

研究通過生物信息學(xué)方法在荷花中共鑒定出12個Nn PIN成員,分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型,主要定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。順式作用元件分析及逆境處理表達圖譜顯示Nn PIN基因特異性響應(yīng)水淹、外源ABA 和低溫等脅迫,特別是Nn PIN6和Nn PIN7基因正調(diào)控水淹脅迫下荷花的生長發(fā)育,但具體調(diào)控機制還有待進一步研究。