湛佳偉,朱紫童,李晨依,溫海洋,賀 帆,賈宏昉

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,鄭州 450002)

磷是植物生長發(fā)育的三大營養(yǎng)元素之一,是細(xì)胞中很多重要的生命物質(zhì)的參與者,如磷脂、蛋白質(zhì)、核苷酸等都離不開磷[1]。相關(guān)研究表明磷缺乏影響煙葉的正常發(fā)育,從而影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。因此,如何提高作物的耐磷能力是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)分子育種的一個(gè)重要研究方向。雖然土壤中含有豐富的磷,但大部分的磷是有機(jī)態(tài)形式存在,只有少部分可溶性無機(jī)磷酸鹽能夠被作物吸收利用[3]。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中需要外加磷肥以滿足作物的生長發(fā)育。有研究表明植物從土壤中吸收的磷主要是依靠磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成[4]。已知的植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可劃分為5個(gè)家族:PHT1家族、PHT2家族、PHT3家族、PHT4家族、PHT5 家族,分別定位于細(xì)胞質(zhì)膜、葉綠體內(nèi)膜、線粒體膜、高爾基體膜和液泡膜上[5-8]。這些不同家族的基因成員在植物生長發(fā)育過程對(duì)磷酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配等發(fā)揮重要作用[9]。目前,關(guān)于PHT1 家族成員的報(bào)道比較多,該基因家族所編碼的蛋白大部分屬于高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要負(fù)責(zé)植株根系從土壤中攝取磷酸鹽[10]。相比之下,雖然PHT2 家族基因在很多植物中也有不少報(bào)道,但研究深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。到目前為止,PHT2家族只挖掘了PH T2;1這1 個(gè)基因成員。PHT2;1基因編碼低親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,該基因在很多植物中被克隆,包括擬南芥At PHT2;1[11]、辣 椒Ca PHT2;1[12]、苜 蓿Mt PH T2;1[13]、小 麥Ta PH T2;1[14]、水 稻Os-PHT2;1[15]、茄子Sm PHT2;1[16]等,并且在這些植物中的研究均表明PHT2;1蛋白定位于葉綠體內(nèi)膜上[11-16]。Ahmad等[12]對(duì)辣椒Ca PHT2;1的表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn),Ca PH T2;1主要在葉片中高表達(dá),在根部幾乎不表達(dá),并且在低磷脅迫下,Ca PH T2;1在葉片和根中的表達(dá)量都很低[12]。史書林[15]在水稻中研究發(fā)現(xiàn),在正常供磷條件下,Os-PH T2;1過表達(dá)使水稻地上部分的磷含量顯著提高,間接提高了水稻根系對(duì)磷的捕獲能力,并且該基因在葉片中強(qiáng)烈表達(dá),在根系中幾乎不表達(dá),低磷脅迫和光照時(shí)長的增加都能使該基因的表達(dá)量顯著升高[15]。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)苜蓿的MtPHT2;1 蛋白定位葉綠體,能夠調(diào)控磷酸鹽進(jìn)入葉綠體,該基因轉(zhuǎn)錄水平受到光照和磷酸鹽濃度的影響,并且在新葉中的表達(dá)量高于其他組織。

煙草(Nicotiana tabacumL.)是中國最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。在煙葉生產(chǎn)中,磷素養(yǎng)分供應(yīng)不足,不僅會(huì)限制煙株的長勢,而且使煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)受到影響。巴西優(yōu)質(zhì)煙葉磷含量為0.20%～0.28%,而中國煙葉磷含量達(dá)到巴西優(yōu)質(zhì)煙葉磷含量的理論概率為59.8%[18]。因此,探究PHT 基因家族在調(diào)控?zé)煵輰?duì)磷酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的機(jī)制,為通過生物技術(shù)改善煙草對(duì)磷酸鹽的吸收和利用能力提供理論依據(jù),從而達(dá)到改善煙葉品質(zhì)的目的。目前對(duì)煙草中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的研究較少,王艷麗等[19]探究了煙草PHT1家族的2個(gè)基因在磷脅迫下的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)PH T1基因主要在葉片中高表達(dá),PHT2基因在根部高表達(dá),并且這2 個(gè)基因受磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量升高。雖然已經(jīng)證實(shí)PH T2;1基因參與植物體內(nèi)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用以及光合作用等過程,但煙草中Nt PH T2;1的功能還未見報(bào)道。因此,該研究以煙草為材料,從普通煙草K326中克隆1個(gè)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員Nt PHT2;1,通過生物信息學(xué)分析、qRT-PCR、亞細(xì)胞定位等技術(shù)探究煙草Nt PH T2;1在磷的吸收和再利用過程中功能是否保守,以期為通過Nt PHT2;1培育煙草磷元素高效利用新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)條件

普通烤煙品種K326為供試材料,煙草種子用霍格蘭營養(yǎng)液水培法,待種子露白后,將其放置于人工氣候溫室中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件是光照16 h/28℃,黑暗8 h/25℃,光強(qiáng)為300μmol/(m2·s),相對(duì)濕度為60%。煙苗幼苗用霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)21 d后,開始對(duì)幼苗進(jìn)行低磷(0.05 mmol/L)處理(LP)、高 鹽(150 mmol/L NaCl)、干 旱(10% 的PEG-6000)、低溫(4℃)等非生物脅迫處理[20],并設(shè)置1個(gè)正常處理(1 mmol/L Pi)作為對(duì)照(CK)。除低溫處理3 h外,其他處理均為7 d。處理結(jié)束后,取各處理長勢一致的3株煙苗,用離子水洗滌后,提取樣品的根、莖、新葉和老葉(新葉為煙苗從上往下數(shù)的第3 葉位,老葉為煙苗從上往下數(shù)的第7 葉位),用來檢測不同處理下煙草Nt PH T2;1的表達(dá)情況。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因克隆

從NCBI網(wǎng)站上查找Nt PH T2;1基因的參考序列(GenBank 序列號(hào):XP_016442645.1),使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)煙草Nt PH T2;1基因CDS序列的特異性擴(kuò)增引物(表1)。使用RNA isolater total RNA extraction reagent試劑盒(南京諾唯贊公司)提取K326的總RNA。使用Universal RT-PCR Kit(M-MLV)試劑盒(北京索萊寶公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),得到K326的cDNA 產(chǎn)物。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃5 min,94℃30 s,50℃45 s,72℃106 s,30個(gè)循環(huán),72℃10 min,16℃30 min。將擴(kuò)增得到的目的基因與pBWA(V)HS 載體連接后,送武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司檢測,得到目的基因的序列信息。

表1 RT-PCR 和定量擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR and quantification amplifications

1.2.2 序列分析方法

用NCBI網(wǎng)站上的ORF finder將目的基因序列翻譯成氨基酸序列,再通過該網(wǎng)站上的CD search功能預(yù)測NtPHT2;1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用TMHMM2.0預(yù)測NtPHT2;1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。用Expasy網(wǎng)站的ProParam 和PRABI網(wǎng)站的SOPM 分析NtPHT2;1蛋白理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。用Net Phos-3.1 預(yù)測NtPHT2;1 蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)。用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)。用MEGA 6.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹,比較煙草NtPHT2;1與其他物種PHT2;1的親緣關(guān)系。

1.2.3 啟動(dòng)子分析

登錄Sol Genomics Network網(wǎng)站,以煙草Nt-PH T2;1的CDS序列作為探針進(jìn)行Blast搜索,得到Nt PHT2;1全長序列,選取Nt PHT2;1基因起始密碼子上游2 500 bp 長度的核苷酸序列,利用PlantCARE網(wǎng)站分析啟動(dòng)子序列中所含的順式元件。

1.2.4 亞細(xì)胞定位

根據(jù)煙草Nt PHT2;1基因序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異引物,經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,將帶有目的基因長度的電泳片段切下進(jìn)行溶膠回收,PCR 產(chǎn)物檢測無誤后與酶切后的p BWA(V)HS-GLosgfp載體進(jìn)行連接反應(yīng);將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài),選取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證,獲得融合載體pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,用注射器吸取經(jīng)驗(yàn)證過的陽性農(nóng)桿菌液注射到K326十字期的葉片中,將轉(zhuǎn)入融合載體的煙苗放置于培養(yǎng)箱(28℃)培養(yǎng)2～3 d。利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的位置,用未插入Nt PH T2;1基因的p BWA(V)HS-Glosgfp空載體作為對(duì)照。

1.2.5 基因表達(dá)分析

使用BalbStart SYBR qPCR Ultra Mix(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測,以煙草組成型表達(dá)基因NtL25(GenBank:L18908.1)作為內(nèi)參基因,試驗(yàn)重復(fù)3次。采用計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,LSD 法進(jìn)行多重比較,用Origin 2021軟件制作基因相對(duì)表達(dá)量柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtPHT2;1 基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

以K326 的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(圖1),得到1條在1 500～2 000 bp之間的PCR 產(chǎn)物。進(jìn)一步對(duì)克隆得到的Nt PH T2;1全長序列進(jìn)行測序分析,顯示該基因的序列全長為1 764 bp,可編碼587個(gè)氨基酸。

M.DL 5000 DNA marker;1.cDNA。圖1 煙草NtPHT2;1 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 The electrophoretic map of PCR amplification of the tobacco N t PHT2;1 gene

2.2 NtPHT2;1 基因的生物學(xué)分析

2.2.1 NtPHT2;1蛋白結(jié)構(gòu)分析

為了了解NtPHT2;1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)序列特征,對(duì)該蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其分子式為C2828H4423N723O800S22,相對(duì)分子質(zhì)量為62 056.91 D,等電點(diǎn)為9.00,不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為26.70,屬于穩(wěn)定蛋白。利用PRABI網(wǎng)站的SOPM 功能分析煙草NtPHT2;1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)發(fā)現(xiàn),其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占38.84%,延長鏈占24.87%,β-轉(zhuǎn)角占8.35%,無規(guī)則卷曲占27.94%。

圖2 煙草NtPHT2;1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Secondary structure analysis of tobacco NtPHT2;1 protein

磷酸化位點(diǎn)預(yù)測如圖3所示,NtPHT2;1蛋白中有17個(gè)蘇氨酸(Thr)、42個(gè)絲氨酸(Ser)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)高出閾值(Threshold),推測這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化。對(duì)煙草NtPHT2;1蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測,表明該蛋白含有1個(gè)PHO4超家族結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖3 煙草NtPHT2;1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.3 Phosphorylation sites prediction of tobacco NtPHT2;1 protein

圖4 煙草NtPHT2;1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domain of tobacco NtPHT2;1 protein

2.2.2 NtPHT2;1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

NtPHT2;1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖5所示,通過縱坐標(biāo)軸的數(shù)值反映氨基酸(橫軸)位于膜內(nèi)外兩側(cè)和跨膜螺旋區(qū)的概率。結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測結(jié)果顯示,NtPHT2;1 蛋白含有11 個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu),在TM8和TM9 之間有1個(gè)中央親水環(huán),將其分隔為2 組,符合PHT2;1 家族蛋白共有的結(jié)構(gòu)特征。

圖5 NtPHT2;1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of NtPHT2;1 protein

2.2.3 NtPHT2;1同源性與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在NCBI上查找煙草、擬南芥、水稻和辣椒等植物PHT 家族成員氨基酸序列,與煙草NtPHT2;1蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(圖6),其中Nt-PHT2;1與NtPHT1;2和NtPHT1;4的同源性分別為9.20%和10.88%;與擬南芥At PHT2;1的同源性達(dá)到68.56%;與水稻OsPHT2;1的同源性達(dá)到66.27%;與同屬茄科作物的辣椒CaPHT2;1的同源性最高達(dá)到91.00%。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)表明,煙草NtPHT2;1與辣椒CaPHT2;1的親緣關(guān)系最為接近,與擬南芥AtPHT1;4和煙草NtPHT1;2的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這與氨基酸序列同源性分析結(jié)果一致。

圖6 煙草NtPHT2;1蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.6 Homology analysis of the amino acid sequence of tobacco NtPHT2;1 protein

2.3 NtPHT2;1 基因啟動(dòng)子分析

在Nt PHT2;1前面截取1段長2 500 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行啟動(dòng)序列分析(圖8),NtPHT2;1啟動(dòng)子含有2個(gè)參與厭氧誘導(dǎo)的順式作用元件(ARE);2個(gè)參與脫落酸反應(yīng)的順式作用元件(ABRE);1個(gè)參與水楊酸反應(yīng)的順式作用元件(TCA-element);1個(gè)參與赤霉素反應(yīng)的順式作用元件(GARE-motif);1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(W-BOX);2個(gè)不同響應(yīng)光信號(hào)的順式作用元件(GT1-motif和I-box);1個(gè)參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeats)。根據(jù)這些順式元件的作用,推測NtPHT2;1與植物衰老、逆境脅迫和光合作用有關(guān)。

ABRE.參與脫落酸反應(yīng)的順式作用元件;W-box.轉(zhuǎn)錄因子WRKY 家族成員的結(jié)合位點(diǎn);GT1-motif.參與響應(yīng)光信號(hào)的順式作用元件;ARE.參與厭氧誘導(dǎo)所必需的順式作用元件;TCA-element.參與水楊酸反應(yīng)的順式作用元件;I-box.參與響應(yīng)光信號(hào)的順式作用元件;GARE-motif.參與赤霉素反應(yīng)的順式作用的原元件;TC-rich repeats.參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件。圖8 NtPHT2;1 基因啟動(dòng)子順式元件分析ABRE,cis-acting element involved in abscisic acid reaction.W-box,binding sites for members of the WRKY family of transcription factors.GT1-motif,cis-acting element involved in responding to optical signals.ARE,cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction.TCA-element,cis-acting element involved in salicylic acid reaction.I-box,cis-acting element involved in responding to optical signals.GARE-motif,cis-acting primitive element involved in gibberellin reaction.TC-rich repeats,cis-acting elements involved in defense and stress response.Fig.8 Cis-element analysis of the promoter of Nt PH T2;1 gene

2.4 NtPHT2;1蛋白亞細(xì)胞定位

利用GV3101 農(nóng)桿菌體將融合表達(dá)載體pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp 轉(zhuǎn)化至煙草表皮細(xì)胞中,在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片熒光信號(hào),結(jié)果如圖9所示,結(jié)合葉綠體熒光蛋白通道與疊加場的結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp質(zhì)粒的熒光存在于葉綠體上,表明Nt-PHT2;1蛋白定位于細(xì)胞的葉綠體上。

圖9 亞細(xì)胞定位結(jié)果分析Fig.9 Subcellular localization analysis

2.5 NtPHT2;1 表達(dá)模式分析

2.5.1 不同磷濃度處理下NtPHT2;1的組織表達(dá)模式分析

Nt PHT2;1在CK 下和LP 下的組織表達(dá)特性如圖10所示,可以看出Nt PHT2;1主要在葉片中表達(dá),且在新葉中的表達(dá)量最高。正常處理下,Nt PH T2;1在新葉中的相對(duì)表達(dá)量與老葉、莖、根相比,分別增加了3.02,49.29,1 289.82倍。在低磷處理下,Nt PHT2;1在莖、新葉和老葉中的相對(duì)表達(dá)量均有所減少但差異不顯著,以上3個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量與正常處理相比分別下降了4.00%、7.62%和6.49%。整體來看,低磷脅迫抑制了Nt-PHT2;1基因的表達(dá)。

不同小寫字母表示在處理間差異顯著,不同大寫字母表示組織間差異顯著(P<0.05)。下同。圖10 低磷脅迫下Nt PHT2;1 的組織表達(dá)模式Different lowercase letters indicate significant differences between treatments,while different capital letters indicate significant differences between tissues(P<0.05).The same as below.Fig.10 Expression of NtPHT2;1 gene in different tissues under low phosphorus stress

2.5.2 不同非生物脅迫下NtPHT2;1相對(duì)表達(dá)水平分析

為了探究Nt PH T2;1在不同非生物脅迫下的基因相對(duì)表達(dá)量,以正常培育處理為對(duì)照,設(shè)置了低溫、鹽脅迫和干旱3個(gè)非生物脅迫處理,通過qRTPCR技術(shù)檢測不同處理下Nt PH T2;1的相對(duì)表達(dá)量(圖11),結(jié)果表明Nt PHT2;1在鹽脅迫和干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,而低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量與正常處理略高于對(duì)照,但不存在顯著性差異,整體來看Nt PH T2;1受鹽脅迫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)減弱。

圖11 不同非生物脅迫下Nt PHT2;1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Relative expression of Nt PHT2;1 gene under different abiotic stresses

3 討論

煙草Nt PHT2;1基因作為煙草中唯一1個(gè)被克隆的PHT2家族成員,其編碼的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由于低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)磷元素的吸收利用能力遠(yuǎn)不如高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因而對(duì)煙草PHT2家族成員的研究遠(yuǎn)不如PHT1家族[22]深入。本文從普通煙草品種K326 中克隆出Nt-PHT2;1基因,對(duì)NtPHT2;1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明該NtPHT2;1蛋白含有587個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)(pI)為9.00,包含11個(gè)跨膜疏水區(qū),在TM8和TM9之間有1個(gè)中央親水環(huán),這與擬南芥AtPHT2;1蛋白和水稻OsPHT2;1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果[11,15]一致。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),煙草NtPHT2;1與辣椒CaPHT2;1同源性最高達(dá)到91.00%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出,NtPHT2;1 與辣椒CaPHT2;1在同一個(gè)分支上,表明兩者親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位顯示,NtPHT2;1蛋白定位于葉綠體上,這與擬南芥、小麥等植物中的研究結(jié)果[11,14]相同。對(duì)煙草NtPHT2;1啟動(dòng)子上的順式元件分析發(fā)現(xiàn),上面含有多個(gè)響應(yīng)激素反應(yīng)、防御和應(yīng)激反應(yīng)、光信號(hào)誘導(dǎo)的順式作用元件,還含有WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(W-BOX)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究表明,WRKY 轉(zhuǎn)錄因子能與WBOX元件相結(jié)合來響應(yīng)植物低磷脅迫過程,并且該轉(zhuǎn)錄因子與植物的逆境應(yīng)答和葉片衰老等生理活動(dòng)密切相關(guān)[23-25]。因此,推測Nt PHT2;1與植物衰老、逆境脅迫和光合作用有關(guān)。

目前關(guān)于PHT2 家族基因的研究結(jié)果表明,PH T2;1基因在不同的植物中具有不同的表達(dá)模式,例如,小麥和水稻中該基因的表達(dá)量在低磷和光照條件下都顯著提高[14-15];苜蓿Mt PH T2;1在葉片中的表達(dá)量受光誘導(dǎo)顯著增加,但低磷脅迫條件下,其表達(dá)量明顯受到抑制[13];擬南芥在低磷脅迫下,At PHT2;1在葉片部位的表達(dá)量無顯著性變化,但在根部的表達(dá)量略有增加[26]。雖然這些研究揭示PHT2;1基因具有不同的表達(dá)模式,但這些研究都表明PH T2;1基因主要在葉片中表達(dá),在根部微弱表達(dá)。對(duì)Nt PHT2;1在煙草不同組織的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn),該基因主要在葉片中表達(dá),尤其是新葉中的相對(duì)表達(dá)量最高,在根部幾乎不表達(dá)。在低磷處理下,Nt PH T2;1在莖、新葉和老葉中的相對(duì)表達(dá)量均有所降低,但差異不顯著,這與擬南芥At-PH T2;1表達(dá)模式[26]相似。結(jié)合Nt PH T2;1的組織表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位結(jié)果,推測NtPHT2;1蛋白可能負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)中的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體內(nèi),進(jìn)而影響葉綠體的合成和葉片的發(fā)育。前面的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),Nt PH T2;1可能與煙草抵抗逆境脅迫有關(guān),但對(duì)Nt PHT2;1在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),該基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,而在低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量略有升高,故推測Nt PH T2;1對(duì)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用可能涉及其他復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程。因此,非生物脅迫下Nt PH T2;1的表達(dá)模式和分子機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

該研究克隆了煙草Nt PH T2;1基因,對(duì)其編碼蛋白NtPHT2;1進(jìn)行生物信息學(xué)分析,證實(shí)該蛋白具有PHT2家族蛋白的共同特征。同時(shí),對(duì)Nt-PHT2;1的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),該基因主要在煙草葉片中表達(dá),在根部幾乎不表達(dá)。在低磷脅迫下,該基因在莖、新葉和老葉中的相對(duì)表達(dá)量均有所降低,但差異不顯著;但在鹽脅迫和干旱脅迫下,該基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。推測Nt PHT2;1主要參與煙草對(duì)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,并在調(diào)控非生物脅迫下煙草對(duì)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在后續(xù)研究中需要?jiǎng)?chuàng)制NtPHT2;1的過表達(dá)和敲除材料,對(duì)其進(jìn)行低磷等非生物脅迫處理,驗(yàn)證各處理對(duì)不同株系的生理指標(biāo)和NtPHT2;1基因表達(dá)模式的影響,來進(jìn)一步揭示NtPHT2;1對(duì)磷酸鹽的調(diào)控機(jī)制,為后續(xù)煙草磷高效利用新品種的培育提供依據(jù)。