余青青 ,單玉爽 ,尚匯鑫 ,曾 川 ,張澤勇*

(1 廳市共建甘薯及特色豆科作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川南充 637000;2 細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;3 重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院,重慶萬(wàn)州 404001)

水稻是全球重要的主糧作物之一,根系通過(guò)對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)和水分吸收以及激素合成直接影響植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量,因此,改良作物根系是提高作物產(chǎn)量的重要手段[1]。水稻根系主要由主根,側(cè)根和不定根組成,與擬南芥相比有很大的差異。此外,水稻根發(fā)育的調(diào)控機(jī)理尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和乙烯等植物激素在根發(fā)育過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用[2-5]。生長(zhǎng)素參與調(diào)控水稻根的發(fā)育,生長(zhǎng)素合成缺失的突變體表現(xiàn)出水稻根發(fā)育缺陷的表型。如COW1隸屬于水稻YUCCA基因家族,調(diào)節(jié)依賴于色氨酸的IAA 生物合成,功能缺失oscow1-1突變體表現(xiàn)出不定根變少的表型[6]。此外,IAA 酰胺合成酶通過(guò)催化氨基酸與IAA 結(jié)合調(diào)節(jié)IAA 平衡,過(guò)表達(dá)OsGH3.2和Os-GH3.8的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出IAA 缺失的表型,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不定根和根毛變少的表型[7-9]。功能獲得性突變體osgh3.13表現(xiàn)出側(cè)根和不定根減少的表型[10]。而過(guò)表達(dá)生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)基因Os-AUX1的轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)促進(jìn)側(cè)根和根毛發(fā)育的表型[11]。OsPIN1和OsPIN2編碼生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)鞍?通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的分布參與調(diào)節(jié)水稻根伸長(zhǎng)和側(cè)根發(fā)育[12-13],進(jìn)一步研究表明,OsPIN1和OsPIN2的表達(dá)分別受OsSPL14和OsSPL3轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[14-16]。生長(zhǎng)素響應(yīng)因子OsARF12和Os-ARF25的缺失會(huì)導(dǎo)致水稻主根變短[17]。進(jìn)一步研究表明,生長(zhǎng)素參與調(diào)控不定根發(fā)育是通過(guò)LOBdomain 轉(zhuǎn)錄因子CROWN ROOTLESS1(CRL1)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,與野生型相比,crl1突變體表現(xiàn)不定根數(shù)目明顯減少的表型[18]。

細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互拮抗共同調(diào)控水稻根的發(fā)育[19]。OsIPT1編碼異戊二烯轉(zhuǎn)移酶,調(diào)控細(xì)胞分裂素的合成,過(guò)表達(dá)OsIPT1基因抑制水稻根的發(fā)育[20],而敲除編碼細(xì)胞分裂素激酶基因LONELY GUY(LOG)的突變體植株表現(xiàn)出根變短,且發(fā)育延遲的表型[21]。相反,過(guò)表達(dá)編碼細(xì)胞分裂素氧化酶的基因OsCKX4的轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出促進(jìn)根生長(zhǎng)且不定根數(shù)目增多的表型[22]。除了細(xì)胞分裂素合成途徑參與調(diào)控水稻根發(fā)育之外,細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑相關(guān)的基因也參與調(diào)控水稻根的發(fā)育,如OsRR4、OsRR5和OsRR2,過(guò)表達(dá)Os-RR4和OsRR5可以促進(jìn)水稻根的伸長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)育[23],而OsRR2則參與調(diào)控水稻不定根的發(fā)育,過(guò)表達(dá)OsRR2的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不定根數(shù)目增加的表型[24]。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素拮抗調(diào)節(jié)水稻根發(fā)育的分子機(jī)理較為復(fù)雜。生長(zhǎng)素途徑和細(xì)胞分裂素途徑調(diào)控根發(fā)育的途徑存在許多結(jié)點(diǎn)基因,如Os-CRL5的表達(dá)能被生長(zhǎng)素誘導(dǎo),而OsCRL5調(diào)節(jié)水稻不定根的發(fā)育又是通過(guò)調(diào)節(jié)OsRR1基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[25],細(xì)胞分裂素途徑的基因OsCK X4能通過(guò)調(diào)節(jié)下游的生長(zhǎng)素響應(yīng)基因ARF25和細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因OsRR2和OsRR3來(lái)調(diào)控水稻不定根的發(fā)育[17]。WUSCHEL相關(guān)的基因也在生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)水稻根發(fā)育過(guò)程中起著重要的樞紐作用:一方面OsWOX11能通過(guò)調(diào)節(jié)OsCKX4的表達(dá)參與水稻不定根的發(fā)育[26];另一方面OsWOX11還能通過(guò)抑制細(xì)胞分裂素OsRR2的表達(dá),調(diào)控水稻不定根中細(xì)胞的增殖[27]。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(growth regulating factor,GRF)是植物體內(nèi)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。At GRF1參與調(diào)控細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目進(jìn)而影響葉片和種子大小[28]。OsGRF6調(diào)節(jié)水稻花,葉夾角,種子和株高的發(fā)育[29-30],OsGRF1調(diào)節(jié)水稻抽穗時(shí)間,OsGRF4參與調(diào)節(jié)水稻種子大小的發(fā)育,而OsGRF7則通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素,吲哚三乙酸代謝和獨(dú)腳金內(nèi)酯進(jìn)而影響水稻的株型和分蘗[31-32]。GRF 類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答方面,At GRF7能直接與DREB2A啟動(dòng)子的S區(qū)結(jié)合,抑制DREB2A的表達(dá),降低植物對(duì)鹽耐受[33]。過(guò)表達(dá)水稻GRF 上游的調(diào)節(jié)基因OsmiR396c降低了水稻對(duì)鹽堿的耐受性[34],而降低OsGRF4的表達(dá)則能提高水稻對(duì)冷的耐受性[35]。此外,osgrf6功能缺失突變體也表現(xiàn)出對(duì)冷耐受的表型[36]。

植物小RNA396家族參與調(diào)控植物根的發(fā)育,作為小RNA396家族的靶基因,GRF家族調(diào)控水稻根發(fā)育方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,因此,研究以O(shè)sGRF6為對(duì)象,通過(guò)對(duì)OsGRF6的亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性、OsGRF6轉(zhuǎn)基因材料和突變體材料的表型和候選靶基因分析,為深入研究OsGRF6參與調(diào)控水稻根發(fā)育提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻材料:試驗(yàn)所用材料為粳稻品種中花11,并以中花11為受體材料,構(gòu)建了OsGRF6的過(guò)表達(dá)株系和基因敲除突變體。菌種:大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)、農(nóng)桿菌感受態(tài)(EH105,GV3101)、酵母菌(Y2 H,Golden)。

載體:基因克隆載體(p EASY-Blunt simple Cloning Vector,TransGen)、過(guò)表達(dá)載體(pCAMBIA1300,Cambia)、亞細(xì)胞定位載體(p BI221-GFP,Cambia)、轉(zhuǎn)錄激活活性載體[GAL4-BD,GAL4(4X)-D1-3(4X)∷GUS,中科院植物研究所種康院士饋贈(zèng)]、基因敲除載體(百格生物)。

試驗(yàn)儀器:PCR 儀、熒光定量PCR(Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System,Bio-Rad)。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

將水稻‘ZH11’置于30℃萌發(fā)3 d后,播種于溫室中,3 周后取材,準(zhǔn)備抽取RNA。參照TRNzol-A+reagent說(shuō)明書提取RNA。參照天根公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix)說(shuō)明書進(jìn)行cDNA 合成,cDNA 可以立即使用或存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OsGRF6 基因的擴(kuò)增及轉(zhuǎn)基因材料獲得

在MSU-RGAP 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)OsGRF6(LOC_Os03g51970)進(jìn) 行BLAST 搜 索,獲 得OsGRF6對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA 序列,根據(jù)序列信息對(duì)該基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物:OsGRF6 F:5′-ATGCAGGGTGCAATG-3′和OsGRF6 R:5′-GGGGTACCCACCAGGCGGATG-3′,以ZH11的cDNA 為模板克隆該基因。克隆體系(25μL):dd H2O 17μL,10×PCR buffer 3μL,d NTP 2μL,引物F/R 1μL,cDNA 1μL,PCR 酶1μL 進(jìn)行,反應(yīng)程序:94℃5 min,94℃10 s,55℃1 min,68℃90 s,35個(gè)循環(huán),68℃5 min,4℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后,將擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳,回收,獲得目的基因片段克隆到p EASY-Blunt simple cloning vector載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單菌落,送測(cè)序,測(cè)序正確后,保存質(zhì)粒供后續(xù)載體構(gòu)建使用。根據(jù)p CAMBIA1300過(guò)表達(dá)載體上的信息,設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和KpnⅠ引物OsGRF6 F:5′-GGATCCATGCAGGGTGCAATG-3′和OsGRF6 R:5′-GGTACCGGGGTACCCACCAGGCGGATG-3′,以含OsGRF6基因的載體p EASY-Blunt simple為模板,按上述方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、菌檢和測(cè)序。將正確的OsGRF6基因序列通過(guò)重組連接到超表達(dá)載體p CAMBIA1300上,提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化‘ZH11’(由百格生物轉(zhuǎn)化),獲得轉(zhuǎn)基因植株。OsGRF6基因敲除突變體購(gòu)于百格生物公司。

1.4 OsGRF6組織表達(dá)模式分析

將水稻‘ZH11’種子用15%次氯酸鈉消毒15 min,用蒸餾水清洗5～6 次后,30℃萌發(fā)2～3 d后,種于液體培養(yǎng)盆中,2周后,取水稻苗不同部位材料按1.2節(jié)所述方法,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA冷藏備用。其他部位水稻植株組織取于大田種植的水稻,提取RNA,獲得cDNA 冷藏備用。以水稻中ubiquitin基因?yàn)閮?nèi)參基因,根據(jù)OsGRF6編碼區(qū)的序列設(shè)計(jì)定量PCR 引物OsGRF6-qPCR F:5′-CGGACGGACGGCAAG-3′和OsGRF6-qPCR R:5′-GGTTCATGTGTCGCTCACAG-3′,Ubi-qPCR F:5′-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3′和Ubi-qPCR R:5′-AACCAGTCCATGAACCCGG-3′。反應(yīng)總體系為15μL:Top Green qPCR Super Mix(2×)8 μL、Prime F/R(2μmol/L)1μL、cDNA 1μL、dd H2O 5μL。反應(yīng)條件為:94℃30 s,94℃5 s,56℃15 s,72℃10 s,循環(huán)40次。利用計(jì)算Os-GRF6基因的相對(duì)表達(dá)量,最后用Origin 7.0作圖。

1.5 OsGRF6的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄激活活性載體信息設(shè)計(jì)含有SmaⅠ和SalⅠ的上下游引物:OsGRF6-BD F:5′-TCCCCCGGGGATGCAGGGTGCAATGGCCA-3′ 和OsGRF6-BD R:5′-GCGTCGACCACCAGGCGGATGC-3′,以O(shè)sGRF6的質(zhì)粒為模板,參照1.2節(jié)所述,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,回收目的片段。將目的片段構(gòu)建到GAL4-BD 上,提取質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒[GAL4(4X)-D1-3(4X)∷GUS],共轉(zhuǎn)擬南芥原生質(zhì)體,弱光培養(yǎng)24 h后,測(cè)定GUS活性。GUS活性測(cè)定:取5μL 裂解產(chǎn)物加到1.5 m L Eppendorf管中,接著加入45μL MUG 底物混勻,37℃恒溫箱中孵育60 min。結(jié)束后,加入950μL,0.2 mol/L Na2CO3溶液停止反應(yīng),用PromegaGlo Max發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定MUG 熒光[37]。

1.6 OsGRF6的亞細(xì)胞定位

以獲得含有OsGRF6的質(zhì)粒為模板,根據(jù)pBI221-GFP的載體預(yù)測(cè)信息設(shè)計(jì)上下游含有XbaⅠ和KpnⅠ的引物OsGRF6-GFP F:5′-TCTAGAATGCAGGGTGCAATGGCCA-3′;GRF6R:5′-GGTACCCACCAGGCGGATGCTCGGAT-3′。參照1.2節(jié),進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?；厥漳康幕蚱?將目的基因片斷克隆到植物表達(dá)載體p BI221GFP中,然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化完成的大腸桿菌液涂布在含有氨芐霉素的平板上生長(zhǎng),接著挑取單菌落,進(jìn)行PCR 檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證,最后提取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的OsGRF6-GFP 質(zhì)粒。將OsGRF6-GFP融合載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體中,弱光下培養(yǎng)24 h,用萊卡激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

1.7 酵母單雜交驗(yàn)證OsGRF6與CGGCA motif結(jié)合

將CAGCA motif構(gòu)建到p Ab Ai載體上,以AD 空+p Ab Ai-motif 和AD-OsGRF6+p Ab Aimotif分別轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞,于加180 ng/m L Ab A 和不加Ab A 的雙缺(-Ura,-Leu)培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)2～3 d后,觀察菌斑生長(zhǎng)情況,并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGRF6 基因克隆、氨基酸序列對(duì)比及進(jìn)化樹(shù)分析

以“ZH11”為模板,對(duì)OsGRF6的CDS 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得大小約1 300 bp 的條帶,構(gòu)建到p EASY-Blunt simple cloning vector載體上進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果顯示,OsGRF6的CDS全長(zhǎng)1 371 bp,編碼456個(gè)氨基酸(圖1)。

A.PCR 擴(kuò)增OsGRF6;M.DL2000 DNA marker;1.OsGRF6 基因;B.OsGRF6蛋白序列。圖1 OsGRF6 基因的克隆及蛋白序列A.Cloning O sGRF6 gene by PCR.M,DL2000 DNA marker.1,OsGRF6 gene.B.Protein sequence of OsGRF6.Fig.1 Cloning of OsGRF6 gene and its protein sequence

通過(guò)CDD 網(wǎng)站,對(duì)OsGRF6 蛋白進(jìn)行保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,OsGRF6蛋白的第11～45位氨基酸,存在1個(gè)典型的GRF轉(zhuǎn)錄因子QLQ保守結(jié)構(gòu)域,在第77～118位氨基酸存在1個(gè)WRC結(jié)構(gòu)域,符合GRF家族的特征,表明OsGRF6蛋白屬于植物的GRF家族。

將OsGRF6氨基酸序列與擬南芥的GRF家族蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。OsGRF6 蛋白與擬南芥GRF蛋白類似,均存在1個(gè)高度保守的QLQ 結(jié)構(gòu)域和WRC結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 OsGRF6與OsGRF1,AtGRF1和AtGRF2同源蛋白序列比對(duì)(A)及OsGRF6保守結(jié)構(gòu)域分析(B)Fig.2 Homologous protein sequence alignment of OsGRF6 with OsGRF1,AtGRF1,and AtGRF2(A)and analysis of the conservered domain of OsGRF6(B)

利用MEGA 7.0軟件將OsGRF6與其他GRF蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明,OsGRF6與單子葉植物水稻中OsGRF7和OsGRF8蛋白同源性較高,親緣關(guān)系最近,其次與雙子葉植物擬南芥比較發(fā)現(xiàn)OsGRF6 與AtGRF1、AtGRF2 親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 OsGRF6進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of OsGRF6

2.2 OsGRF6 啟動(dòng)子作用元件分析

從水稻信息網(wǎng)(RAP-DB)獲得了ZH11中Os-GRF6起始密碼子上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列,利用在線軟件PlantCARE對(duì)其含有的順式作用元件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:啟動(dòng)子區(qū)域除了常見(jiàn)的TATA-box和CAAT-box 外,還包含光響應(yīng)元件10 個(gè)(GATA-motif、Sp1、G-box、ATCT-motif、TCT-motif、GT1-motif),植物激素順時(shí)作用元件6個(gè)(TGACG-motif、TCA-element、CGTCA-motif、Aux RR-core),非生物脅迫應(yīng)答元件3 個(gè)(ARE、LTR),植物分生組織表達(dá)相關(guān)元件1 個(gè)(CATbox),晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)元件1個(gè)(circadian),見(jiàn)表1。

表1 OsGRF6 啟動(dòng)子順式元件分析Table 1 Analysis of cis-acting elements of OsGRF6 promotor

2.3 OsGRF6 的組織表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性分析

通過(guò)水稻eFP網(wǎng)站(http://www.bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efp Web.cgi? dataSource=ricestigma_mas)分析OsGRF6在水稻不同組織的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),OsGRF6在水稻葉、種子、花、根和頂端分生組織中都有比較高的表達(dá),其中以花和頂端分生組織中表達(dá)量最高,根和種子中表達(dá)量次之,葉中表達(dá)量相對(duì)較少(圖4,A)。進(jìn)一步用qPCR 對(duì)網(wǎng)站分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示與網(wǎng)站分析結(jié)果一致(圖4,B)。為了確定OsGRF6 在水稻細(xì)胞中的表達(dá)位置,通過(guò)構(gòu)建p BI221-OsGRF6-GFP質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞,結(jié)果顯示,OsGRF6 綠色熒光與核定位基因H2B 的紅色熒光重疊,表明OsGRF6定位細(xì)胞核(圖4,C),并且通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,檢測(cè)GUS活性分析顯示BD-OsGRF6的實(shí)驗(yàn)組GUS活性明顯高于對(duì)照組BD,說(shuō)明OsGRF6具有轉(zhuǎn)錄激活活性(圖4,D、E)。

A.eFP網(wǎng)站上OsGRF6 組織表達(dá)模式分析;B.qPCR 分析OsGRF6 在水稻葉、種子、穗、莖、根中的相對(duì)表達(dá)量;C.OsGRF6的亞細(xì)胞定位分析;D.OsGRF6 轉(zhuǎn)錄活性分析載體構(gòu)建模式圖;E.OsGRF6 轉(zhuǎn)錄激活活性分析,BD-HOS15 為正對(duì)照,采用Student's t test進(jìn)行顯著性分析(*P<0.05)。圖4 OsGRF6 組織表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析A.Analysis of the expression pattern of OsGRF6 in eFP.B.Expression levels of OsGRF6 in leaves,seeds,panicles,shoots,and roots.C.Subcellular localization of OsGRF6 in rice protoplast cells.D.Vector construction for analyzing the transcriptional activation activity of OsGRF6.E.Analysis of OsGRF6 transcriptional activation activity.BD-HOS15 as the positive control.Statistical analysis was performed with Student's t-test(*P<0.05).Fig.4 Analysis of the expression pattern,subcellular localization,and transcriptional activation activity of OsGRF6

2.4 OsGRF6 的轉(zhuǎn)基因材料及突變體鑒定和根發(fā)育表型分析

為了確定OsGRF6在水稻發(fā)育過(guò)程中的功能,構(gòu)建了OsGRF6的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料和基因編輯敲除突變體材料,并對(duì)其根發(fā)育表型進(jìn)行初步分析。對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行分子鑒定,分析顯示突變體材料在OsGRF6第1個(gè)外顯子有11bp的缺失,并且該缺失使得OsGRF6的氨基酸產(chǎn)生了移碼突變(圖5,A)。通過(guò)分析水稻萌發(fā)后3 d和6d的水稻根長(zhǎng)發(fā)現(xiàn),在osgrf6突變體中水稻初生根根長(zhǎng)度與野生型ZH11相比,明顯短于野生型(圖5,B),qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因OE 材料中,OsGRF6的表達(dá)量與野生型ZH11相比顯著上調(diào)(圖5,C),而過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的主根長(zhǎng)度與野生型和突變體相比則明顯變長(zhǎng)(圖5,D)。

ZH11.中花11;osgrf6.OsGRF6 突變體;OE1.過(guò)表達(dá)OsGRF6 轉(zhuǎn)基因材料1;OE2.過(guò)表達(dá)OsGRF6 轉(zhuǎn)基因材料2;A.OsGRF6 基因結(jié)構(gòu)分析和osgrf6 突變體鑒定,淺灰色表示UTR,淺藍(lán)色表示外顯子;B.水稻種子萌發(fā)3 d和6 d時(shí)初生根表型分析,標(biāo)尺為1 cm;C.OsGRF6 基因表達(dá)量分析;D.根長(zhǎng);E.粒寬,標(biāo)尺為1 cm;F.粒長(zhǎng),標(biāo)尺為1 cm;G.水稻種子粒長(zhǎng)統(tǒng)計(jì);H.水稻種子粒寬統(tǒng)計(jì);I.水稻穗期株高統(tǒng)計(jì);采用Student's t test進(jìn)行顯著性分析(*P<0.05)圖5 OsGRF6 轉(zhuǎn)基因材料和突變體鑒定及初生根、粒型、株高表型分析ZH11,Zhonghua 11.osgrf6,OsGRF6 mutant.OE1,OsGRF6 over-expression line 1.OE2,OsGRF6 over-expression line 2.A.Analysis of OsGRF6 gene and identification of osgrf6 mutant.Light gray represents UTR,light blue represents exons.B.Analysis of primary root length after seed germination for 3 days and 6 days,Bar=1 cm.C.The expression level of OsGRF6.D.Root length.E.Seed width,Bar=1 cm.F.Seed length,Bar=1 cm.G.Analysis of seed length.H.Analysis of seed width.I.Analysis of plant height.Statistical analysis was performed with Student's t-test(*P<0.05).Fig.5 Identification of OsGRF6 transgenic lines and mutants and phenotypic analysis of primary roots,seeds,and plant heights

通過(guò)表型分析初步說(shuō)明OsGRF6能參與調(diào)控水稻初生根的伸長(zhǎng)。此外,通過(guò)對(duì)水稻粒型的觀察和統(tǒng)計(jì),在ZH11背景下OsGRF6-OE 轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出粒寬和粒長(zhǎng)都增加的表型。而突變體種子則變化不明顯(圖5,E-H)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)水稻穗期植株株高發(fā)現(xiàn),突變體植株表現(xiàn)出比野生型株高變矮的表型(圖5,I)。

2.5 OsGRF6 可與CGGCA 基序結(jié)合調(diào)控下游靶基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步明確OsGRF6調(diào)控水稻主根長(zhǎng)度的分子機(jī)制,用酵母單雜交對(duì)已報(bào)道OsGRF6結(jié)合的基序CGGCA 進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)OsGRF6能與CGGCA 在酵母細(xì)胞中結(jié)合(圖6,A),進(jìn)一步對(duì)ChIPseq和miRNA396 RNA-seq數(shù)據(jù)[38]進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在ChIP-Seq獲得175個(gè)靶基因中,有98個(gè)靶基因在RNA-seq數(shù)據(jù)中表達(dá)上調(diào)的,66 個(gè)表達(dá)下調(diào)的(圖6,B)。OsGRF6在已報(bào)道的文獻(xiàn)中主要參與激活下游靶基因的表達(dá),因此,對(duì)上調(diào)的98個(gè)靶基因進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有10個(gè)候選靶基因可能參與調(diào)控水稻根的發(fā)育(表2)。

表2 OsGRF6參與調(diào)控水稻根發(fā)育的候選靶基因Table 2 OsGRF6 target genes involved in root development

A.酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OsGRF6能與CGGCA motif結(jié)合;B.ChIP-seq和RNA-seq韋恩圖。圖6 酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OsGRF6與CGGCA motif結(jié)合以及利用ChIP-seq和RNA-seq預(yù)測(cè)OsGRF6的直接靶基因A.OsGRF6 interact swith CGGCA motif in yeast cells.B.Wayne diagram analysis of ChIP-seq and RNA-seq assays.Fig.6 Interaction of OsGRF6 with CGGCA motif by yeast one-hybrid and target gene prediction by ChIP-seq and RNA-seq

除了OsARF7和OsARF4外,其中大部分基因功能都未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)分析這些基因(擬南芥的同源基因)發(fā)現(xiàn),joka8與擬南芥LRL1同源,參與調(diào)控植物根毛的發(fā)育[39]。LOC_Os01g55780 與擬南芥GDPD6同源,參與調(diào)控磷缺失下,擬南芥根的伸長(zhǎng)[40]。LOC_Os07g37454與擬南芥OCT2同源參與調(diào)控根的發(fā)育[41]。此外,LOC_Os03g58230,LOC_Os07g36610和LOC_Os03g44440的同源基因也參與調(diào)控?cái)M南芥根的發(fā)育[42-44]。這些候選靶基因可為進(jìn)一步研究OsGRF6參與調(diào)控水稻根的發(fā)育提供線索。

3 討論

GRF轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子。該類轉(zhuǎn)錄因子主要有2 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,即QLQ 結(jié)構(gòu)域和WRC 結(jié)構(gòu)域,其中WRC 結(jié)構(gòu)域其主要功能負(fù)責(zé)與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[45]。GRF 家族基因被報(bào)道參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。

有研究表明,GRF 家族參與調(diào)控植物葉的發(fā)育,如At GRF1、At GRF3、At GRF5通過(guò)調(diào)控葉片細(xì)胞的數(shù)目調(diào)控葉片發(fā)育[46-48],過(guò)表達(dá)AtGRF1、At-GRF5的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉片變大的表型。GRF家族轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控植物花的發(fā)育,GIF-GRF互作模塊在植物花發(fā)育調(diào)控中起著重要作用。擬南芥中atgif1/2/3突變體表現(xiàn)出雌蕊和胚囊缺失的表型[49]。水稻中osgrf6/osgrf10的純合突變體表現(xiàn)出小花發(fā)育異常和開(kāi)穎的表型[29]。GRF 主要在生長(zhǎng)旺盛的幼嫩組織中表達(dá),且其表達(dá)受小RNA396a、RNA396b、RNA396d的負(fù)調(diào)控[32,50]。此外,OsGRF6和OsGRF4還參與調(diào)控水稻種子的發(fā)育,過(guò)表達(dá)OsGRF6的轉(zhuǎn)基因株系種子與野生型相比,表現(xiàn)出種子變大的表型,而突變體則表現(xiàn)出種子變小的表型[35,38]。進(jìn)一步研究表明,OsGRF6通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Os TAWAWA1和OsMADS34的表達(dá),正調(diào)控生長(zhǎng)素合成和信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控種子的發(fā)育[38]。本文中過(guò)表達(dá)OsGRF6的轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出種子變大的表型,而突變體植株的種子與野生型差別不明顯,可能是由于水稻GRF家族存在功能冗余的現(xiàn)象。此外,與前人的研究比較,水稻轉(zhuǎn)基因背景品種差異也可能是導(dǎo)致突變體種子表型不明顯的另一重要原因。擬南芥中小RNA396a參與調(diào)控?cái)M南芥根的發(fā)育,過(guò)表達(dá)小RNA396a的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出根變短的表型,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),小RNA396通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子b H LH74的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥根的發(fā)育[51]。作為小RNA396家族的靶基因GRF,是否也參與調(diào)控植物根的發(fā)育,組織表達(dá)模式分析顯示,GRF轉(zhuǎn)錄因子在許多種類植物的根中都有表達(dá),說(shuō)明GRF家族轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控植物根的發(fā)育[50]。擬南芥中還沒(méi)有直接證據(jù)證明是否miR396通過(guò)調(diào)控GRF轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物根的發(fā)育。本文通過(guò)對(duì)水稻OsGRF6組織表達(dá)模式分析,也驗(yàn)證了OsGRF6在根中表達(dá)量較高,且OsGRF6過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和功能缺失突變體也分別表現(xiàn)出與野生型相比初生根較長(zhǎng)和較短的表型。說(shuō)明OsGRF6能參與調(diào)控水稻初生根的伸長(zhǎng)。在OsGRF6調(diào)控種子大小方面的研究表明,OsGRF6通過(guò)生長(zhǎng)素途徑調(diào)控種子的大小,在其ChIP-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)多個(gè)與植物根發(fā)育相關(guān)的候選靶基因,其中也有受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)表達(dá)的Os ARF4和OsARF7?？赡躉sGRF6調(diào)控水稻初生根的發(fā)育,也是通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素途徑。此外,通過(guò)OsGRF6啟動(dòng)子分析表明,OsGRF6啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)生長(zhǎng)素調(diào)控的結(jié)合元件,可能存在ARF 家族基因?qū)RF基因的反饋調(diào)控,基于以上的研究結(jié)論,是否存在這一推論,未來(lái)還需從分子和遺傳方面做更深入探索。

4 結(jié)論

本研究初步解析了OsGRF6參與調(diào)控水稻根發(fā)育的生物學(xué)功能,確定了OsGRF6調(diào)控水稻根發(fā)育可能通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn),挖掘出一些與水稻根發(fā)育相關(guān)且可能是OsGRF6的靶基因,可為進(jìn)一步研究OsGRF6的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

致謝:感謝中科院植物研究所種康院士和徐云遠(yuǎn)研究員惠贈(zèng)OsGRF6的試驗(yàn)材料。