徐靖辰 ,郭 媛 ,王彥芹,2*

(1 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

由于植物在其生長過程中無法移動,所以周圍的環(huán)境對其生長發(fā)育的影響巨大[1]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物的生長發(fā)育過程都受到極端溫度,高鹽的脅迫[2-3]。植物長期生長于惡劣環(huán)境中,會造成作物嚴重減產(chǎn),因此通過分子生物學(xué)手段挖掘抗逆相關(guān)基因,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其穩(wěn)定地在作物中遺傳,并期望得到抗逆性較強的作物種質(zhì)資源[4]。

研究發(fā)現(xiàn),14-3-3蛋白是目前研究較深、較為廣泛的抗逆基因家族之一,具有優(yōu)異的廣譜抗逆性[5],模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中14-3-3蛋白的過表達增強了擬南芥的耐寒性,14-3-3 和SOS3(salt overly sensitive 3)/scapp8(SOS3-like calcium binding protein 8)相互作用進而解碼鹽脅迫下的鈣信號,并選擇性激活或失活下游蛋白激酶SOS2(Salt Sensitive 2)和PKS5(protein kinase SOS2-like 5),通過協(xié)調(diào)介導(dǎo)質(zhì)膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運蛋白和H+-ATP酶活性來調(diào)節(jié)Na+穩(wěn)態(tài)[6],14-3-3基因在棉花中過表達可有效提高棉花抗旱能力,14-3-3基因主要通過調(diào)節(jié)離子通道和參與激素信號的通路減輕或促進棉花對這些應(yīng)激的耐受性[7]。14-3-3蛋白是一類在生物體內(nèi)普遍存在的調(diào)節(jié)磷酸絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合蛋白,存在于所有真核細胞中[8]。通常14-3-3 結(jié)構(gòu)域與其靶蛋白的結(jié)合以磷酸化方式進行[9],但在某些情況下,含有14-3-3 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)以磷酸化非依賴性方式參與許多細胞過程的調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)[10],前期本研究從花花柴高溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出7 個差異表達基因,通過NCBI在線比對發(fā)現(xiàn)均屬于14-3-3基因家族,因其在高溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中上調(diào)表達,故命名為Kc H TR。

新疆地理氣候的特殊性,使得新疆本土植物具有很強的抗逆性,花花柴是荒漠中最為典型的草本植物[11]?；ɑú?Kareliniacaspia)具有耐鹽堿、耐干旱、耐高溫和抗風(fēng)沙等優(yōu)異的廣譜抗逆性,是珍貴的抗逆植物天然種質(zhì)資源[12]。其生長環(huán)境極為惡劣,多生于戈壁灘,少數(shù)生長于草甸鹽堿地和葦?shù)厮锱?常常大片群生[13]。花花柴葉扁平且肉質(zhì)化,體內(nèi)有發(fā)達的儲水組織,保水能力強,具有較低的萎蔫系數(shù)[14]。花花柴有極好的耐鹽性和耐旱性,是一種改良鹽堿土的有用草本植物,同時也是產(chǎn)草量和營養(yǎng)價值都較高的一種野生飼草[15]。但關(guān)于花花柴14-3-3基因序列和蛋白的功能鮮見報道,因此該研究通過對花花柴HTR 基因家族進行原核表達并分析其抗逆性,進一步確定Kc H TR的抗逆性及其表達蛋白質(zhì)的最佳誘導(dǎo)條件,為后續(xù)研究提供有力的支撐。通過挖掘利用花花柴耐極端溫度和耐鹽基因進行系統(tǒng)研究,利用其抗逆機制增加作物對逆境的耐受性,同時確保作物豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)以及為荒漠植物及其基因資源發(fā)掘利用提供一定參考價值和理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的花花柴種子于2022年9月采自新疆阿拉爾市塔克拉瑪干沙漠的荒漠土壤(40°32′N,81°17′E),種子經(jīng)過自然干燥后放置于離心管中常溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

營養(yǎng)土與蛭石按3∶1混合均勻,將花花柴種子均勻撒在營養(yǎng)土內(nèi),待發(fā)芽后取長勢相同的花花柴幼苗進行4℃低溫脅迫5 min、0.5 h、2 h、4 h、8 h,45℃高溫脅迫5 min、0.5 h、2 h、4 h,400 mmol/L Na+高鹽脅迫處理2,4,8,24,48 h,每個處理3個重復(fù),待處理完畢后取花花柴植株的根、莖、葉分別用液氮速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花花柴總RNA提取及cDNA合成

用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒(天根生化科技北京有限公司,中國)提取花花柴的總RNA,用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA 公司,中國)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,試驗操作均參照試劑盒說明書。

1.2.3 花花柴Kc HTRs原核表達載體構(gòu)建

首先根據(jù)原核表達載體p ET28a的多克隆位點設(shè)計帶有酶切位點的Kc H TRs引物,并送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行合成,如表1 所示。用反轉(zhuǎn)錄所得到的花花柴cDNA 為模板進行PCR擴增,擴增體系為:95℃4 min,95℃30 s,35循環(huán);57℃30 s,35 循環(huán);72℃1 min,35 循環(huán);72℃7 min,4℃15 min。PCR 擴增結(jié)束后利用0.8%的瓊脂糖凝膠120 V 電泳15 min進行檢測,克隆成功后用高效DNA膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司,中國)進行回收,與p MD18-T載體連接(TAKARA 公司,中國),連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,隨機選取3個帶有目的產(chǎn)物的陽性克隆質(zhì)粒,送由陜西楊凌天潤奧科生物科技有限公司完成測序,并用DNAMAN軟件分析測序結(jié)果。

表1 Kc HTRs 引物序列Table 1 Primer sequences for Kc HTRs

測序成功后用質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司,中國)提取p MD18-T-Kc HTRs和p ET28a空載體質(zhì)粒,將質(zhì)粒分別利用(BamH Ⅰ-SaiⅠ、BamHⅠ-HindⅢ、SacⅠ-SaiⅠ、BamHⅠ-SalⅠ、BamH Ⅰ-EcoRⅠ)進 行雙酶切,p MD18-T-Kc HTRs雙酶切產(chǎn)物和p ET28a雙酶切產(chǎn)物用T4 DNA 連接酶37℃定向連接30 min后,連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,然后均勻涂布在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的LB 固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)倒置培養(yǎng)16 h后,挑取單菌落在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h,進行菌液PCR 篩選陽性菌落。

1.2.4 花花柴Kc HTRs原核表達

將陽性菌落進一步擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,利用PCR篩選陽性菌落。將陽性菌落進一步擴大培養(yǎng),在含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37℃、180 r/min過夜培養(yǎng),按照1∶60比例進行二次活化菌株,直至OD600達到0.8,加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG 溶液誘導(dǎo)0,2,4,6,8,10,12 h用以分析蛋白最佳誘導(dǎo)表達時間,擴大培養(yǎng)陽性菌株直至OD600分別達到0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0,加入0.5 mmol/L的IPTG 溶液誘導(dǎo)8 h用以分析蛋白最佳誘導(dǎo)OD600值,擴大培養(yǎng)陽性菌株至OD600達到0.8,加入終濃度為0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mmol/L的IPTG 溶液誘導(dǎo)8 h用以分析最佳誘導(dǎo)IPTG 濃度,提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測,確定Kc HTRs蛋白的最佳誘導(dǎo)表達條件。

1.2.5 重組BL21(pET28a-KcHTRs)的抗逆性分析

(1)耐極端溫度分析:在上述最佳誘導(dǎo)條件下,誘導(dǎo)BL21-p ET28a和重組菌落表達Kc HTRs蛋白后,用含有硫酸卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基將菌液分別稀釋10、100、1000倍,取稀釋后菌液各2μL,點在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的LB 固體培養(yǎng)基上,將2個平板分別放置在高溫脅迫45℃和低溫脅迫4℃處理48 h后再放置于37℃正常培養(yǎng)16 h,拍照觀察菌落生長狀態(tài)。

(2)耐鹽分析:在上述最佳誘導(dǎo)條件下,誘導(dǎo)重組菌落表達Kc HTRs蛋白后,用含有硫酸卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基將菌液分別稀釋10、100、1 000倍,取稀釋后菌液各2μL,分別點在含有0.1,0.2,0.3 mol/L 的NaCl和硫酸卡那霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上,放置37℃培養(yǎng)16 h后拍照觀察菌落生長狀態(tài)。

(3)菌落形成率:無脅迫處理的平板作為對照37℃培養(yǎng)4 h,脅迫處理的平板同樣生長4 h后,計算不同菌株的菌落形成率。菌落形成率=(脅迫生長菌落數(shù)/對照生長菌落數(shù))×100%。

1.2.6 花花柴Kc HTRs極端溫度及鹽脅迫表達模式分析

用RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司,中國]試劑盒提取花花柴的總RNA,再用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA 公司,中國)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

不同脅迫處理按時間梯度進行表達模式分析,半定量PCR 引物(表2),PCR 擴增體系為:95℃4 min,95℃30 s,35循環(huán);57℃30 s,35循環(huán);72℃1 min,38循環(huán);72℃7 min,4℃15 min。用18S作為內(nèi)參基因,用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果,并用Image J軟件和Graphpad Pism9.5軟件對條帶灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析并繪圖,進而確定在不同脅迫下Kc H TRs表達趨勢。

表2 Kc HTRs 半定量PCR 引物序列Table 2 Primer sequences of semi-quantitative PCR for Kc HTRs

2 結(jié)果與分析

2.1 花花柴Kc HTRs 原核表達載體的構(gòu)建

用1.2.2節(jié)花花柴反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板,通過1.2.3節(jié)的PCR 程序擴增并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,雙酶切后與p ET28a載體連接,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21挑取陽性菌落利用上述PCR 程序擴增后進行驗證,分別獲得708,777,780,771,789,777,765 bp 共7 條帶,分別命名為Kc HTR1、Kc HTR2、Kc HTR3、Kc HTR4、Kc HTR5、Kc H TR7、Kc H TR8,如圖1所示。

M.DL2000;A.泳道1-5分別為Kc HTR1、Kc H TR2、Kc H TR5、Kc H TR7、Kc H TR8;B.泳道1-2分別為Kc H TR4、Kc H TR3。圖1 轉(zhuǎn)Kc HTRs 大腸桿菌BL21菌落PCR 驗證圖M,DL2000.A.Lanes 1-5 are K c HTR1,Kc H TR2,Kc H TR5,Kc HTR7,and K c HTR8,respectively.B.Lanes 1-2 are K c H TR4 and K c H TR3,respectively.Fig.1 PCR verification of the BL21 colonies transformed with K c H TRs

2.2 花花柴Kc HTRs 原核表達結(jié)果

將陽性克隆的Kc H TRs菌液在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的液體LB 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD600達到0.8 后加入終濃度 為0.5 mmol/L 的IPTG 溶液,分別誘導(dǎo)0,2,4,6,8,10,12 h,用OD600為0.8且同樣加入終濃度0.5 mmol/L IPTG溶液的大腸桿菌BL21和BL21-pET28a作為對照,結(jié)果表明:Kc HTRs表達蛋白的大小在27～29 kD 之間,如圖2所示。通過不同誘導(dǎo)時間發(fā)現(xiàn),花花柴Kc HTRs蛋白在誘導(dǎo)時間達到8～10 h時表達量趨于穩(wěn)定,并達到最高,故確定最佳誘導(dǎo)表達時間為8～10 h。

將陽性克隆的Kc H TR1菌液在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的液體LB 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD600達到0.8 后,分別加入終濃度為0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mmol/L 的IPTG 溶液誘導(dǎo)8 h,用OD600為0.8 且加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 溶液的大腸桿菌BL21和BL21-p ET28a作為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當IPTG 濃度大于0.5 mmol/L 后蛋白表達量達到最高,綜合經(jīng)濟效益考慮確定最佳誘導(dǎo)Kc HTRs蛋白的IPTG 濃度為0.5 mmol/L,如圖3,A 所示。

圖3 不同IPTG 濃度(A)和OD600(B)對花花柴Kc HTRs蛋白表達的影響Fig.3 Effects of different IPTG concentrations(A)and OD600 (B)on the expression of Kc HTRs in K.caspia

將陽性克隆的Kc HTR1菌液在含有硫酸卡那霉素(50 mg/L)的液體LB 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD600達到0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,加入0.5 mmol/L 的IPTG 溶液誘導(dǎo)8 h,用OD600為0.8且加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 溶液的大腸桿菌BL21和BL21-p ET28a作為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當菌液OD600達到0.8時蛋白表達量到最高,為節(jié)約試驗時間并達到最好的試驗效果確定最佳誘導(dǎo)Kc HTRs蛋白的OD600值為0.8,如圖3,B所示。

2.3 重組BL21(pET28a-KcHTRs)的抗逆性分析

按照1.2.5節(jié)的試驗方法進行重組質(zhì)粒的抗逆性分析,以無脅迫處理37℃正常培養(yǎng)的重組大腸桿菌生長情況作為對照。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn),在無脅迫處理時重組大腸桿菌均能夠正常生長,且生長趨勢一致,但在45℃高溫脅迫時除Kc H TR8之外其余菌落生長數(shù)均明顯高于p ET28a,在4℃低溫脅迫時Kc HTR2、Kc HTR3、Kc HTR4、Kc HTR5的 菌落生長數(shù)均高于p ET28a,在3種不同的鹽濃度脅迫下Kc H TR2、Kc H TR5均比對照生長得好,Kc HTR2、Kc HTR5在鹽濃度達到0.3 mol/L NaCl時生長狀態(tài)均好于對照組,但是在鹽濃度為0.2 mol/L NaCl時Kc HTRs的菌落生長狀態(tài)相比較對照較好,鹽濃度為0.1 mol/L NaCl時Kc HTR1、Kc HTR2、Kc HTR5菌落生長狀態(tài)均好于對照,且菌落形成率與對照相比有顯著性差異。因此花花柴除Kc H TR8以外均能夠提高重組大腸桿菌的耐高溫性,花花柴Kc HTR2、Kc HTR3、Kc HTR4、Kc HTR5能夠提高重組大腸桿菌的耐低溫性,重組大腸桿菌p ET28a-Kc HTRs在0.2 mol/L NaCl溶液中展現(xiàn)出較好的耐鹽性,花花柴Kc HTR2、Kc HTR5能夠提高重組大腸桿菌的耐鹽性。綜上所述,Kc HTRs能夠在一定程度上增加大腸桿菌對逆境脅迫的抗性。

*、**、***分別表示處理內(nèi)p ET28a-Kc HTRs與p ET28a分別在0.05、0.01、0.001水平存在顯著性差異,ns則表示無顯著性差異。圖4 花花柴Kc HTRs 在大腸桿菌中的抗逆性分析*,**,and***indicate significant difference between pET28a-Kc HTRs and pET28a at 0.05,0.01,and 0.001 levels,respectively.ns indicates no significant difference.Fig.4 Stress resistance analysis of Kc HTRs in E.coli

2.4 花花柴Kc HTRs 極端溫度及高鹽脅迫表達模式分析

2.4.1 高溫脅迫表達模式

45℃高溫脅迫表達模式分析結(jié)果顯示:Kc HTRs均在高溫處理5 min時表達量降低,當處理時間延長到0.5 h時表達量增加,處理時長增加到2 h時表達量降低,但當處理時間為4 h時表達量高于未處理時,Kc HTR3、Kc HTR4、Kc HTR7在45℃高溫處理時在根莖葉中的表達量一直較高,而Kc H TR1、Kc H TR2、Kc H TR8在45℃高溫時普遍在根和莖中的表達量較高,Kc HTR5在莖和葉中的表達量較高,該結(jié)果表明花花柴Kc H TRs在面對45℃高溫脅迫時表達量呈現(xiàn)出高—低—高的趨勢(圖5,A)。

2.4.2 低溫脅迫表達模式

4℃低溫脅迫表達模式分析結(jié)果顯示:Kc HTRs在遭受冷脅迫時在根器官中的表達量較高,Kc HTR2、Kc HTR5、Kc HTR7、Kc HTR8在4℃低溫處理5 min時表達量降低,隨著低溫處理時間增加到0.5 h時表達量上升,當?shù)蜏靥幚頃r間達到8 h時表達量幾乎與未處理一致,除Kc HTR5以外其余成員的表達量比未處理時表達量還高,然而Kc HTR1、Kc HTR3、Kc HTR4、Kc HTR5在4℃低溫脅迫處理過程中在莖中幾乎沒有表達,在葉中的表達量也較低。該現(xiàn)象表明花花柴Kc HTRs在面對4℃低溫脅迫時表達量總體呈現(xiàn)高—低—高的趨勢,說明花花柴在面對4℃低溫脅迫時Kc HTRs在根部總體上調(diào)表達,而Kc H TR2、Kc H TR5在根和葉中均能夠較好的響應(yīng)低溫脅迫(圖5,B)。

2.4.3 高鹽脅迫表達模式

400 mmol/L Na+高鹽脅迫表達模式分析顯示:Kc H TRs在400 mmol/L Na+高鹽脅迫處理2 h時表達量降低,處理時長達到4 h時Kc HTR7和Kc H TR8表達量增加,當處理時長達到8 h 時Kc HTR1、Kc HTR5、Kc HTR7、Kc HTR8均增加,但表達量仍然低于未處理時的表達量,且在應(yīng)對高鹽脅迫時在根莖葉中均有較高的表達量,但Kc HTRs在遭受400 mmol/L Na+高鹽脅迫時表達量均低于未處理時,表明花花柴Kc HTRs并不能積極響應(yīng)400 mmol/L Na+高鹽脅迫(如圖5,C)。

3 討論

研究表明在植物體內(nèi)14-3-3 蛋白具有2 個高度保守的結(jié)構(gòu)域[16],通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)花花柴Kc HTR5、Kc HTR3和擬南芥GRF9、GRF7蛋白質(zhì)序列相似性最高,研究發(fā)現(xiàn)擬南芥GRF9編碼14-3-3蛋白,主要響應(yīng)低溫脅迫并增強了擬南芥的耐旱性[17],而花花柴Kc HTR5 蛋白比擬南芥GRF9所編碼的14-3-3蛋白多出Motif5,其氨基酸序列為:EREENVYMAKLAEQAERYEEMVEFMEKVA,根據(jù)花花柴低溫表達模式分析結(jié)果顯示Kc H TR5在應(yīng)對低溫脅迫和高鹽脅迫時表達量總體呈現(xiàn)增加的趨勢,故推測其不僅具有耐低溫性、耐旱性,還有一定的耐鹽性,推測Kc HTR3僅具有耐極端溫度的功能?；ɑú馣c HTR2、Kc HTR4與番茄TFT8、Kc HTR8與TFT10、Kc HTR7和Kc HTR1蛋白與TFT5蛋白質(zhì)序列相似性最高[16],研究表明番茄這類基因編碼的14-3-3蛋白在遭受極端溫度時被大量激活[18-19],同時花花柴極端溫度表達模式分析和在細菌中的抗逆性結(jié)果分析顯示,推測花花柴Kc H TRs同樣具有耐極端溫度廣譜抗逆性。

14-3-3蛋白可以直接通過影響蛋白與蛋白之間的互作,而廣泛存在于所有真核生物中,并發(fā)揮靶蛋白的調(diào)節(jié)作用[20],14-3-3蛋白調(diào)節(jié)其他靶蛋白作用主要是通過結(jié)合靶蛋白上特定的位點并經(jīng)磷酸化介導(dǎo)[10,21]。14-3-3蛋白具有較強的適應(yīng)能力,它可以在多蛋白復(fù)合物中發(fā)揮作用[22],它們還可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性或者定位來調(diào)節(jié)應(yīng)激誘導(dǎo)基因的表達[6]。由于14-3-3蛋白特殊的結(jié)構(gòu),其在植物逆境脅迫中扮演者多種多樣的角色,因此通過研究花花柴抗逆相關(guān)基因的分子機理,利用其抗逆原理,將其轉(zhuǎn)入到棉花等經(jīng)濟作物中[23],可提高農(nóng)作物對逆境脅迫的耐受性,并且為后期花花柴抗逆性基因資源發(fā)掘與研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

研究用原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中異源表達了花花柴Kc HTRs 蛋白,明確了花花柴Kc HTRs蛋白在大腸桿菌BL21 最適生長溫度37℃下其最佳誘導(dǎo)表達體系為OD600達到0.8,IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)時間為8～10 h,并對重組BL21(p ET28a-Kc HTRs)的抗逆性進行研究,發(fā)現(xiàn)其能夠明顯提高宿主菌對極端溫度和高鹽脅迫的耐受性,說明花花柴Kc HTRs具有耐極端溫度,耐鹽等優(yōu)異的廣譜抗逆性。通過對花花柴Kc HTRs進行耐極端溫度(45℃、4℃)和耐鹽性(400 mmol/L Na+)的表達模式分析發(fā)現(xiàn),花花柴Kc HTRs耐極端溫度的能力較強,而耐高鹽脅迫的能力較一般,花花柴Kc H TRs在面對極端溫度脅迫時總體表達趨勢呈現(xiàn)高—低—較高,說明花花柴植株在面對逆境脅迫時表現(xiàn)出耐受-響應(yīng)-適應(yīng)的過程。