歐 敏，潘 宇，陳 路，趙成堅，侯小利，譚梔恩，張孟麗，李曉玲，吳芳芳*

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；3.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

八角茴香又稱八角，為木蘭科八角屬植物Illicium verum Hook.f.的干燥成熟果實(shí)，其味辛、性溫，適用于腎虛腰酸、胃寒嘔吐等癥，也常用作食用香料［1-2］。八角茴香含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮、倍半萜內(nèi)酯等多種化學(xué)成分，具有抑菌、抗炎、止痛、抗動脈粥樣硬化等作用，是天然的抗病毒藥［3］。莽草酸、原兒茶酸、對甲氧基苯甲酸、對羥基苯甲酸都是有機(jī)酸中的重要組成成分［4］。現(xiàn)代研究表明，莽草酸是合成抗H5N1 禽流感病毒藥物“達(dá)菲”的重要成分，同時還具有減少軟骨細(xì)胞自噬的損害等多種功效［5-6］；原兒茶酸臨床可用于治療慢性氣管炎［7］；對甲氧基苯甲酸是合成茴拉西坦、酪氨酸酶抑制劑等藥物的重要成分［8］；對羥基苯甲酸可以應(yīng)用于化工、塑料、食品、醫(yī)藥及染料工業(yè)中［9］。廣西是八角茴香的主要產(chǎn)地，八角茴香作用廣泛，可用于醫(yī)藥工業(yè)、獸藥工業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)。通過挖掘八角的藥效潛能，可有效發(fā)揮廣西八角資源的實(shí)際價值，促進(jìn)八角產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，2020版《中華人民共和國藥典（一部）》中八角茴香僅有對揮發(fā)性成分中揮發(fā)油和反式茴香腦的含量測定［10］，缺乏非揮發(fā)性成分的評價指標(biāo)，質(zhì)量控制仍不夠完善。廣西八角茴香產(chǎn)地較多，生長環(huán)境不同，藥材品質(zhì)之間存在一定的差異。本研究擬建立八角茴香中的莽草酸、原兒茶酸、對甲氧基苯甲酸、對羥基苯甲酸的含量測定方法，對廣西11 個不同產(chǎn)地的八角茴香進(jìn)行含量測定，以期為廣西八角茴香的質(zhì)量控制、品質(zhì)優(yōu)選及開發(fā)利用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥與試劑 甲醇［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；乙腈［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；石油醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；莽草酸對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；原兒茶酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；對羥基苯甲酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；對甲氧基苯甲酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水；八角茴香藥材分別采收于廣西不同產(chǎn)地，由廣西藥用植物園藍(lán)鳴生主任藥師鑒定為木蘭科八角屬植物八角茴香Illiciun verum Hook.f.的干燥成熟果實(shí)。

1.2 儀器 LC-2030C-3D-Plus 型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；KQ-300VDE 型三頻超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLERTOLEDO 型十萬分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；BSA124S 萬分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸5.060 mg、2.515 mg、3.006 mg、2.515 mg，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得含量為莽草酸1.012 mg/ml、原兒茶酸0.503 mg/ml、對羥基苯甲酸0.501 mg/ml 和對甲氧基苯甲酸0.503 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取八角茴香粉末1 g，加水20 ml 超聲波提取30 min，靜置，稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-3%磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10μl；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10μl，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，色譜圖見圖1。結(jié)果莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件，以混合對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），混合對照品峰面積的平均值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.4%、0.8%、1.8%、0.8%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 后按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的RSD 分別為0.9%、4.7%、3.1%、1.7%（n=8），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的RSD分別為0.4%、0.8%、0.9%、0.5%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取產(chǎn)自玉林大容山的八角茴香（含量為6.57%）的樣品6份，每份約1 g，置錐形瓶中，精密加入“2.1”項下混合對照品溶液0.5 ml，按“2.2”項下方法制備加樣回收樣品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件測定峰面積并計算回收率。結(jié)果莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的加樣平均回收率分別為102.5%、96.9%、101.6%、102.5%，RSD 值分別為1.5%、1.5%、1.1%、1.5%。表明加樣回收率符合要求，結(jié)果見表3。

2.10 樣品含量測定 取11 個產(chǎn)地八角茴香適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，含量測定結(jié)果見表4。

3 討 論

莽草酸是八角茴香的主要成分，其為水溶性成份［11］，因此采用水提取的方法能更好地提取分離出莽草酸。超聲波提取效率高，提取時間也大為減少，因此采用超聲波提取。

高效液相色譜法具有測量速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在藥學(xué)分析檢驗(yàn)中得以廣泛應(yīng)用［12］。本研究采用高效液相色譜法對八角茴香中4 種有機(jī)酸的含量進(jìn)行檢測，在預(yù)試驗(yàn)中，曾對色譜柱、柱溫、不同波長及流動相進(jìn)行考察。在色譜柱的選擇中，本研究選擇Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其適用于分離非極性的化學(xué)物質(zhì)。在柱溫的選擇中，分別考察了20 ℃、30 ℃、40 ℃，結(jié)果表明在40 ℃時柱壓較穩(wěn)定，分離效果最好。在波長的選擇中，考察并比較了213 nm［13］和254 nm［14］的波長，結(jié)果表明在254 nm處莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的吸收峰較213 nm處吸收峰大，且峰面積平穩(wěn)，因此，選擇254 nm作為測定波長。在流動相的選擇上，本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-3%磷酸水溶液等不同緩沖溶液，結(jié)果表明采用乙腈-3%磷酸水溶液作為流動相，通過梯度洗脫能得到較好的分離效果，且出峰時間較為理想。

本研究采用高效液相色譜法對八角茴香中莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸進(jìn)行測定，方法操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為八角茴香的質(zhì)量控制手段之一。