亞森江·買買提,買買提吐爾洪·吐爾遜,蘇婷,穆克達斯·阿布力提甫,祖力菲亞·阿吉木,徐紅

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心,烏魯木齊830001)

肌少癥是一種以運動能力降低和肌肉量減少為特征的疾病,該病可增加人們致殘和致死的風(fēng)險[1,2]。已知肌肉纖維在40歲后加速流失,到80歲時,肌肉將減少近30%,且難以有效治療,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3]。因此,亟待深入研究有效治療肌少癥的藥物。胸腺肽α1是一種從小牛胸腺中分離出來高度保守的小肽段[4],在不同的生理和病理條件下(如感染、癌癥、免疫缺陷、衰老),胸腺肽α1具有恢復(fù)體內(nèi)平衡的特殊能力,根據(jù)宿主的炎癥或免疫功能障礙狀態(tài),胸腺肽α1作為多任務(wù)蛋白發(fā)揮作用[5,6]。然而,胸腺肽α1對衰老導(dǎo)致的肌少癥的作用并不清楚。本研究在地塞米松誘導(dǎo)的成肌細胞肌管直徑減少模型和快速衰老型小鼠(SAMP8小鼠)中探討胸腺肽α1對肌肉生成和肌肉萎縮的治療作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

小鼠成肌細胞(C2C12)購于武漢普諾賽生物科技有限公司;地塞米松(dexamethasone, DEX)和胸腺肽α1購于美國Sigma公司;杜氏改良培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)和10%胎牛血清購于美國Gibco公司;30只無特定病原級別(specified pathogen free, SPF)的雄性SAMP8小鼠(28.20±1.80)g購于北京華阜康生物科技股份有限公司;Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司;小干擾RNA針對沉默p62的重組載體(p62沉默載體)購于上海吉瑪公司;細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)購于上海碧云天生物科技有限公司;SQSTM1/p62的第一抗體購于英國Abcam公司;肌球蛋白原D(myosinogen D, MyoD)、肌原細胞轉(zhuǎn)錄因子(myogenin, MyoG)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)、肌肉RING-指蛋白1(muscle ring-finger protein 1, MuRF1)、肌肉萎縮相關(guān)蛋白(muscle atrophy related protein, MAFbx)的第一抗體均購于英國Abcam公司,所有對應(yīng)的第二抗體均購于英國Abcam公司;TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司;聚偏二氟乙烯膜購于美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 C2C12的培養(yǎng)和分組 C2C12在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM,每2天更換一次培養(yǎng)基。為了誘導(dǎo)C2C12肌管形成,細胞在2%馬血清誘導(dǎo)下培養(yǎng)6d,然后將細胞分為4組,包括對照組(PBS處理)、地塞米松組(50μmol/L地塞米松處理)、地塞米松+胸腺肽α1組(50μmol/L地塞米松聯(lián)合50ng/ml胸腺肽α1處理)及地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組(50μmol/L地塞米松、50ng/ml胸腺肽α1、聯(lián)合p62沉默載體和Lipofectamine 2000混合處理),每組各處理24h。所有各組的細胞在37℃、5% CO2的穩(wěn)定環(huán)境中培養(yǎng)。用顯微鏡標(biāo)尺策略各組細胞肌管的直徑。

1.2.2 CCK-8檢測各組細胞的增殖活性 根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明,將處理好的對照組、地塞米松組、地塞米松+胸腺肽α1組的C2C12接種于96孔板(5×103個細胞/孔)中過夜,然后與10μl CCK-8溶液在37℃下反應(yīng)3h。隨后,用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度(相對OD值)來表示細胞活力。

1.2.3 快速衰老SAMP8小鼠治療和分組 將30只雄性SAMP8小鼠按照隨機數(shù)表法分為SAMP8組、SAMP8+胸腺肽α1組、胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組,每組10只。每組的處理方法如下:(1)SAMP8組的SAMP8小鼠接受靜脈注射PBS;(2)胸腺肽α1+SAMP8組的SAMP8小鼠靜脈注射10mg/kg的胸腺肽α1;(3)胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的SAMP8小鼠靜脈注射10mg/kg的胸腺肽α1和5μg/kg p62沉默載體。

所有動物每天注射1次,注射7d,第7天對每組小鼠進行瘦體質(zhì)量(lean body mass, LBM)和總體質(zhì)量的測量,隨后對所有動物進行安樂死,取小鼠比目魚肌組織用于Western blotting實驗檢測。本研究中所有的動物實驗通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審查號:202207024)。

1.2.4 Western blotting 用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)緩沖液裂解對照組、地塞米松組、地塞米松+胸腺肽α1組、地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組細胞和SAMP8組、SAMP8+胸腺肽α1組、p62沉默+胸腺肽α1+SAMP8組小鼠肌肉組織的勻漿液。用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)法定量提取液的濃度。將20μg蛋白樣品用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶密封1h。將膜與一抗在4°C孵育24h,一抗包括p62 (1∶1000)、MyoD (1∶1000)、MyoG (1∶1000)、MyHC (1∶1000)、MuRF1 (1∶1000)、MAFbx (1∶500)。將膜與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG (1∶2000)一起孵育1h。與HRP偶聯(lián)的二抗在37°C孵育2h。最后,應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)試劑顯示蛋白條帶,并用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胸腺肽α1對小鼠成肌細胞C2C12增殖活性的影響

與對照組(1.00±0.13)比較,地塞米松組的增殖活性(0.82±0.09)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與地塞米松組(0.82±0.09)比較,地塞米松+胸腺肽α1組增殖活性(1.46±0.17)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 胸腺肽α1通過激活自噬活性抑制性信號SQSTM1/ p62對小鼠成肌細胞肌管形成的影響

與對照組比較,地塞米松組中p62的表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組中p62的表達水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松+胸腺肽α1組比較,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組中p62的表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖1,表1)。

表1 4組小鼠成肌細胞中SQSTM1/p62表達水平的比較

圖1 Western blotting檢測自噬活性抑制信號SQSTM1/p62的表達Figure 1 Western blotting detection of the expression of autophagy inhibitory signal SQSTM1/p62GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.3 胸腺肽α1對小鼠成肌細胞肌管形成的影響

與對照組比較,地塞米松組的肌管直徑顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組肌管細胞形成的肌管直徑顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與地塞米松+胸腺肽 α1 組比較,地塞米松+胸腺肽 α1+p62沉默組的肌管直徑顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05; 表2)。

表2 4組小鼠成肌細胞所形成肌管直徑的比較

2.4 胸腺肽α1通過激活SQSTM1/p62信號對分化相關(guān)蛋白和肌少癥相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較,地塞米松組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著降低,而MuRF1和MAFbx的表達水平顯著增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著增加,而MuRF1和MAFbx表達水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松+胸腺肽α1組比較,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著降低,而MuRF1和MAFbx表達水平均顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖2,表3)。

表3 4組小鼠成肌細胞中MuRF1、MAFbx、MyoD、MyoG及MyHC表達的比較

圖2 C2C12細胞中細胞分化和肌少癥相關(guān)蛋白的表達Figure 2 Expression of proteins associated with cell differentiation and sarcopenia in C2C12 cells MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; MyoD: myosinogen D; MyoG: myogenin; MyHC: myosin heavy chain; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.5 胸腺肽α1通過激活自噬活性抑制信號SQSTM1/p62抑制SAMP8快速衰老小鼠的肌少癥

與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的p62顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的p62顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的瘦體質(zhì)量(lean body mass, LBM)/體質(zhì)量(body mass, BM)占比顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的LBM/BM占比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的MuRF1和MAFbx的表達水平顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的MuRF1和MAFbx的表達水平顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05;圖3,表4)。

表4 胸腺肽α1治療后SAMP8小鼠中p62和肌少癥相關(guān)蛋白MuRF1、MAFbx的相對表達水平

圖3 Western blotting檢測胸腺肽α1治療后SAMP8小鼠中p62和肌少癥相關(guān)蛋白MuRF1、MAFbx的表達Figure 3 Western blotting analysis of p62 and sarcopenia related proteins MuRF1 and MAFbx in SAMP8 mice after thymosin α1 treatment MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

3 討 論

骨骼肌占人體質(zhì)量的40%以上,在生命中承擔(dān)著重要的體力、能量消耗和代謝任務(wù),但是衰老引起的肌肉萎縮和減少導(dǎo)致活動能力下降、跌倒的風(fēng)險增加,最終影響生活質(zhì)量;因此,肌肉萎縮也會增加肌少癥發(fā)病率和死亡率[7]。此外,作為重要的內(nèi)分泌器官,肌肉功能障礙也可引起肝臟和脂肪代謝紊亂。因此,預(yù)防或延緩肌肉萎縮的發(fā)生非常重要。然而,肌少癥目前還沒有有效的治療方法[8]。在本研究中,胸腺肽α1在體內(nèi)和體外均能有效改善肌少癥相關(guān)特征;其中胸腺肽α1可以逆轉(zhuǎn)因地塞米松誘導(dǎo)所導(dǎo)致的成肌細胞肌管直徑減少,上調(diào)成肌相關(guān)蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達。而在體內(nèi),胸腺肽α1顯著抑制了衰老小鼠的肌少癥相關(guān)蛋白MuRF1、MAFbx的表達并提高了小鼠瘦體質(zhì)量在總體質(zhì)量中的占比。這說明胸腺肽α1改善了衰老導(dǎo)致的肌少癥。

地塞米松是一種常見的糖皮質(zhì)激素藥物,用于治療多種炎癥性疾病[9]。糖皮質(zhì)激素對骨骼肌的作用是一把雙刃劍。一方面,糖皮質(zhì)激素通過協(xié)調(diào)葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝來維持代謝平衡;另一方面,長期和高劑量使用糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致許多被動效應(yīng),包括肌少癥[10,11]。在使用類固醇藥物超過4周的患者中,非炎癥肌病的發(fā)生率超過50%[12]。由于導(dǎo)致肌少癥的病因的多因素變化,肌少癥的潛在發(fā)病機制尚不完全清楚。目前的研究發(fā)現(xiàn),地塞米松誘導(dǎo)活性氧上調(diào),通過糖皮質(zhì)激素受體激活泛素-蛋白酶體和溶酶體途徑,導(dǎo)致肌肉萎縮[13]。本研究中,給藥地塞米松導(dǎo)致成肌細胞的肌管直徑減少,且肌少癥相關(guān)蛋白MuRF1和MAFbx的表達都顯著增加,這表明體外地塞米松處理成肌細胞可以形成肌少癥的細胞特征。另外,地塞米松組中成肌相關(guān)蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達明顯減少,而當(dāng)單獨使用胸腺肽α1治療后,肌管直徑和成肌相關(guān)蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達都明顯增加,而肌少癥相關(guān)蛋白MuRF1和MAFbx的表達都減少。已知MyoD、MyoG、MyHC等是肌生成的標(biāo)志物和關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。MuRF1和MAFbx則是與肌肉萎縮相關(guān)的蛋白,研究表明,MuRF1和MAFbx水平在肌少癥的早期上調(diào),并在整個肌肉萎縮期保持高水平。MuRF1和MAFbx的敲除對小鼠去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的肌肉萎縮具有保護作用[15,16]。這表明了地塞米松誘導(dǎo)的體外肌少癥可以被胸腺肽α1所部分逆轉(zhuǎn)。

自噬是真核生物細胞質(zhì)中極為保守的分解代謝過程,異常細胞器被轉(zhuǎn)運到溶酶體中降解,進行細胞器的再循環(huán)和更新。因此,自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)所必需的,在代謝、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起著重要作用[17]。已有研究表明,自噬的功能狀態(tài)與骨骼肌萎縮密切相關(guān),自噬過度和自噬不足均可導(dǎo)致肌肉萎縮[18]。本研究檢測到無論地塞米松誘導(dǎo)成肌細胞還是SAMP8快速衰老小鼠,只要經(jīng)過胸腺肽α1的治療,均可以顯著提高自噬活性抑制信號SQSTM1/p62的表達。而當(dāng)沉默p62后,則逆轉(zhuǎn)了因胸腺肽α1治療對MyoD、MyoG、MyHC的表達促進作用,并且明顯抑制小鼠的MuRF1和MAFbx的表達以及顯著減少LBM在總體質(zhì)量中的占比。這表明,抑制細胞自噬的活性是胸腺肽α1治療肌少癥中必不可少的過程。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)胸腺肽α1能有效抑制肌管和肌肉萎縮。進一步的機制探索證實,胸腺肽α1通過激活成肌細胞和衰老小鼠體內(nèi)的自噬活性抑制的信號SQSTM1/p62從而發(fā)揮改善肌少癥的作用。本研究為衰老導(dǎo)致的肌少癥提供了有前途的治療靶點。