余慧，李臻，王佳

0 引言

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率排婦科惡性腫瘤第2位，死亡率居婦科惡性腫瘤首位[1]。臨床上一線治療方式是腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合化療，新興治療方式還有免疫治療和靶向治療[2]。大多數(shù)患者確診時已達腫瘤晚期，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移并易復發(fā)，預后極差[2]。因此，亟需探索新的治療方案以改善卵巢癌患者的預后。二甲雙胍是一種常用的降糖藥，基于人群的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在糖尿病患者的治療中對癌癥發(fā)生發(fā)展有一定程度的保護作用，可降低癌癥發(fā)病風險和癌癥相關(guān)死亡率[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)接受過二甲雙胍/胰島素治療的患者卵巢癌發(fā)病率低于未接受過二甲雙胍及胰島素治療的女性[6]。一項Meta分析顯示使用二甲雙胍的糖尿病患者其卵巢癌患病風險降低，因此推測二甲雙胍具有潛在預防卵巢癌的作用[7]。但是二甲雙胍的抗癌機制尚不明確。有研究表明，二甲雙胍主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）通路而改變腫瘤細胞的代謝進而抑制卵巢癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8]。CXCR4為趨化因子家族成員中的主要研究靶點，在多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中也起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在卵巢癌中高表達，參與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移，并調(diào)控Wnt/β-catenin通路[9]。因此本研究擬探討二甲雙胍對卵巢癌細胞的體外抗腫瘤作用，及其是否對AMPK、CXCR4、Wnt/β-catenin通路產(chǎn)生影響，從而為二甲雙胍應用于卵巢癌的臨床治療提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌細胞株SKOV3、A2780（中國科學院細胞庫，上海），CAOV3（吉凱基因，上海），DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（Gemini，澳達利亞）。二甲雙胍購自美國MCE公司，溶于無菌PBS中，儲存液濃度為500 mmol/L。MTT購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Millipore公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國賽默飛公司。兔抗mTOR（#2983）、p-mTOR（#5536）、AMPK（#5831）、p-AMPK（#2535）均購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗CXCR4（ab181020）、Dvl3(ab76081)、β-catenin（ab32572）均購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SKOV3和CAOV3使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，A2780細胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，2～3天換液，待細胞融合至80%～90%，用0.25%胰酶消化傳代。

1.3 MTT實驗

將200 μl細胞懸液種于96孔板（5×103個/孔），過夜細胞貼壁后，將不同濃度的二甲雙胍溶液（5、10、15、20、25、35、40、50和60 mmol/L）加入每孔中，同時正常培養(yǎng)基設為對照組，每組5個復孔。藥物孵育24、48和72 h后取出96孔板，加入MTT溶液（終濃度0.5 mg/ml）后置于培養(yǎng)箱孵育3 h，吸凈孔中溶液，加入200 μl DMSO，振蕩器振蕩10 min。酶標儀490 nm波長下測吸光度。細胞相對存活率=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.4 平板克隆實驗

將細胞懸液以1×103個/孔接種至6孔板，過夜細胞貼壁后，加入不同濃度二甲雙胍（5、10 mmol/L），每3天換液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周，待肉眼可見明顯細胞集落后，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次，室溫干燥后拍照，統(tǒng)計集落形成個數(shù)。實驗重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

藥物處理24 h后，用無EDTA胰酶消化細胞，收集細胞，1 500 r/min離心5 min，預冷PBS洗3次，70%乙醇4℃固定細胞過夜，PBS洗2次，加入RnaseA（50 μg/ml）孵育15 min，加入PI（50 μg/ml）避光孵育15 min，PBS重懸上流式細胞儀（美國BD公司）。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

藥物處理24 h后，收集細胞中的培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶將細胞消化下來，中止消化，收集細胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗3次，加入FITC Annexin V和PI，輕輕混勻，避光孵育15 min，同時設置空白對照組。再加入1×緩沖液，重懸后上流式細胞儀。

1.7 劃痕實驗

將細胞懸液種于6孔板，待細胞融合至100%，用200 μl槍頭在單層細胞中垂直劃過，形成劃痕，PBS洗去漂浮細胞，加入含有不同濃度二甲雙胍（5、10 mmol/L）的無血清培養(yǎng)基，間隔12 h拍照觀察劃痕愈合情況，直至劃痕完全愈合。用Image J計算劃痕愈合面積進行對比。

1.8 Transwell實驗

下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，輕輕放入小室，將200 μl無血清培養(yǎng)基重懸的細胞懸液（5×104個）加入小室內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗，用棉簽小心擦拭小室內(nèi)表面的細胞，室溫晾干后于顯微鏡下拍照，計數(shù)。

1.9 Western blot實驗

藥物處理48 h后，冰化PBS清洗3次，冰上用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細胞15 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒進行蛋白定量，其余上清中加入上樣緩沖液沸水煮10 min使蛋白變性。將20 μg蛋白在凝膠電泳系統(tǒng)中分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜上，牛奶室溫封閉4 h，根據(jù)分子marker裁剪膜，分別置于一抗中孵育過夜。第二天用TBST洗膜3次后，室溫孵育二抗1 h，再次洗膜3次，用ECL化學免疫發(fā)光液浸染條帶置于Bio-Rad成像系統(tǒng)顯影。

1.10 qRT-PCR實驗

藥物處理24 h后，按照FAST 200試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）的說明書提取細胞RNA，并用酶標儀在260 nm下定量RNA濃度。用Prime Script RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，與CXCR4引物（Forward Primer: ACTACACCGAGGAAATGGGCT，Reverse Primer: CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA）和SYBR-Green PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）進行擴增，利用CFX96 Real-time PCR系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）對CXCR4的表達進行檢測?；虻谋磉_量用2-ΔΔCT法計算，并以對照組進行標化。

1.11 統(tǒng)計學方法

組間比較使用t檢驗和One-way ANOVA，使用GraphPad Prism 8進行作圖及統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞的增殖

M T T 實驗評估二甲雙胍對卵巢癌細胞（A2780、CAOV3、SKOV3）的細胞毒性，結(jié)果顯示，二甲雙胍對卵巢癌細胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量及時間相關(guān)性。A2780細胞24小時IC50為91.5 mmol/L，48小時IC50為16.36 mmol/L，見圖1A；CAOV3細胞24小時IC50為78.2 mmol/L，48小時IC50為36.65 mmol/L，見圖1B；SKOV3細胞24小時IC50為78.25 mmol/L，48小時IC50為43.44 mmol/L，見圖1C。同時，二甲雙胍對單個卵巢癌細胞的克隆形成能力具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，見圖1D、1E。

圖1 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞的增殖(A, B, C)及克隆形成能力(D, E)Figure 1 Metformin inhibited proliferation(A, B, C) and cloning ability(D, E) of ovarian cancer cells

2.2 二甲雙胍導致卵巢癌細胞周期阻滯

二甲雙胍導致卵巢癌細胞周期阻滯，細胞阻滯于G0/G1期，見圖2A。同時通過Western blot檢測周期蛋白Cyclin D1和CDK1的表達，與對照組相比，10、20和40 mmol/L的二甲雙胍處理CAOV3和SKOV3細胞48小時后，Cyclin D1和CDK1表達水平降低，見圖2B、C。

圖2 二甲雙胍導致卵巢癌細胞周期G0/G1期阻滯(A)并抑制周期蛋白(CyclinD1, CDK1)的表達(B, C)Figure 2 Metformin induced G0/G1 phase arrest of ovarian cancer cell cycle(A) and inhibited expression of cyclin (cyclin D1 and CDK1) (B, C)

2.3 二甲雙胍誘導卵巢癌細胞凋亡

用Annexin V-FITC/PI對卵巢癌細胞進行染色后，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞。不同濃度的二甲雙胍處理細胞24小時后，與對照組相比均可明顯促進細胞凋亡，見圖3。

圖3 二甲雙胍誘導卵巢癌細胞凋亡Figure 3 Metformin induced apoptosis of ovarian cancer cells

2.4 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞的遷移

選取增殖抑制率不超過10%的藥物濃度進行劃痕實驗，觀察二甲雙胍對卵巢癌細胞遷移能力的影響。劃痕處理24小時后，對照組的劃痕區(qū)域被細胞覆蓋（99.44%），空白劃痕面積減小，二甲雙胍組的劃痕區(qū)域面積仍較大，說明經(jīng)二甲雙胍處理后的A2780細胞遷移能力減弱，且10 mmol/L的遷移抑制（24.26%,P=0.0051）較5 mmol/L（30.47%,P=0.0067）明顯；劃痕處理48小時后，對照組的劃痕區(qū)域被細胞覆蓋（69.59%），空白劃痕區(qū)域面積減小，而二甲雙胍處理的細胞劃痕創(chuàng)面仍較大，說明經(jīng)二甲雙胍處理后的SKOV3細胞遷移能力減弱（P=0.0172），見圖4A。

圖4 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞遷移Figure 4 Metformin inhibited migration of ovarian cancer cells

通過Transwell實驗也觀察到同樣的現(xiàn)象：與對照組相比，二甲雙胍處理24小時后，穿過Transwell小室的卵巢癌細胞較少，說明二甲雙胍明顯抑制卵巢癌細胞的遷移能力（P＜0.01），見圖4B、4C。

2.5 二甲雙胍抑制卵巢癌細胞增殖、遷移的機制

Western blot結(jié)果證明二甲雙胍可以激活AMPK的磷酸化，抑制mTOR的磷酸化，抑制Dvl3和β-catenin及CXCR4的表達，見圖5。

圖5 二甲雙胍對卵巢癌細胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/ mTOR、Dvl3、β-catenin及CXCR4蛋白表達水平的影響Figure 5 Effect of metformin on expression levels of p-AMPK/AMPK,p-mTOR/mTOR, Dvl3, β-catenin, and CXCR4 in ovarian cancer cells

二甲雙胍處理CAOV3細胞24小時后，提取RNA進行RT-qPCR檢測CXCR4 mRNA的變化，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平二甲雙胍抑制CXCR4的表達（P=0.0296），見圖6。

圖6 二甲雙胍對CAOV3細胞CXCR4 mRNA表達水平的影響Figure 6 Effect of metformin on expression level of CXCR4 mRNA in CAOV3 cells

3 討論

在體外細胞培養(yǎng)模型中，二甲雙胍可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，包括乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌[10-13]。既往研究表明，二甲雙胍通過直接作用和間接作用發(fā)揮抗癌潛能：通過抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ降低腫瘤細胞的能量消耗直接抑制腫瘤生長，也可以通過降低空腹血漿胰島素水平并增加骨骼肌葡萄糖攝取來減弱胰島素抵抗，抑制腫瘤細胞的有絲分裂和生長而發(fā)揮間接抗癌作用[14]。這些抗癌作用都是通過細胞能量監(jiān)測器AMPK介導的，AMPK的活化是二甲雙胍發(fā)揮抗癌作用的主要效應分子[15]。AMPK依賴性抑制mTOR信號對腫瘤細胞的生長和增殖至關(guān)重要，是目前雙胍類藥物研究最多的抗腫瘤機制[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過抑制CyclinD1而抑制前列腺癌的細胞增殖[11]。二甲雙胍還可以通過卵巢癌細胞的AMPK/GSK3β軸誘導CyclinD1降解而導致細胞周期發(fā)生G1期阻滯[16]，通過促進Parkin誘導的P53泛素化而抑制卵巢癌細胞生長[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以有效抑制卵巢癌A2780、CAOV3、SKOV3的增殖、遷移，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，在細胞水平發(fā)揮抑制腫瘤惡性行為的作用，還說明了二甲雙胍可降低卵巢癌細胞中CXCR4蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的表達。CXCR4屬于趨化因子受體的CXC家族，可以被單一配體CXCL12特異性激活[18]。低氧條件下，癌細胞產(chǎn)生的CXCL12與內(nèi)皮細胞表面的CXCR4相互作用可能會增強卵巢癌的血管生成[18]。Scotton等在卵巢癌細胞中檢測了14種趨化因子受體，其中CXCR4是唯一表達于卵巢癌細胞的趨化因子受體[19]。我們的前期研究結(jié)果顯示卵巢癌組織中CXCR4 mRNA的表達顯著高于正常卵巢組織[9,20]。多項研究表明CXCR4在卵巢癌組織中高表達，且是上皮性卵巢癌患者的獨立預后因素，CXCR4表達水平高預示著卵巢癌的預后較差[9,21-23]。CXCR4在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有促進腫瘤細胞遷移、侵襲及EMT轉(zhuǎn)化的作用，有望成為治療靶標[24-26]。因此，二甲雙胍降低卵巢癌細胞中CXCR4的水平，可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的原因。有研究報道二甲雙胍在杜氏肌營養(yǎng)不良癥的動物模型中可以降低CXCL12和CXCR4的水平[27]，還可以顯著降低成纖維細胞中CXCR4的表達[28]。Dirat等[29]提出二甲雙胍通過降低CXCR4的表達而抑制前列腺癌細胞的遷移。但二甲雙胍單獨作用時并不影響乳腺癌細胞中CXCR4蛋白的變化，僅在與熊果酸協(xié)同作用時才下調(diào)CXCR4的表達從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移[30]。本研究進一步拓展了二甲雙胍在不同疾病模型中對CXCR4的影響形式。

總之，本研究提示二甲雙胍可以抑制卵巢癌細胞的增殖，且呈時間-濃度依賴性。二甲雙胍可以誘導細胞發(fā)生周期阻滯和細胞凋亡，并抑制細胞的遷移能力。本研究進行了二甲雙胍發(fā)揮作用的初步機制探討，這些作用可能是通過激活AMPK磷酸化、抑制mTOR磷酸化、抑制CXCR4的表達及Wnt/β-catenin通路來實現(xiàn)的，具體作用機制還需要進一步研究。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。