張丹，張昊，何俐

0 引言

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，全球每年有超過30萬例的OSCC新發(fā)病例，超過14萬例患者死于OSCC[1]。目前，化療仍是控制口腔癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后的重要輔助手段之一，但化療耐藥是口腔癌生存率無明顯改善的原因之一。降低化學(xué)藥物的毒副作用、克服腫瘤細(xì)胞耐藥、是口腔癌臨床診療亟待解決的問題，新藥研發(fā)或藥物再利用已成為OSCC治療領(lǐng)域的主要研究方向。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin, DHA）是菊科植物黃花蒿的生物活性成分，具有抗瘧、抗炎、抗內(nèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[2]。近年來，DHA的抗腫瘤性能得到關(guān)注，越來越多的證據(jù)證實了DHA的抗腫瘤特性。在口腔癌中，Chen等研究發(fā)現(xiàn)DHA通過預(yù)防M2巨噬細(xì)胞極化和阻斷STAT3磷酸化，對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、遷移和血管生成均有抑制作用[3-5]。然而目前相關(guān)的研究較少，DHA對于口腔癌具體的抗癌機制和作用靶點仍有待進(jìn)一步探索。本實驗將探究DHA對口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞增殖能力的影響及其可能機制，為其將來應(yīng)用于口腔鱗癌治療提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27購于湖南豐暉生物科技有限公司。高糖培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶購于美國Hyclone公司。雙氫青蒿素、3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）、雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）購于上海麥克林生物科技有限公司。Anti-PCNA、Anti-Beclin-1、Anti-LC3B/MAP1LC3B和Anti-β-actin均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CAL27細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測CAL27細(xì)胞的增殖 將CAL27細(xì)胞（8×103個/孔）接種于96孔板中，用指定濃度的DHA（0、25、50、100、200 μmol/L）處理細(xì)胞。DHA分別干預(yù)24 h和48 h后，加入CCK-8試劑，檢測吸光度，計算各組細(xì)胞增殖抑制率及24 h的IC50值。后續(xù)實驗分為六組：DHA組、3-MA組、DHA +3-MA組、RAPA組、DHA+RAPA組和空白對照組。

1.2.3 平板集落實驗 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1 000個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)12 h，DHA處理。每4 d更換1次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14 d。棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次。隨后，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，瑞氏-姬姆薩染色5 min。在顯微鏡下計數(shù)各組CAL27細(xì)胞（大于50個細(xì)胞）集落數(shù)。集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 免疫印跡法 不同濃度DHA作用于CAL27細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌至少2次，并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解。收集上清液進(jìn)行免疫印跡檢測。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，膜與特定一抗在4℃孵育過夜。TBST洗膜三次，辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔或抗鼠抗體室溫孵育2 h。然后TBST清洗膜三次，并使用ChemiDocTMMP成像系統(tǒng)和增強化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒獲取圖像。

1.2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)分析 將源自PubChem在線平臺的雙氫青蒿素2D結(jié)構(gòu)提交到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，預(yù)測DHA作用靶點；利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫對人類基因組的數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，以 “oral squamous cell carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索OSCC相關(guān)基因，與DHA作用的靶基因進(jìn)行比對，最終篩選獲得DHA與OSCC相關(guān)的交集靶點并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)對每個節(jié)點的邊數(shù)相加，預(yù)測PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。最后，利用OSCC和DHA的交集靶點進(jìn)行功能富集和通路分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析One-way ANOVA，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。實驗至少均獨立重復(fù)三次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對OSCC細(xì)胞增殖的影響

在同一時間段內(nèi)，隨著DHA藥物濃度的升高，DHA對CAL27細(xì)胞的抑制率也在不斷升高。根據(jù)結(jié)果計算得出DHA處理CAL27細(xì)胞的24 h和48 h的IC50值分別為148.3 μmol/L和123.7 μmol/L，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)24 h的IC50值設(shè)置實驗組DHA濃度為148.3 μmol/L。平板集落實驗結(jié)果顯示：與空白對照組比較，DHA（25、50、100、200 μmol/L）組CAL27細(xì)胞的集落形成數(shù)均顯著降低（P＜0.0001），見圖1。結(jié)果表明，DHA可以抑制CAL27細(xì)胞的增殖活性。

圖1 CCK-8法和平板集落實驗法檢測DHA對CAL27細(xì)胞增殖調(diào)控作用Figure 1 Inhibitory effect of DHA on proliferation of CAL27 cells determined by CCK-8 and plate colony assays

2.2 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找OSCC中潛在的DHA靶點

利用公共數(shù)據(jù)庫探索OSCC中潛在的DHA靶點，分別收集了6 962個人OSCC靶基因和369個DHA的藥物靶點，取交集后，獲得了287個共有靶基因（圖請掃描本文OSID碼），將其導(dǎo)入到字符串構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過對一個節(jié)點的邊數(shù)相加，ALB、AKT1和EGFR等被鑒定為參與該通路的前30個核心基因。DHA和OSCC共同靶點的GO和KEGG分析為了確定相關(guān)的途徑和功能，富集的生物特性過程、細(xì)胞成分和分子功能的靶蛋白，主要與激酶活性、肌細(xì)胞增殖、蛋白有關(guān)激酶活性等相關(guān)。此外，KEGG分析顯示這些靶點主要富集信號通路中前10位包括PI3K-AKT信號通路、FoXO信號通路等，其中PI3K/Akt通路在自噬活性的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。

2.3 雙氫青蒿素誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞自噬抑制增殖

不同濃度DHA（25、50、100、200 μmol/L）處理CAL27細(xì)胞24 h后收集蛋白。與空白對照組相比，DHA處理后，增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)水平降低，而自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ和Beclin-1表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖2。

圖2 Western blot法檢測DHA對CAL27細(xì)胞增殖和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 2 Western blot detection of effect of DHA on expression of proliferation- and autophagy-related proteins in CAL27 cells

2.4 自噬阻斷劑3-MA逆轉(zhuǎn)DHA誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，DHA組（148.3 μmol/L）CAL27細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白表達(dá)水平降低（P=0.000007），而自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.035528和P＜0.0001）。與DHA組（148.3 μmol/L)比較， DHA+3-MA組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達(dá)水平明顯下降（P=0.002993,P=0.000623），而PCNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.037551），見圖3。表明自噬阻斷劑3-MA在一定程度上通過阻斷雙氫青蒿素誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞自噬拮抗對細(xì)胞活力的增殖抑制效應(yīng)。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測3-MA和RAPA聯(lián)合DHA對CAL27細(xì)胞增殖和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用Figure 3 Western blot analysis of effect of 3-MA and RAPA combined with DHA on expression of proliferation- and autophagy-related proteins in CAL27 cells

2.5 自噬阻斷劑3-MA逆轉(zhuǎn)DHA導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，DHA組（148.3 μmol/L）CAL27細(xì)胞的存活率和集落形成數(shù)明顯下降（P＜0.0001）。而與DHA組（148.3 μmol/L）比較，DHA+3-MA組細(xì)胞的存活率和集落形成數(shù)明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖4。表明自噬阻斷劑3-MA在一定程度上恢復(fù)了DHA抑制的CAL27細(xì)胞活性。結(jié)果表明DHA通過誘導(dǎo)自噬抑制細(xì)胞生長。

圖4 CCK-8法(A) 和平板集落實驗法(B, C)檢測3-MA和RAPA聯(lián)合DHA對CAL27細(xì)胞增殖調(diào)控作用Figure 4 Regulatory effect of 3-MA and RAPA combined with DHA on proliferation of CAL 27 cells determined by CCK-8(A) and plate colony assays(B, C)

3 討論

雙氫青蒿素是青蒿素的主要活性代謝產(chǎn)物，是一種一線抗瘧疾藥物。雖然已有較多研究證實DHA對多種實體瘤可發(fā)揮抗癌作用[6-9]，但其對OSCC的抗腫瘤作用目前相關(guān)報道較少。基于此，本研究首先通過CCK-8試驗篩選出DHA的濃度范圍，并進(jìn)一步通過CCK-8和平板克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)DHA可以明顯抑制CAL27細(xì)胞的增殖活力和克隆形成能力，且具有良好濃度依賴性。先前的研究表明，DHA在抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡方面的作用在各種實驗?zāi)Ｐ椭幸延袌蟮?，但其潛在的分子機制尚不清楚[10-12]?；诖耍狙芯繉ζ湟种圃鲋车臋C制進(jìn)行了初步探索。

本研究構(gòu)建了DHA和OSCC的共同靶點網(wǎng)絡(luò)，并通過GO和KEGG分析了其主要基因的功能。其中，AKT1、MAPK3是重要的靶點，而PI3K/AKT信號通路是重要的信號通路。PI3K/Akt通路被認(rèn)為是分解代謝過程中的重要參與者，在自噬活性的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[13-15]。自噬是一個復(fù)雜的細(xì)胞過程，細(xì)胞降解衰老的和有缺陷的細(xì)胞成分，以滿足其代謝需求[16]。在正常的生理條件下，自噬的基礎(chǔ)水平對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、發(fā)育和代謝平衡至關(guān)重要。自噬失調(diào)與許多病理學(xué)疾病有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、感染性疾病和癌癥[17-19]。

基于以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)的篩選結(jié)果，本研究進(jìn)一步探索DHA抗口腔癌細(xì)胞增殖的可能自噬機制。當(dāng)用梯度濃度的DHA干預(yù)CAL27后，細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)減少，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達(dá)量顯著增多，說明DHA處理可誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞中自噬的發(fā)生。為了驗證自噬是否進(jìn)一步抑制增殖，本研究利用3-MA和RAPA增強或阻斷DHA誘導(dǎo)的自噬，通過CCK-8和平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖活力，Western blot檢測自噬及增殖相關(guān)蛋白指標(biāo)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，與DHA組相比，DHA和3-MA聯(lián)合處理組中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)和LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化水平均降低，而DHA和3-MA聯(lián)合使用的細(xì)胞反映出更高的細(xì)胞活性。以上結(jié)果表明，自噬抑制劑可逆轉(zhuǎn)雙氫青蒿素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬進(jìn)而導(dǎo)致增殖抑制。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)通過體外實驗對DHA在口腔癌中的抗癌作用進(jìn)行了探索。數(shù)據(jù)表明，DHA可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，可能與通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)，其在口腔癌治療方面具有一定的潛力，然而，目前相關(guān)的研究仍較少，未來仍需要進(jìn)一步的研究來揭示DHA的抗癌性能及機制，為其實現(xiàn)臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。