劉瑞雪，李德生，張力為

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054)

2020年國際癌癥研究中心的研究報告顯示，食管癌居世界惡性腫瘤發(fā)病率第8位，死亡率第6位[1]。食管癌的發(fā)病有明顯的地域和種族差異[2]，我國是食管癌的高發(fā)區(qū)，占全球新發(fā)病例的50%以上，90%以上是鱗狀細胞癌[3]。新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率為68/10萬，死亡率是生活在同一地區(qū)漢族或其他少數(shù)民族的3～4 倍，遠遠超過全國和世界的平均水平，被列為新疆特高發(fā)腫瘤之一[4]。目前我國食管癌的術(shù)后5年生存率雖然較以往有所提高，但仍然不超過30%～40%[5]。癌細胞在脂質(zhì)合成及脂質(zhì)氧化等方面發(fā)生了特定改變[6]。作為代謝組學(xué)的一個獨立分支，脂質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在各類腫瘤研究中識別和量化脂質(zhì)，以揭示癌癥進展的關(guān)鍵驅(qū)動因素[7]。靶向定量脂質(zhì)組學(xué)有助于檢測特定物質(zhì)的精確濃度，有助于為潛在的生物標(biāo)志物和藥物靶點的發(fā)現(xiàn)提供多樣化的數(shù)據(jù)[8]。所以，針對我區(qū)哈薩克族食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的種族特點，本研究擬使用哈薩克族ESCC 患者血清樣本通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)進行靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，旨在探究新疆哈薩克族ESCC 患者的脂質(zhì)代謝特征，進一步篩選出可能影響哈薩克族ESCC 患者疾病進展的脂質(zhì)代謝標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科進行食管癌根治術(shù)的哈薩克族患者30 例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷為食管鱗狀細胞癌，作為ESCC 組。另外選擇同期在新疆醫(yī)科大學(xué)健康管理中心體檢的哈薩克族健康體檢者30例為對照組。本研究已獲新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(K202304-04)，所有受試者在研究開始前均已簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

ESCC 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行食管癌根治術(shù)的哈薩克族患者；②術(shù)后病理學(xué)診斷為食管鱗狀細胞癌；③無心腦血管等慢性疾??；④無代謝性疾病。ESCC 組排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其它腫瘤病史；②標(biāo)本采集前有放化療病史；③長期口服影響機體代謝的研究對象；④素食者。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①在新疆醫(yī)科大學(xué)健康管理中心體檢的哈薩克族健康成人，體檢結(jié)果無異常；②無代謝性疾病。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①體檢發(fā)現(xiàn)有甲狀腺疾病，高血壓及糖尿病等影響機體代謝的疾??；②孕婦、哺乳期婦女及經(jīng)期女性；③素食者。

1.3 樣品采集和制備

采集所有受試對象的晨間空腹(至少空腹8 h)靜脈血5 mL，4 ℃靜置2 h后3 000g離心15 min(離心半徑為16 cm)，取上清液用于臨床血清生化及血脂檢測，剩余血清樣本于-80 ℃冰箱凍存。取10 μL 的血清樣本混入480 μL 的脂質(zhì)提取液(甲基叔丁基醚和甲醇按體積比5∶1 混和)，將樣品4 ℃，3 000g離心15 min，取上清液250 μL，重新加入250 μL 甲基叔丁基醚，超聲10 min 后，再次將樣品4 ℃，3 000g離心15 min，取上清液250 μL，重復(fù)上述步驟1 次，最后取30 μL上清液于進樣瓶中上機檢測。

1.4 UPLC-MS/MS檢測

使用SCIEX ExionLC 超高效液相色譜儀，通過液相色譜柱對目標(biāo)化合物進行色譜分離。液相色譜A相為40%水和60%乙腈溶液，其中含10 mmol/L 乙酸銨；B 相為10%乙腈，90%異丙醇溶液，其中含10 mmol/L 乙酸銨。流動相流速0.3 mL/min，柱溫45 ℃，樣品盤溫度6 ℃，進樣體積2 μL。數(shù)據(jù)采集時，以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行質(zhì)譜分析。AB Sciex QTrap 6500 質(zhì)譜儀器參數(shù)如下：離子噴霧電壓：+5 500/-4 500 V，氣簾氣流速：40 psi，離子源溫度：350 ℃，離子源氣體壓力1∶50 psi，離子源氣體壓力2∶50 psi。

1.5 統(tǒng)計分析

首先通過LipidSearch、Metlab 軟件對原始數(shù)據(jù)進行采集匯總、歸一和濾噪等處理。采用Biobud-v軟件對所有目標(biāo)化合物進行定量分析，根據(jù)每個樣品脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)峰面積和實際濃度關(guān)系計算出每個脂質(zhì)相對于該內(nèi)標(biāo)的絕對濃度。接著使用SIMCA軟件對代謝組數(shù)據(jù)進行對數(shù)(Log)轉(zhuǎn)換加UV 格式化處理，然后進行單變量統(tǒng)計分析和多元變量統(tǒng)計分析，包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)、脂質(zhì)組成分析及脂質(zhì)鏈長和不飽和度等項目分析。最后，利用OPLS-DA模型中的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)識別兩組間的明顯差異的代謝物，對于VIP＞1.0 和P＜0.05 的代謝物被認(rèn)為是顯著差異的代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 兩組人群一般資料和血生化指標(biāo)比較

ESCC 患者和健康對照人群的一般資料和血生化指標(biāo)的檢測結(jié)果見表1，ESCC 組患者血清總膽固醇、總蛋白、白蛋白低于對照組(P＜0.05)。兩組年齡、性別、甘油三酯、總膽汁酸、HDL-C、LDL-C比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 ESCC患者和健康對照人群的一般資料和血生化指標(biāo)的檢測結(jié)果

2.2 多元統(tǒng)計分析

通過SIMCA 軟件對ESCC 患者及對照組整理好的代謝組數(shù)據(jù)進行對數(shù)(Log)轉(zhuǎn)換，然后對其進行PCA和OPLS-DA 分析。結(jié)果提示兩組間存在分離趨勢(圖1A)。OPLS-DA 分析獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實驗組的相關(guān)程度信息(圖1B)。從OPLS-DA得分圖的結(jié)果可以看出，樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。根據(jù)OPLS-DA，可以計算出每個代謝物的VIP值，這是篩選差異代謝物的重要參數(shù)之一。

圖1 ESCC組和正常對照組PCA及OPLS-DA分析得分散點圖

2.3 哈薩克族ESCC患者的脂類組成分析

根據(jù)脂類頭部基團，將脂質(zhì)進一步分為多個亞類。通過Biobud-v軟件對所有目標(biāo)化合物進行脂質(zhì)定量分析，結(jié)果提示總體樣本中檢測到脂質(zhì)化合物及各亞類共計13 類，其中濃度最高的化合物是甘油三酯，見圖2A。通過計算同一樣品中各脂質(zhì)亞類濃度總和定量其總濃度，結(jié)果提示ESCC 中溶血磷脂酰膽堿(LPC)，磷脂酰乙醇胺(PE)的濃度顯著降低(P＜0.05)，神經(jīng)酰胺(Cer)的相對濃度明顯升高(P＜0.05)，雖然游離脂肪酸(FFAs)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿(PC)、二氫神經(jīng)酰胺(DCER)、己糖基神經(jīng)酰胺(HCER)、乳糖基神經(jīng)酰胺(LCER)、鞘磷脂(SM)及膽固醇酯(CE)的總濃度在兩組間無明顯差異，結(jié)果見圖2B(P＞0.05)。但FFA、DG、TAG、LPC、LPE、PC、PE及SM的主要種類在兩組間差異明顯(P＜0.05)，見圖3。

圖2 ESCC組與正常對照組的脂質(zhì)篩選及脂質(zhì)亞類濃度的差異

圖3 ESCC組與正常對照組血清樣本中脂質(zhì)亞類濃度的差異分析

2.4 哈薩克族ESCC 患者血清中的差異脂質(zhì)代謝物的篩選

我們以P＜0.05，VIP＞1 的標(biāo)準(zhǔn)進行差異脂質(zhì)代謝物篩選，共篩選出249種差異脂質(zhì)代謝物，其中79種上調(diào)，170種下調(diào)見圖4A。我們選取OPLS-DA模型各組中VIP最大的前20種脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其表達水平均是下調(diào)的，見圖4B。為了了解它們之間的可能調(diào)節(jié)關(guān)系，我們對VIP最大的前50個差異脂質(zhì)進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果提示幾種類型的甘油三酯與其它幾種類型的脂質(zhì)均存在明顯正相關(guān)見圖5。我們又以閾值(P＜0.05和差異倍數(shù)＞2或＜0.5)篩選差異脂質(zhì)代謝物，共篩選出73 種差異脂類，其中與對照組相比較，ESCC 組上調(diào)的有34 種，見表2，下調(diào)的有43 種，見表3。其中甘油二酯DAG(14:0/18:2)、DAG(16:0/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(18:2/22:5)均是下調(diào)的，尤其是DAG(18:2/22:5)下調(diào)了37%；游離脂肪酸類FFA(20:2)、FFA(20:3)、FFA(20:4)、FFA(22:6)均是下調(diào)的，尤其FFA(20:4)下調(diào)了36%。而TAG 種類在ESCC 組出現(xiàn)了2 倍的上調(diào)變化。在甘油磷脂類中，尤以PE(16:0/16:1)和PE(16:0/20:5)變化最為明顯，在腫瘤組中其上調(diào)了2.28和2.48倍。

圖4 ESCC組與正常對照組血清樣本中差異表達的脂質(zhì)

圖5 ESCC組與正常對照組血清樣本中差異表達脂質(zhì)的相關(guān)性分析

表2 食管鱗狀細胞癌和對照組患者血清中上調(diào)的脂質(zhì)代謝物

表3 食管鱗狀細胞癌和對照組患者血清中下調(diào)的脂質(zhì)代謝物

2.5 哈薩克族ESCC患者血清樣本中脂質(zhì)鏈長分析

與健康人群相比較，腫瘤組中游離脂肪酸濃度在18、20、22、24、26、28、30鏈長處減少，而在14碳鏈處其濃度在腫瘤組中反而增加。LPC 在腫瘤組的濃度在所有鏈長處均低于正常組。腫瘤組PC 濃度在36、38 鏈長處少于正常組。腫瘤組中LPE 濃度在18、22 鏈長處相較正常組明顯減少。PE 濃度在腫瘤組中隨著碳鏈長度的增加而減少。SM在腫瘤組中其濃度在22、24 鏈長處明顯減少。在腫瘤組中，HCER 和DCER 濃度在36鏈長處，相較于正常組其濃度反而增加，結(jié)果見圖6。

圖6 ESCC組和正常對照組中不同碳鏈長度對應(yīng)的脂類化合物濃度

2.6 哈薩克族ESCC 患者血清樣本中脂鏈不飽和度分析

本研究中TAG、LPC、PC 和PE 在腫瘤組中幾乎所有不飽和鍵的脂質(zhì)濃度相較正常組均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)。其他含有部分不飽和鍵的脂類化合物濃度在腫瘤組中也明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，結(jié)果見圖7。

圖7 ESCC組和正常對照組中不同碳鏈飽和度對應(yīng)的脂類化合物濃度

3 討 論

多項研究報道癌癥中發(fā)生脂質(zhì)代謝重編程，脂質(zhì)代謝物參與腫瘤細胞能量儲存、細胞信號傳導(dǎo)、細胞膜的構(gòu)成和細胞間的相互作用[9]。之前對ESCC的多個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的綜合分析顯示了脂質(zhì)代謝途徑的改變，包括糖鞘脂生物合成、鞘脂代謝和甘油脂代謝[10]。我們課題組結(jié)合新疆地區(qū)食管癌的流行病學(xué)特點，前期針對新疆哈薩克族ESCC 進行的一項非靶向代謝組學(xué)研究顯示了脂質(zhì)代謝的改變，比如油酸、LysoPC(15:0)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]，這說明脂質(zhì)分子的種類和水平可能提示哈薩克族ESCC 的病程和發(fā)展趨勢。因此，本研究仍以哈薩克族人群為研究目標(biāo)進一步通過脂質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定和定量全面進行脂質(zhì)譜分析，進一步探究哈薩克族ESCC 樣本的脂質(zhì)組成、分布等特點。

脂質(zhì)鏈長度為該脂質(zhì)分子所有脂肪酸的碳原子總和。脂鏈因長度差異導(dǎo)致脂質(zhì)功能各異，鏈的長度會影響細胞質(zhì)膜的厚度，進而影響細胞膜的流動性、相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白和靶蛋白的活性和功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺中CD8+T 細胞中特異性長鏈脂肪酸(LCFAs)的逐漸積累不僅破壞了線粒體功能，而且通過脂肪酸的β氧化過程促進了TCA 循環(huán)，且不同類型的LCFAs和不同飽和度的脂質(zhì)可能為腫瘤微環(huán)境中維持腫瘤進展和免疫細胞代謝重編程提供線索[13]。而本研究提示腫瘤組中FFA、PC、LPC、PE、LPE 的濃度在部分鏈長處均低于正常組人群，尤其是腫瘤組中LPC的濃度在所有鏈長處均低于正常組。同時，脂肪酸鏈中雙鍵數(shù)目的總和決定脂鏈不飽和程度，腫瘤細胞增殖和侵襲能力的增強與細胞膜脂質(zhì)的飽和度密切相關(guān)[14]。有研究指出脂肪酸殘基可能因不飽和程度以及雙鍵的位置而不同，與非惡性細胞相比，癌細胞的細胞膜表現(xiàn)出不同程度的不飽和，癌細胞細胞膜較低的飽和度，可防止細胞膜脂質(zhì)過氧化[15-16]。而本研究中TAG、LPC、PC 和PE 在腫瘤組中飽和度相較正常組均明顯下調(diào)。

甘油磷脂代謝是食管癌一種重要的代謝途徑。本研究中，LPC(16:0)、LPC(20:2)、LPC(18:0)、LPC(20:0)、 LPC(20:1)、 LPC(22:6)、 LPC(22:4)、 LPC(20:4)、LPC(18:2)、LPC(14:0)、LPC(20:3)、LPC(18:3)、LPE(20:0)、LPE(18:0)、LPE(20:1)和LPE(20:2)的水平在ESCC中降低，而LPE(22:5)、LPE(16:1)的水平則增高，提示哈薩克族ESCC 患者存在LPC 和LPE 代謝障礙。Xu等[17]的研究也表明LPC(14:0)水平在ESCC 患者血清中降低。LPC 和LPE 既是磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的代謝產(chǎn)物，也是哺乳動物細胞膜的結(jié)構(gòu)成分。一項研究表明，LPCs的低水平與乳腺癌、結(jié)腸癌的高風(fēng)險直接相關(guān)[18]。也有研究表明LPEs通過抑制磷脂酶D(PLD)影響細胞增殖和遷移[19]。一項ESCC 研究表明，LPE(16:0)、LPE(20:4)和LPE(18:1)水平在ESCC患者血清中較高[20]。而本研究中得出LPE(20:0)、LPE(18:0)、LPE(20:1)和LPE(20:2)的水平在ESCC 中降低，而LPE(22:5)、LPE(16:1)的水平則增高?？傊?，哈薩克族ESCC 患者血漿磷脂水平異常提示脂質(zhì)和能量代謝紊亂。

鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是細胞膜的主要成分，鞘磷脂分布在細胞膜的兩側(cè)，外葉的鞘磷脂濃度較高。鞘磷脂生物合成涉及鞘氨酸合成，進一步?；缮窠?jīng)酰胺[21]。相反，鞘磷脂(SM)分解導(dǎo)致神經(jīng)酰胺(Cer)釋放[22]。本研究發(fā)現(xiàn)SM(22:0)、SM(22:1)、SM(24:0)在ESCC組中的濃度低于正常對照組。鞘磷脂水平的升高具有促進腫瘤生長的作用，其機制是發(fā)揮促凋亡神經(jīng)酰胺的減少[23]。研究報道，自噬相關(guān)蛋白9A(ATG9A)通過調(diào)節(jié)鞘磷脂水平破壞自噬體組織，被認(rèn)為是自噬的負調(diào)節(jié)因子[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺Cer(18:0/26:1)在ESCC 組中的濃度高于正常對照。Cer 作為第二信使分子，是神經(jīng)鞘磷脂酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物，神經(jīng)酰胺膜水平的增加可誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素C，從而激活細胞凋亡通路[25]。一些新的癌癥治療策略旨在過表達神經(jīng)酰胺生物合成途徑關(guān)鍵酶，導(dǎo)致程序化癌細胞死亡[26]。先前的一項ESCC研究中發(fā)現(xiàn)，兩種二氫神經(jīng)酰胺Cer(d18:0/24:0)和Cer(d18:0/24:1)在轉(zhuǎn)移性ESCC 中增加，Cer(d18:0/24:0)和Cer(d18:0/24:1)在小鼠實驗轉(zhuǎn)移模型中抑制轉(zhuǎn)移灶的形成[27]。因此，神經(jīng)酰胺可能是一種有希望干預(yù)ESCC轉(zhuǎn)移的藥物。

總而言之，本研究通過UPLC-MS/MS 檢測平臺對亞類脂質(zhì)進行檢測，哈薩克族ESCC 患者血清中不同的脂質(zhì)變化，可能與構(gòu)成細胞增殖所需膜結(jié)構(gòu)的成分增加和能量代謝事件重編程相關(guān)，后期還需要在此次發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，進行具體的脂質(zhì)分子通路間的研究。本研究有一定的局限性，研究中并未納入其他民族脂質(zhì)組學(xué)分析，仍值得進一步比較分析。