王科芳，陳 瑜，吳陳雨，劉 梅，汪麗杰，田建廣，周小會(huì)，，許 嵐

(1.華東療養(yǎng)院婦科，江蘇 無(wú)錫 214065；2.無(wú)錫市婦幼保健院婦科，江蘇 無(wú)錫214002；3.無(wú)錫市人民醫(yī)院婦科，江蘇 無(wú)錫 214023)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，占卵巢癌70%左右，發(fā)病率和死亡率均居?jì)D科惡性腫瘤前列，其發(fā)病隱匿性強(qiáng)，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至中晚期[1]。EOC 惡性程度高，中晚期患者病情進(jìn)展迅速，且治療過(guò)程中易出現(xiàn)化療耐藥，導(dǎo)致治療失敗，生存期短。目前針對(duì)EOC的診斷和治療水平不斷提高，但5年生存率仍低于45%[2]。因此尋找與EOC臨床病理特征密切相關(guān)，且能有效預(yù)測(cè)預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物有重要臨床意義。

雌激素受體(estrogen receptor，ER)在卵巢癌發(fā)病機(jī)制中起重要作用，ER的兩個(gè)亞型ERα、ERβ在正常卵巢組織中的表達(dá)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)卵巢細(xì)胞癌變時(shí)其平衡被打破，通常在惡性腫瘤中ERα高表達(dá)，ERβ低表達(dá)[3]。Negi 等[4]報(bào)道指出，ERα在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌中均高表達(dá)，ERα有望作為婦科腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。Liu等[5]研究顯示，芹菜素能通過(guò)下調(diào)ERα/β比值從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A是參與多種實(shí)體瘤血管生成過(guò)程的重要促炎因子。有研究顯示，IL-17A在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯高于子宮內(nèi)膜增生組織，且經(jīng)細(xì)胞學(xué)研究顯示，IL-17A 能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移，同時(shí)上調(diào)ERα/β比值[6]。基于上述背景可推測(cè)IL-17A表達(dá)水平、ERα和ERβ平衡與EOC預(yù)后相關(guān)，但尚缺乏相關(guān)的臨床證據(jù)支持。因此，本研究分析了IL-17A、ERα、ERβ在EOC組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為EOC的臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018 年8 月—2022 年8 月期間無(wú)錫市婦幼保健院收治的102 例EOC 患者的臨床和病理資料，年齡33～70 歲，平均(53.60±6.44)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為EOC者；②首次接受手術(shù)，術(shù)中取癌組織和癌旁組織；③年齡18周歲以上；④臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②術(shù)前接受過(guò)放化療、激素治療等干預(yù)；③合并急性感染性疾病；④妊娠期或哺乳期。

1.2 方 法

1.2.1 IL-17A、ERα、ERβ mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)取-80 ℃保存的EOC癌組織和相應(yīng)癌旁組織，采用TRIzol酚氯仿法提取組織中的總RNA(試劑盒購(gòu)自德國(guó)Wiagen)，測(cè)定RNA 純度，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher 公司)獲取互補(bǔ)鏈cDNA，以之為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，qPCR 試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche 公司，反應(yīng)體系20 μL，步驟為：95 ℃預(yù)變性15 s；95 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCT法計(jì)算IL-17A、ERα、ERβ mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參對(duì)照，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 IL-17A mRNA 表達(dá)量及ERα/β比值與臨床病理特征的關(guān)系以IL-17A mRNA、ERα/β的平均值為分界值，將患者分為IL-17A 高表達(dá)與低表達(dá)組，ERα/β高比值與低比值組。采用R×C 列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)的方法，比較IL-17A表達(dá)、ERα/β比值不同水平組患者的臨床病理特征，包括年齡、國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)合會(huì)(FIGO)[7]分期(I～I(xiàn)V 期)、腹水量、分化程度(低或中/高)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分型。

1.2.3 臨床治療及隨訪所有患者均接受腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療。收集患者的臨床和病理資料，包括年齡、FIGO分期、腹水量、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分型。隨訪：術(shù)后1年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，之后6個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2023 年8 月1 日。終點(diǎn)事件為患者死亡、失訪或隨訪時(shí)間截止，記錄確診后治療開(kāi)始時(shí)間至終點(diǎn)事件發(fā)生的時(shí)間間隔即總生存期(overall survival，OS)。采用Kaplan-Meier 法比較IL-17A 高表達(dá)與低表達(dá)組、ERα/β高比值與低比值組患者的累積生存曲線；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析IL-17A mRNA、ERα/β對(duì)EOC患者預(yù)后OS的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率(%)表示，兩樣本比較用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 法、Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析IL-17A mRNA表達(dá)量及ERα/β比值對(duì)OS的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織及癌旁組織中IL-17A、ERα、ERβ mRNA表達(dá)量及ERα/β比值的比較

qPCR 結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，EOC 癌組織中IL-17A、ERα mRNA 表達(dá)水平及ERα/β水平均升高，而ERβ mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-17A mRNA 和ERα/β的平均值分別為0.52、3.85。見(jiàn)圖1。

圖1 癌組織及癌旁組織中IL-17A、ERα、ERβ mRNA的相對(duì)表達(dá)量及ERα/β比值的比較

2.2 IL-17A mRNA 表達(dá)量及ERα/β比值與臨床病理特征的關(guān)系

以IL-17A mRNA的平均值0.52，ERα/β的平均值3.85 為分界值，將患者分為IL-17A 高表達(dá)與低表達(dá)，ERα/β 高比值與低比值組。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，IL-17A 高表達(dá)及ERα/β高比值與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水量有關(guān)(P＜0.05)，與年齡、分化程度、組織學(xué)分型無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IL-317A、ERα、ERβ mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果

單因素Cox 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO 分期、腹水量、術(shù)后殘?jiān)?、化療療程、IL-17AmRNA、 ERα mRNA、ERβ mRNA 及ERα/β比值與EOC 患者OS 有關(guān)(P＜0.05)；多因素分析顯示FIGO III+IV 期、術(shù)后殘?jiān)睿? cm、IL-17A mRNA 高表達(dá)、ERα/β高比值是影響EOC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 EOC患者總體生存期的影響因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析

2.4 IL-17A mRNA 表達(dá)水平和ERα/β比值對(duì)EOC患者OS的影響

隨訪時(shí)間12～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間36個(gè)月，隨訪期間3例患者失訪，隨訪率97.06%，隨訪期間共38例(37.25%)死亡。IL-17A mRNA高表達(dá)、低表達(dá)患者隨訪期間分別有27、11例死亡，Kaplan-Meier 生存分析顯示，IL-17A mRNA 高表達(dá)者累積生存率低于IL-17AmRNA低表達(dá)者(Log rankχ2=7.549，P=0.006)。ERα/β高比值與低比值患者隨訪期間分別有29、9例死亡，Kaplan-Meier生存分析顯示，ERα/β高比值者累積生存率低于ERα/β低比值者(Log rankχ2=9.750，P=0.002)。見(jiàn)圖2。

圖2 IL-17A mRNA和ERα/β比值對(duì)EOC患者OS的影響

3 討 論

近年來(lái)EOC外科手術(shù)及放化療技術(shù)取得很大的進(jìn)展，但EOC總體生存期仍較短，術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，5 年生存率處于較低水平。EOC 發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，學(xué)者認(rèn)為與激素、遺傳、炎癥、生殖等多種因素有關(guān)[8]。近年來(lái)有證據(jù)證實(shí)，ERβ主要表達(dá)于健康卵巢組織或良性卵巢組織中，ERα表達(dá)于惡性卵巢組織中，ERα與ERβ平衡在卵巢癌發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[9]。另有研究顯示，雌激素能通過(guò)ERβ途徑促進(jìn)皮膚炎癥，提示ER 在機(jī)體免疫系統(tǒng)及自身免疫性疾病中起重要調(diào)控作用[10]。腫瘤微環(huán)境中免疫失衡及炎癥反應(yīng)促進(jìn)EOC發(fā)生及發(fā)展，IL-17A 是重要的CD4+T 細(xì)胞分泌的促炎因子，多項(xiàng)報(bào)道其參與促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展[11-12]。因此探究EOC組織中IL-17A及ERα，ERβ的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系有重要臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中IL-17A、ERα mRNA 表達(dá)水平及ERα/β水平高于癌旁組織，ERβ mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織，說(shuō)明EOC 組織中IL-17A 上調(diào)，ER 亞型平衡向ERα漂移。IL-17A 屬于重要促炎因子，同時(shí)參與宮頸癌[13]、乳腺癌[14]等多種實(shí)體瘤血管生成及癌細(xì)胞惡性行為學(xué)進(jìn)展。Kang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ER 能增強(qiáng)IL-17A 的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)子宮組織中免疫記憶γδT 細(xì)胞，從而調(diào)控機(jī)體免疫監(jiān)視作用。ERα/β值是ER介導(dǎo)致癌過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)，其在ER依賴性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，高ER 水平通過(guò)抑制乳腺癌中IL-17A及IL-17其他亞型表達(dá)，從而靶向下調(diào)細(xì)胞程序性死亡受體1/配體1 通路(PD-1/PD-L1)，說(shuō)明ER 與IL-17A 參與調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A 高表達(dá)及ERα/β高比值與EOC 患者FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水量有關(guān)。分析原因可能為，一方面高IL-17A介導(dǎo)的慢性炎癥會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞快速分裂，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水及臨床分期進(jìn)展[17]；另一方面ERα升高促使靶基因過(guò)度表達(dá)或啟動(dòng)增殖、侵襲相關(guān)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[18]；此外，高水平IL-17A能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活及侵襲，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，而ER 能抑制IL-17A表達(dá)從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫作用[19]。

本研究經(jīng)Kaplan-Meier分析顯示，IL-17A mRNA高表達(dá)者及ERα/β高比值者累積生存率低于IL-17A mRNA 低表達(dá)者和ERα/β低比值者，且經(jīng)多因素Cox分析證實(shí)，IL-17A mRNA高表達(dá)、ERα/β高比值是影響EOC 患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Tsai 等[20]研究顯示，IL-17A可能具有促進(jìn)三陰性乳腺癌遷移及血管生成活性，利于腫瘤轉(zhuǎn)移。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，靶向IL-17 能增強(qiáng)結(jié)直腸癌對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥性，從而使患者生存獲益[21]。說(shuō)明IL-17A高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控抗腫瘤免疫系統(tǒng)從而影響EOC預(yù)后。ERβ屬于腫瘤抑制因子，Takano 等[22]報(bào)道指出在三陰性乳腺癌中ERβ表達(dá)水平與復(fù)發(fā)或生存無(wú)關(guān)，這與本研究結(jié)果相似。另有研究表明，ERα在非小細(xì)胞肺癌男性患者中表達(dá)水平更高，且與預(yù)后不良有關(guān)[23]。ERα/β高比值反映ER表達(dá)偏向ERα，其導(dǎo)致EOC預(yù)后生存期較短的原因可能與抑制癌細(xì)胞凋亡[24]、抑制腫瘤免疫監(jiān)視及抗腫瘤藥物的敏感性有關(guān)[25]。因此監(jiān)測(cè)IL-17A mRNA表達(dá)水平及ERα/β比值對(duì)判斷EOC預(yù)后有重要參考價(jià)值。

綜上所述，EOC 組織中IL-17A、ERα及ERα/β上調(diào)、ERβ下調(diào)，且IL-17A 高表達(dá)及ERα/β高比值的EOC患者預(yù)后相對(duì)較差。IL-17A及ERα/β有望成為預(yù)測(cè)EOC術(shù)后轉(zhuǎn)歸的靶點(diǎn)或潛在標(biāo)志物，為臨床及早評(píng)估患者預(yù)后提供參考。