孔德欽，劉思佳，2，劉建豪，2，馬 耀，2，馬丞飛，2，趙昱舜，2，周嘉恒，師敏婕，李 嘉，，劉江正，

(1.空軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系軍事毒理學與防化醫(yī)學教研室/陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室/教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治重點實驗室，陜西 西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院學員二大隊，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系飛行人員康復與療養(yǎng)教研室，陜西 西安 710032)

糜爛性毒劑作為一種經(jīng)典的化學戰(zhàn)劑，曾廣泛應用于多次戰(zhàn)爭或恐怖襲擊，導致了大量人員傷亡，對我國的化學安全構成了潛在的現(xiàn)實威脅。糜爛性毒劑經(jīng)呼吸道或皮膚暴露后能夠?qū)е录毙苑螕p傷，是導致傷員死亡和影響遠期效應的最重要原因之一[1]。目前，糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的中毒機制尚不明確，也缺乏有效的救治藥物[2]。研究表明，糜爛性毒劑誘導急性肺損傷與過度活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集導致的氧化應激和線粒體功能障礙密切相關[3-4]。肝細胞核因子-1b(hepatocyte nuclear factor-1b，HNF-1b)，亦稱為HNF1β或TCF2，是一種在肝臟組織中大量表達的轉(zhuǎn)錄因子，屬于含有同源域的超家族，在物種間高度保守[5]。HNF1-b的功能喪失或HNF-1b 等位基因截斷可導致一種常染色體顯性遺傳疾病，稱為青年5 型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young type 5，MODY5)[6]。本課題組之前的研究表明，HNF-1b 在調(diào)節(jié)氧化應激和代謝過程中發(fā)揮了重要的作用[7]，過表達HNF-1b能夠顯著減輕多氯聯(lián)苯或雙酚A誘導肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和肝損傷的發(fā)生和發(fā)展[8-9]，其機制可能與抗氧化和保護線粒體功能相關[8]。除肝臟外，HNF-1b蛋白也被發(fā)現(xiàn)在其他器官和組織，包括肺、腸、胰腺、腎臟、生殖道和泌尿道中表達，被認為在上述器官的發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用[5]。此前雖已證實HNF-1b在肺部上皮細胞中也有廣泛表達，但其功能尚不明確[10]。本研究通過硫芥模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-chloroethyl ethyl sulfide，CEES)構建糜爛性毒劑誘導體外肺支氣管上皮損傷模型，檢測CEES暴露后HNF-1b的變化；并通過慢病毒感染技術在人肺支氣管上皮細胞系BEAS-2B細胞中過表達HNF-1b，探討過表達HNF-1b 對CEES 誘導肺支氣管上皮細胞損傷的調(diào)控作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

2-氯乙基乙基硫醚(純度99.5%)購自美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；PBS、雙抗溶液、0.25%胰酶、BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒和凋亡檢測試劑盒均購自南京恩晶生物有限公司；DCFH-DA、MitoSOX、JC-1熒光探針購自美國Thermo公司；DHE熒光探針購自上海碧云天生物技術有限公司；HNF-1b 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，GAPDH抗體及二抗購自美國Bioworld公司；其他化學試劑均為分析純以上級別。

Infinite M200 Pro全波段酶標儀購于瑞士Tecan公司；流式細胞儀為美國Beckman 公司產(chǎn)品；全自動高速冷凍離心機購于美國Sigma公司；CKX41S倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡購于日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞處理和分組人支氣管上皮細胞系BEAS-2B 購自中國科學院上海細胞生物學研究所。BEAS-2B細胞接種于培養(yǎng)皿、6孔板或96孔板，使用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基在CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CEES 預先溶解于無水乙醇中制備成100 mmol/L的儲備液，使用時稀釋。細胞實驗分為對照組和CEES 染毒組，其中對照組給予含1%(V/V)乙醇的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基處理24 h，染毒組分別給予0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 mmol/L CEES 處理24 h；在分子功能實驗中，將細胞分為4 組：溶劑對照組、CEES 組、HNF-1b 過表達組、HNF-1b 過表達+CEES組，CEES 的濃度為1 mmol/L，溶劑為1%(V/V)乙醇，處理時間為24 h，染毒結束后進行相應的檢測。

1.2.2 CCK-8 試劑盒檢測細胞活力采用試劑盒測定BEAS-2B 細胞活力。CEES 染毒結束后，向每孔中加入10 μL CCK-8，并將細胞在37 ℃條件下避光孵育1 h。通過全波段酶標儀檢測450 nm 波長處吸光值，每組設10個復孔，取均值作為每組的吸光值，以對照組的吸光值為1，各組的細胞活力以其與對照組的相對值表示。

1.2.3 細胞大體形態(tài)觀察將BEAS-2B細胞接種至6孔板，用不同濃度的CEES 處理24 h 后將細胞置于倒置顯微鏡下，在明場觀察細胞大體形態(tài)的變化。

1.2.4 DCFH-DA 和DHE 檢測細胞ROS 水平將BEAS-2B細胞接種至6孔板，按分組處理24 h后去除培養(yǎng)基，使用胰酶消化收集細胞沉淀，細胞內(nèi)加入無血清培養(yǎng)基配制的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA或10 μg/mL的DHE探針工作液并重懸，在37 ℃孵箱內(nèi)避光孵育30 min，去除探針，PBS 清洗1 次，用PBS重懸后用流式細胞儀檢測，分別采用CytExpert軟件收集檢測數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.5 MitoSOX 檢測線粒體ROS(mtROS)水平使用線粒體靶向的MitoSOX 熒光探針檢測mtROS 含量。待BEAS-2B 細胞按分組處理24 h 后用胰酶消化收集細胞沉淀，加入無血清培養(yǎng)基配制的終濃度為5 μmol/L 的MitoSOX 探針，置于37 ℃孵箱內(nèi)避光孵育20 min，后續(xù)操作同1.2.4。

1.2.6 Western blot 法檢測HNF-1b 蛋白表達BEAS-2B 細胞處理結束后用4 ℃預冷的PBS 洗1 次，加入RIPA 裂解液在冰上裂解30 min，收集細胞裂解物，置于4 ℃高速離心機以12 000g離心20 min，收集上清即為細胞總蛋白。取少量蛋白，使用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定。其余蛋白樣品加入5×上樣緩沖液及二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，100 ℃加熱5 min 后用于Western blot 實驗。取40 μg蛋白進行上樣，電泳時初始電壓設置為90 V，待蛋白到達分離膠時切換為120 V。在恒壓20 V條件下使用PVDF 膜進行蛋白轉(zhuǎn)印30 min，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入相應的HNF-1b 或GADPH 一抗，4 ℃搖床孵育16 h，TBST 洗膜3 次，加入1∶6 000 稀釋的山羊抗兔二抗，搖床上孵育1 h，TBST 洗膜4 次，將條帶置于凝膠成像系統(tǒng)進行顯影并用Quantity One 軟件進行拍照。

1.2.7 過表達HNF-1b 的BEAS-2B 細胞系的構建為了評價HNF-1b 在糜爛性毒劑誘導急性肺損傷中的作用及機制，我們構建了過表達HNF-1b 的BEAS-2B細胞系。首先用全基因合成的方式合成HNF-1b基因片段，并構建含有目的基因的重組質(zhì)粒pCDH-CMVMCS-EF1-Puro-HNF1B，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293lenti 細胞，產(chǎn)生高滴度的慢病毒。將BEAS-2B 細胞以5×104的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入10 μg/mL的凝聚胺(polybrene)，同時以 感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為60 的滴度分別加入空載體對照病毒和HNF-1b 過表達的慢病毒。48 h 后換液，加入嘌呤霉素對有效感染的細胞進行篩選并擴增，從而構建穩(wěn)定過表達HNF-1b的BEAS-2B細胞系。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。分別將正常細胞或者過表達細胞BEAS-2B接種在6 孔板，處理結束后用0.25%胰酶消化、離心、收集細胞，在細胞沉淀中加入200 μL 細胞凋亡檢測工作液(緩沖液∶Annexin V-FITC∶PI=100∶1∶1)，混勻后置于37 ℃孵箱中避光孵育30 min，PBS 洗1次，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，通過CytExpert 軟件收集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.9 JC-1 檢測線粒體膜電位使用JC-1 染料檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的變化。將BEAS-2B 細胞接種在共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，待細胞處理結束后加入終濃度為2 μg/mL 的JC-1 工作液，置于37 ℃孵箱中避光孵育30 min，用PBS 洗3 次，使用共聚焦顯微鏡觀察并拍照(紅色熒光，EX/EM 為585/590 nm；綠色熒光，EX/EM為514/529 nm)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 CEES對BEAS-2B細胞活力水平的影響

不同濃度CEES 染毒24 h 后，CCK-8 法檢測細胞活力，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，0.4 mmol/L CEES處理組BEAS-2B細胞活力升高(P＜0.05)，當CEES濃度超過0.6 mmol/L 時，細胞活力均顯著降低(P＜0.01)，且具有劑量效應關系(r=-0.93，P＜0.01)。上述結果提示糜爛性毒劑誘導肺上皮細胞損傷體外模型構建成功，見圖1。

圖1 不同劑量的CEES染毒后對BEAS-2B細胞活力的影響

2.2 CEES 染毒后對BEAS-2B 細胞形態(tài)和ROS 的影響

光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，0.6 mmol/L CEES 處理組細胞數(shù)量顯著降低，上皮狀細胞呈現(xiàn)纖維化表征，當CEES 濃度超過0.8 mmol/L 時，皺縮狀的死細胞明顯增多(圖2)。

圖2 不同劑量CEES染毒后的BEAS-2B細胞形態(tài)

氧化應激在糜爛性毒劑導致肺損傷中發(fā)揮了關鍵效應?；贒CF-DA 探針和MitoSOX 探針的流式細胞術分別檢測細胞內(nèi)總ROS 和線粒體ROS 水平，見圖3。與對照組相比，0.6 mmol/L CEES 處理組總ROS(P＜0.01)和線粒體ROS水平降低(P＜0.05)，而0.8 和1 mmol/L CEES 處理導致總ROS 和線粒體ROS 水平均顯著升高(P＜0.01)。上述結果提示CEES 能夠誘導細胞氧化應激，同時引發(fā)線粒體氧化損傷。由于1 mmol/L CEES 處理組上述指標均顯著，故后續(xù)實驗用該濃度處理細胞。

圖3 不同劑量CEES染毒后對BEAS-2B細胞ROS的影響

2.3 CEES 染毒對BEAS-2B 細胞HNF-1b 表達的影響

Western blot 檢測BEAS-2B 細胞中HNF-1b 蛋白的表達，與對照組細胞相比，1 mmol/L CEES 染毒組HNF-1b 的蛋白水平顯著下調(diào)(圖4，P＜0.01)。結果表明，HNF-1b 可能是糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的重要靶分子。

圖4 CEES染毒對BEAS-2B細胞HNF-1b表達的影響

2.4 過表達HNF-1b抑制CEES染毒導致的細胞損傷和凋亡

與對照組細胞相比，采用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達HNF-1b 的BEAS-2B 細胞系HNF-1b 的蛋白表達水平顯著上調(diào)(圖5A)。CCK-8 檢測細胞活力結果表明，與正常對照組相比，過表達HNF-1b顯著抑制了CEES導致的細胞活力降低(圖5B，P＜0.01)。細胞凋亡檢測結果表明，過表達HNF-1b還明顯拮抗了CEES導致的細胞凋亡發(fā)生(圖6，P＜0.01)。此結果表明，過表達HNF-1b顯著減輕了CEES誘導的肺上皮細胞損傷。

圖5 過表達HNF-1b抑制CEES導致的細胞增殖活力

圖6 過表達HNF-1b抑制CEES導致的細胞凋亡

2.5 過表達HNF-1b 可逆轉(zhuǎn)CEES 誘導的BEAS-2B細胞ROS生成

氧化應激是糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的重要機制之一。通過DHE 熒光探針檢測，結果顯示單獨CEES 作用時，細胞內(nèi)總ROS 水平較對照組明顯升高(P＜0.01)；而過表達HNF-1b 可逆轉(zhuǎn)CEES 染毒導致的BEAS-2B細胞內(nèi)總ROS水平的升高(圖7，P＜0.01)。上述結果提示，過表達HNF-1b 可能通過抗氧化作用抑制CEES誘導肺上皮細胞損傷。

圖7 過表達HNF-1b抑制CEES導致的細胞總ROS生成

2.6 過表達HNF-1b 逆轉(zhuǎn)CEES 染毒導致的BEAS-2B細胞線粒體功能障礙

本研究檢測了過表達HNF-1b 后線粒體損傷相關指標的變化，發(fā)現(xiàn)過表達HNF-1b顯著抑制了CEES導致的線粒體ROS水平升高(圖8，P＜0.01)，同時減輕了CEES 導致的MMP 水平降低(圖9)。上述結果表明，HNF-1b 能夠通過調(diào)控線粒體功能參與糜爛性毒劑CEES誘導的肺上皮細胞損傷過程。

圖8 過表達HNF-1b抑制CEES導致的mtROS生成

圖9 過表達HNF-1b抑制CEES導致的線粒體膜電位受損

3 討 論

糜爛性毒劑是一類能夠直接損傷器官、組織和細胞，吸收后能導致全身中毒損傷的致死性化學戰(zhàn)劑，曾在戰(zhàn)爭歷史上被廣泛使用，造成了眾多的軍事人員和平民中毒[11]。但其中毒和發(fā)病機制復雜，目前也缺乏有效的救治手段，需要研究新的中毒靶點和相關機制，以尋求新的干預靶標和救治思路[12]。此外，糜爛性毒劑導致的肺損傷如治療不及時或不徹底，將會轉(zhuǎn)變成慢性肺損傷，嚴重影響中毒傷員的預后和生活質(zhì)量[13]。研究表明，過量ROS 生成導致的氧化應激被認為是糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的關鍵致病因素之一，氧化應激還介導了炎癥和凋亡的發(fā)生和發(fā)展[14]。使用抗氧化劑或抗氧化酶可在一定程度上減輕糜爛性毒劑誘導的器官損傷[15-16]。

本課題組以往的研究證實，HNF-1b 作為肝臟中大量表達的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)脂肪合成、脂肪細胞分化、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，同時還能通過調(diào)控氧化酶的表達和炎癥因子釋放發(fā)揮氧化應激和炎癥調(diào)節(jié)作用[10]。HNF-1b缺乏能夠?qū)е聫碗s和異質(zhì)的臨床表型，如腎臟和胰腺的發(fā)育異常、糖耐量異常等[17]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，肺組織內(nèi)也有HNF-1b 表達，目前其功能尚不明確[18]。過表達HNF-1b 可以通過抑制PI3K/Akt 磷酸化，顯著抑制肺上皮細胞系A549 的惡性生物學行為[18]，提示肺部HNF-1b 的表達對于呼吸系統(tǒng)可能具有其特殊的生物學功能。為了探索HNF-1b 在糜爛性毒劑導致急性肺損傷中的作用及調(diào)控機制，我們構建了CEES 染毒的BEAS-2B細胞模型，檢測HNF-1b的表達改變對CEES誘導肺損傷的調(diào)控作用，以期為開發(fā)新的抗毒靶標和深入理解糜爛性毒劑中毒機制提供新思路。

在前期研究中，我們已證實，過表達HNF-1b慢病毒或使用化學單體齊墩果酸藥理性激活HNF-1b能夠通過上調(diào)抗氧化關鍵調(diào)控因子Nrf-2的表達和抑制NF-κB信號，進而抑制氧化應激損傷和炎癥反應過度激活，表現(xiàn)出對環(huán)境污染物脅迫的保護作用[7]。本研究中，在CEES染毒BEAS-2B細胞后，HNF-1b蛋白的表達顯著下調(diào)，結合HNF-1b對氧化應激和炎癥反應的負向調(diào)控作用，我們推測HNF-1b的表達下調(diào)可能參與了CEES導致的急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展。后經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染構建了過表達HNF-1b的肺支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞系，發(fā)現(xiàn)HNF-1b的蛋白表達水平顯著上調(diào)，且過表達HNF-1b能夠顯著減輕CEES染毒所誘導的BEAS-2B細胞損傷，提高細胞活力，進一步證實了HNF-1b可能是拮抗糜爛性毒劑導致細胞損傷的保護性分子。

凋亡是一種受多種因素調(diào)節(jié)的程序性細胞死亡過程，文獻已證實糜爛性毒劑染毒可以通過抑制VDR/Nrf2/Sirt3信號通路等誘發(fā)肺支氣管上皮細胞的凋亡[19]。Kang等[18]報道HNF-1b通過調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡途徑參與了胚胎器官的發(fā)育過程。本文通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)過表達HNF-1b可抑制CEES誘導的BEAS-2B細胞凋亡，提示上調(diào)HNF-1b 表達具有抗細胞凋亡的作用。上述結果表明，HNF-1b對糜爛性毒劑導致的肺上皮細胞發(fā)揮了保護作用，而CEES染毒導致的HNF-1b的抑制可能參與了肺上皮細胞的凋亡過程。

ROS 被認為是糜爛性毒劑誘導毒性的關鍵介質(zhì)[20]。使用低分子量抗氧化劑或輔助因子、酶性抗氧化劑可以有效改善糜爛性毒劑中毒的損傷程度。糜爛性毒劑暴露后導致ROS 過量生成，介導脂質(zhì)、蛋白和核酸發(fā)生氧化損傷[14]。目前，糜爛性毒劑導致氧化應激的機制尚不明確，可能涉及還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)的耗竭[21]與抗氧化酶SOD的抑制[22]等。大量研究也證實，HNF-1b介導的氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)可以抑制多氯聯(lián)苯混合物誘導的氧化損傷[8]，且多氯聯(lián)苯[7]和雙酚A[9]還能通過抑制HNF-1b促進氧化應激，提示HNF-1b 可能是一個新的氧化還原調(diào)控因子。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HNF-1b 過表達能夠逆轉(zhuǎn)CEES 染毒誘導的細胞內(nèi)ROS 水平和線粒體ROS水平升高，進而減輕氧化應激損傷。上述結果說明HNF-1b 作為一種保護性分子可能通過抗氧化而發(fā)揮拮抗糜爛性毒劑作用。另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)，0.4 mmol/L CEES 處理能夠輕度提高細胞活力，0.6 mmol/L 時使總ROS 和線粒體ROS 水平輕微降低，這可能是由于毒物興奮效應引起的，這是一種生物體對外界不利環(huán)境或者有毒物質(zhì)產(chǎn)生的適應性保護反應，低水平的刺激作用會促進細胞活力增加，并通過激活Nrf2分子等增強細胞內(nèi)防氧化能力，進而降低細胞內(nèi)的ROS水平，從而使生物體更易于存活[23]。

糜爛性毒劑導致急性肺損傷的發(fā)病機制復雜，其中線粒體功能障礙備受關注[24]。越來越多的研究表明，氧化應激誘導的線粒體結構和功能異常參與了肺上皮細胞的死亡[24-25]。靶向線粒體的抗氧化劑能夠顯著減輕CEES誘導的細胞活力降低[24]。本課題組前期研究也證實，線粒體抗氧化劑MitoQ 能夠有效減輕氮芥誘導的小鼠急性肝損傷[26]。Casemayou 等[27]報道，HNF-1b 的缺失導致腎小管細胞線粒體呼吸發(fā)生異常，提示HNF-1b 的下調(diào)可能參與了線粒體功能異常。為了進一步明確HNF-1b 對糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的調(diào)控作用，我們通過JC-1 探針技術檢測了MMP 水平。MMP 是線粒體活性的關鍵指標，它反映了電子運輸和氧化磷酸化的過程，而氧化磷酸化是ATP產(chǎn)生的驅(qū)動力[28]。在本研究中，結果顯示CEES暴露能夠?qū)е戮€粒體功能異常，表現(xiàn)為MMP 的顯著降低，而過表達HNF-1b能夠顯著拮抗CEES對線粒體功能的損傷效應，提示線粒體功能調(diào)節(jié)可能參與了HNF-1b對糜爛性毒劑肺損傷的拮抗作用。

本研究通過構建糜爛性毒劑模擬物CEES 染毒體外細胞模型，證實CEES暴露后能夠?qū)е翲NF-1b表達的顯著下調(diào)，其可能是重要的干預靶標。過表達HNF-1b 能夠顯著減輕CEES 誘導的細胞損傷和凋亡，抑制線粒體功能障礙和氧化應激，靶向激活HNF-1b可能在糜爛性毒劑誘導急性肺損傷的臨床救治中發(fā)揮重要作用。