張 銳，馬媛媛，韓 瑩，崇小萌，劉馨妍，謝廣云，梁一帆，姚尚辰，，張靖溥，

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所抗生素室，北京102629；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050)

模式生物斑馬魚因自身繁殖能力強(qiáng)、生殖周期短、胚胎易獲得、已完成基因組測(cè)序及與人類基因的高度保守性等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物篩選和安全性評(píng)價(jià)[1-2]。斑馬魚肝臟發(fā)育過(guò)程及肝功能均與人類高度相似，斑馬魚肝臟疾病模型已被廣泛應(yīng)用于人類肝毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中[3-5]。

頭孢菌素類是以冠頭孢菌培養(yǎng)得到的天然頭孢菌素C 作為原料，經(jīng)半合成改造其側(cè)鏈而得到的一類抗生素，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[6]。頭孢曲松是第三代頭孢菌素類藥物，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)大的抗菌作用。頭孢曲松偶見肝腎功能異常及血液系統(tǒng)改變，如中性粒細(xì)胞下降、血小板下降等，肌注部位可能有疼痛反應(yīng)，偶見靜脈炎[7]。由于其藥物合成步驟繁雜，藥物本身不穩(wěn)定較容易產(chǎn)生雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)與藥物的毒性反應(yīng)相關(guān)，容易使藥效降低、抗菌活性減弱，甚至可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良反應(yīng)。藥物自身帶入以及降解形成的雜質(zhì)的毒性、安全性等方面的研究是藥品質(zhì)量控制的重要依據(jù)[8]。

為了評(píng)估頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露是否會(huì)產(chǎn)生肝臟毒性，本文以AB 品系野生型斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fabp10a：DsRed)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，初步探討頭孢曲松及其雜質(zhì)造成斑馬魚肝損傷的機(jī)制，為深入研究頭孢曲松及其雜質(zhì)造成人肝損傷的機(jī)制提供線索，并為藥物監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品頭孢曲松(純度83.9%)及其雜質(zhì)A(純度100%)、B(純度100%)、C(純度99.3%)、D(純度100%)和E(純度100%)，均為白色粉末，且均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，各受試物結(jié)構(gòu)式見表1。油紅O染色試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(M1708)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

表1 頭孢曲松及其雜質(zhì)A、B、C、D、E的結(jié)構(gòu)式

1.1.2 溶液的配制及濃度采用新鮮配制的斑馬魚飼養(yǎng)液(1 L純水中加入0.3 g碳酸氫鈉和0.2 g海水晶)為溶劑，頭孢曲松及雜質(zhì)A、B、C、D 每種物質(zhì)均設(shè)置1、2、5 mmol/L 的3 個(gè)不同劑量組；雜質(zhì)E 設(shè)置0.1、0.5、1 mmol/L的3個(gè)劑量組。所有受試物現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AB 品系(zebrafish，Danio rerio，AB strain)野生型和肝臟特異性熒光標(biāo)記的Tg(fabp10a：DsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚嚴(yán)格按照以下條件飼養(yǎng)：溫度為(28.5±1) ℃，飼養(yǎng)液電導(dǎo)率為480～550 μs/cm，光照14 h和黑暗10 h循環(huán)進(jìn)行。挑選正常成魚，按雌雄比1∶2的交配方式進(jìn)行繁殖。收集受精后72 h的幼魚，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和受試物組，每組30枚幼魚，受試物組用不同濃度頭孢曲松或雜質(zhì)溶液處理；在正常飼養(yǎng)液中發(fā)育的同批斑馬魚幼魚為對(duì)照組。

1.2.1 野生型斑馬魚肝毒性實(shí)驗(yàn)選取野生型斑馬魚幼魚，分別用頭孢曲松及其雜質(zhì)處理2 d 后，取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚)，顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟形態(tài)，計(jì)算肝臟的面積尺寸，并通過(guò)與對(duì)照組比對(duì)，用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

歸一化的肝臟面積百分率=受試物組肝面積/對(duì)照組肝面積×100%

1.2.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝毒性實(shí)驗(yàn)選取轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚，分別用不同濃度的頭孢曲松及其雜質(zhì)處理2 d后，取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚)，熒光顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟熒光發(fā)光情況，記錄幼魚肝臟熒光強(qiáng)度及面積等數(shù)據(jù)，并通過(guò)與對(duì)照組比對(duì)，用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 斑馬魚整體油紅O染色實(shí)驗(yàn)選取野生型斑馬魚幼魚，用不同濃度的頭孢曲松及其雜質(zhì)分別處理2 d后，取受精后120 h的幼魚(每組至少20枚)用PBS沖洗3次，轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中，4 ℃下固定過(guò)夜；次日將斑馬魚樣品從多聚甲醛中取出，于70%乙醇溶液中漂洗5 s 后放入新鮮配制的油紅O 工作液(油紅O儲(chǔ)備液6 mL，加蒸餾水4 mL，混合，靜置10～20 min，吸取上層液體)中染色5～10 min。用70%乙醇溶液洗去多余染液，PBS 沖洗1 遍，拍照。對(duì)幼魚肝臟形態(tài)和脂肪含量變化進(jìn)行觀察，并通過(guò)與對(duì)照組比對(duì)判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因篩選頭孢曲松雜質(zhì)B、D和E不易獲得且難溶于水，受試物量不足以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定，因此只對(duì)頭孢曲松、雜質(zhì)A及雜質(zhì)C 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，測(cè)序濃度皆為5 mmol/L。取頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 處理2 d 后的野生型斑馬魚幼魚各100 枚，用PBS 清洗3 遍后置于含200 μL RNA later 試劑的EP 管中，隨后置于-20 ℃冰箱備用。用TRIzol 試劑提取總RNA，作為mRNA 測(cè)序的建庫(kù)起始樣品。建庫(kù)測(cè)序以及測(cè)序數(shù)據(jù)分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析得到差異表達(dá)基因后，為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，闡述其在分子水平上的作用，利用KOBAS 3.0基于基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，Bonferroni校正P＜0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，應(yīng)用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間兩兩比較方差齊性時(shí)用LSD 法，方差不齊時(shí)用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)野生型斑馬魚肝臟表型的影響

如圖1 所示，與對(duì)照組相比，頭孢曲松及其雜質(zhì)誘導(dǎo)的野生型斑馬魚幼體肝毒性具有劑量-效應(yīng)關(guān)系(r≥0.993，P＜0.01)。正常對(duì)照組斑馬魚幼魚肝組織結(jié)構(gòu)清晰，呈淺紅色或棕紅色。經(jīng)過(guò)不同濃度的受試物處理后，隨著受試物濃度的增加，出現(xiàn)肝臟透明度下降、顏色變暗呈棕色或黑色，肝臟組織紋理無(wú)定形及面積改變等現(xiàn)象，顯示頭孢曲松及其雜質(zhì)可導(dǎo)致肝臟變性。

圖1 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)野生型斑馬魚肝臟表型的影響

頭孢曲松及其雜質(zhì)引起的肝毒性表型各不相同。與對(duì)照組相比，雜質(zhì)B(r=0.999，P＜0.01)、雜質(zhì)D(r=0.993，P＜0.01)和雜質(zhì)E(r=0.994，P＜0.01)引起斑馬魚肝臟面積隨濃度降低而下降。1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和雜質(zhì)C 均導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟面積增大，1 mmol/L 雜質(zhì)C組與對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而高濃度5 mmol/L 又會(huì)引起斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域減小(均為P＜0.01)，提示其高濃度下有可能誘發(fā)肝萎縮。歸一化的肝臟面積百分率結(jié)果見圖2。

圖2 頭孢曲松及其雜質(zhì)處理野生型斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

2.2 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

如圖3 所示，對(duì)照組斑馬魚幼魚健康肝組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常。與對(duì)照組比較，頭孢曲松及其雜質(zhì)均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼體肝臟形態(tài)發(fā)生改變，其中1 和2 mmol/L 頭孢曲松及雜質(zhì)A 和C 均主要導(dǎo)致斑馬魚肝臟熒光區(qū)擴(kuò)大或熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，高濃度5 mmol/L組熒光面積減小，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)，提示頭孢曲松及雜質(zhì)A和C有可能在高濃度下誘發(fā)肝萎縮。而雜質(zhì)B、D和E均導(dǎo)致斑馬魚幼魚熒光區(qū)減小或熒光強(qiáng)度減弱(P＜0.05 或0.01)。歸一化的肝臟面積百分率結(jié)果見圖4。

圖3 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟表型的影響

圖4 頭孢曲松及其雜質(zhì)處理轉(zhuǎn)基因斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

2.3 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性的影響

油紅O 整體染色法檢測(cè)野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性情況如圖5 所示。對(duì)照組斑馬魚幼魚肝臟處無(wú)染色顏色或顏色較淺，即無(wú)脂肪堆積。與對(duì)照組相比，頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 可導(dǎo)致幼魚肝臟區(qū)域顏色隨著受試物濃度的升高逐漸加深甚至高濃度組呈現(xiàn)黑色，雜質(zhì)B、D和E處理組肝臟面積減小顏色變暗，脂肪主要堆積在卵黃囊處，且隨給藥濃度的增加現(xiàn)象越明顯。

圖5 頭孢曲松及其雜質(zhì)對(duì)斑馬魚肝臟脂肪含量的影響

2.4 測(cè)序及差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果

測(cè)序結(jié)果如圖6 所示，頭孢曲松給藥組共篩選出735 個(gè)差異表達(dá)基因，其中有553 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，182個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；雜質(zhì)A組共有237個(gè)差異表達(dá)基因，其中93 個(gè)上調(diào)，144 個(gè)下調(diào)；雜質(zhì)C 組共有237個(gè)差異表達(dá)基因，其中有94 個(gè)上調(diào)，143 個(gè)下調(diào)。此結(jié)果表明在給予頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 后，斑馬魚肝臟中基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。

圖6 頭孢曲松及其雜質(zhì)A和C處理后的差異表達(dá)基因數(shù)量

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

分別對(duì)頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 處理組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果見圖7。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號(hào)通路，包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等相關(guān)通路。雜質(zhì)A 組主要富集到3 條信號(hào)通路，包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮。頭孢曲松雜質(zhì)C 組主要富集到6 條信號(hào)通路，包括MAPK 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、核糖體等相關(guān)通路。

圖7 頭孢曲松及其雜質(zhì)A和C處理組差異表達(dá)基因的KEGG富集通路直方圖

3 討 論

斑馬魚與哺乳動(dòng)物具有相似的生理和功能，可作為篩選候選藥物和化學(xué)品的毒性及安全性評(píng)估的體內(nèi)模型[9-10]。斑馬魚同哺乳動(dòng)物模型相比，具有與人類高度遺傳保守性，可以用于篩選藥物在組織中的靶向活性，提供有關(guān)化合物毒性等特性信息[11-12]。

頭孢曲松屬于第三代頭孢菌素，是世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單中推薦的最安全有效的藥物之一[13]。但由藥物生產(chǎn)工藝或原料帶入的雜質(zhì)，或在貯存過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)等可影響藥品的安全性和有效性[14-15]。因此，本文對(duì)頭孢曲松及其雜質(zhì)引起的肝毒性進(jìn)行了初步研究。

結(jié)果顯示，隨著受試物濃度的增加野生型和轉(zhuǎn)基因斑馬魚的肝臟毒性也增加，肝臟發(fā)黑現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重，肝臟面積改變現(xiàn)象逐漸明顯。頭孢曲松及其雜質(zhì)均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚肝臟形態(tài)發(fā)生改變，頭孢曲松雜質(zhì)B、D和E引起斑馬魚肝臟區(qū)域減小、熒光強(qiáng)度的減弱，肝臟位置顏色變暗，脂肪堆積于卵黃囊處。而1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 均導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域增大，熒光面積增大，肝臟區(qū)域顏色變暗；但高濃度5 mmol/L又會(huì)引起斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域減小，熒光面積減小，肝臟區(qū)域顏色呈黑色。這些現(xiàn)象提示頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化，有可能誘發(fā)肝變性和肝萎縮。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可捕捉不同組織的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達(dá)的差異，可將顯著差異表達(dá)的基因與某些生物學(xué)功能聯(lián)系起來(lái)，用于檢測(cè)早期損傷標(biāo)志物和分子調(diào)控機(jī)制的研究[16]。

因此本研究進(jìn)一步提取頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C處理組斑馬魚幼魚RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)頭孢曲松給藥組有735 個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生變化，雜質(zhì)A組共有237個(gè)差異表達(dá)基因，雜質(zhì)C組共有237個(gè)差異表達(dá)基因。而分別對(duì)頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，此3 種不同樣品主要富集通路也存在差異。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號(hào)通路，包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等相關(guān)通路；雜質(zhì)A 組主要富集到3 條信號(hào)通路，包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮；雜質(zhì)C 組主要富集到6 條信號(hào)通路，包括MAPK 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、核糖體等相關(guān)通路。

本研究利用模式生物斑馬魚模型初步評(píng)價(jià)頭孢曲松及其雜質(zhì)的肝毒性，結(jié)果表明頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化，有可能誘發(fā)肝變性和肝萎縮，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為頭孢曲松及其雜質(zhì)的急性毒理學(xué)分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。鑒于頭孢曲松臨床應(yīng)用可能引起的肝損傷，本研究也為頭孢曲松的藥物監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了參考。