代雨鑫，梁立春，彭琳茜，孟凡奇，韓獻(xiàn)鋒，張 玥，楊 玉，商 宇，

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154003)

齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，其化學(xué)名稱為3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-酸，在蘋果表皮、番木瓜果實(shí)、柿子的果實(shí)、李子、枇杷、大豆等多種植物與食物中廣泛存在[1]。齊墩果酸具有抗肝損傷、抗氧化、抗炎癥、抑制血小板聚集、降血糖和抗腫瘤等多方面的藥理作用，目前已經(jīng)用于臨床治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎[2]。齊墩果酸具有免疫調(diào)節(jié)作用。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎小鼠中，齊墩果酸能夠使促進(jìn)炎癥與抑制炎癥的免疫反應(yīng)趨于平衡，并且促進(jìn)自身免疫性腦脊髓炎相關(guān)腸道功能損傷的恢復(fù)[3]。本研究團(tuán)隊(duì)之前也發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠促進(jìn)免疫缺陷小鼠腸道免疫功能的恢復(fù)[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是綜合利用網(wǎng)絡(luò)分析、系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)等方法研究多組分、多靶點(diǎn)、多通路的藥物作用機(jī)制的學(xué)科，其通過構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)揭示復(fù)雜疾病的發(fā)生機(jī)制和藥物治療的方式，并為新藥開發(fā)提供候選目標(biāo)或方向[5]。體液免疫力是人體抵抗病原體感染、消除抗原性異物、保障健康的關(guān)鍵防線，其減弱將導(dǎo)致機(jī)體更容易遭受疾病的侵襲[6]?；诖耍疚膹腂 淋巴細(xì)胞發(fā)育的角度探索了齊墩果酸對體液免疫的調(diào)節(jié)作用。為了闡述其作用機(jī)制，我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段篩選了齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)，并對其藥物靶點(diǎn)進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析、基因本體(gene ontology，GO)生物過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析。

1 材料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 主要試劑及儀器齊墩果酸(純度≥98%)、環(huán)磷酰胺(純度≥98%)、紅細(xì)胞裂解液均購于北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液購于美國思拓凡公司；Anti-CD45R(B220)-APC購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Anti-IgD-PE 購于美國賽默飛世爾科技公司；BD FACSAriaTMCell Sorter 流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級昆明種雌性小鼠24 只(合格證號230781211100005414)，購于哈爾濱珍寶制藥有限公司，飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SYXK(黑)2021-018。小鼠飼養(yǎng)于恒溫、恒濕、12 h明暗交替光照循環(huán)的SPF 級動物室，允許其自由飲水與飲食。本研究已經(jīng)通過佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查(批文號202311-2)。

1.1.3 動物造模適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為空白組、模型組和干預(yù)組，每組8 只。模型組與干預(yù)組小鼠在實(shí)驗(yàn)第1～5 天每天腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg(溶于生理鹽水)，空白組注射等體積生理鹽水[7]。干預(yù)組小鼠自實(shí)驗(yàn)第6 天開始連續(xù)28 d每天灌胃給予齊墩果酸25 mg/kg(用2%的Tween 80配成混懸液)，空白組與模型組小鼠給予相應(yīng)體積的2%Tween 80。

1.1.4 骨髓B淋巴細(xì)胞亞群測定在第35天，通過二氧化碳麻醉處死所有小鼠。分離股骨，用1 mL 無菌注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，并通過200 目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。細(xì)胞懸液經(jīng)300 g 離心5 min 后重懸于1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液中，再加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，300 g離心10 min后將細(xì)胞重懸于400 μL染色緩沖液中。計數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個/mL。向細(xì)胞懸液中加入抗體Anti-CD45R(B220)-APC(稀釋20倍)與Anti-IgD-PE(稀釋20倍)，室溫避光孵育25 min。染色緩沖液清洗細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo X 10.0.7r2軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 數(shù)據(jù)庫篩選靶點(diǎn)從PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取齊墩果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)預(yù)測齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)。選擇可能性值(probability)＞0.1的靶點(diǎn)作為齊墩果酸的潛在藥物靶點(diǎn)。

1.2.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析與富集分析用String平臺(https://www.string-db.org/)對潛在的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析、GO 生物過程分析和KEGG 信號通路富集分析，用Cytoscape 3.6.0 軟件對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果進(jìn)行可視化并計算連通性(degree)，用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)對GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 齊墩果酸對免疫抑制小鼠骨髓B淋巴細(xì)胞亞群的作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在給藥4 周后，模型組小鼠的成熟B細(xì)胞亞群(IgD與B220雙陽性細(xì)胞)百分率為(2.585±0.248)%，明顯低于空白組(8.235±0.361)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；干預(yù)組小鼠的成熟B細(xì)胞亞群百分率為(3.395±0.445)%，明顯高于模型組而低于空白組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 齊墩果酸對免疫抑制小鼠骨髓B淋巴細(xì)胞亞群作用的代表性流式結(jié)果散點(diǎn)圖

2.2 齊墩果酸的潛在藥物靶點(diǎn)

通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫共檢索到100 個預(yù)測的齊墩果酸藥物靶點(diǎn)。以上靶點(diǎn)的可能性的中位數(shù)為0.100，因此以0.100 為閾值篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。共發(fā)現(xiàn)76個藥物靶點(diǎn)大于閾值，其中可能性排位較高的前15個藥物靶點(diǎn)見表1。

表1 齊墩果酸可能性排名前15位的靶點(diǎn)列表

2.3 齊墩果酸藥物靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的樞紐觀察

經(jīng)String 平臺分析，發(fā)現(xiàn)輸入的76 個藥物靶點(diǎn)涉及到292種相互作用。Cytoscape 計算繪圖后，得到71個節(jié)點(diǎn)。Cytoscape計算蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)蛋白間連通性均值為8.225。連通性排名前5的節(jié)點(diǎn)蛋白有PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3 和HMGCR，表明它們在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中起著重要樞紐作用，見圖2。

2.4 齊墩果酸藥物靶點(diǎn)的富集分析

通過GO 生物過程富集分析，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)在多個生物過程中富集，其中包括突觸傳遞的負(fù)調(diào)控、有絲分裂細(xì)胞周期停滯、脂質(zhì)儲存的負(fù)調(diào)控、前列腺素的分泌、干擾素-γ信號通路的負(fù)調(diào)控及正調(diào)控B 細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)信號通路等。根據(jù)富集因子對這些生物過程進(jìn)行了排序，排名前30 的生物過程見圖3。此外，在KEGG 信號通路分析中，齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)被富集于29條不同的信號通路，其中包括PPAR 信號通路、花生四烯酸代謝通路、脂肪消化吸收通路、脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)分解的調(diào)控以及BCR信號通路等，見圖4。

圖3 齊墩果酸靶點(diǎn)的GO生物過程富集分析結(jié)果

圖4 齊墩果酸靶點(diǎn)的KEGG信號通路富集分析結(jié)果

3 討 論

齊墩果酸是天然產(chǎn)物有效成分領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，具有廣泛且復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。齊墩果酸能夠調(diào)控Bcl-2 蛋白、HIF-1α、p21、p53 等蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，還能干預(yù)NF-κB、PI3K/Akt/mTOR 等信號通路，從而對細(xì)胞生長、凋亡、代謝等各個方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[8]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在第35 天，模型組動物的骨髓成熟B 細(xì)胞亞群明顯低于空白組動物，說明免疫抑制動物模型成功建立；干預(yù)組動物的成熟B 細(xì)胞亞群百分率明顯高于模型組動物，說明齊墩果酸能有效促進(jìn)免疫抑制動物B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育與分化，顯示出其對B 淋巴細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。為了闡明齊墩果酸的作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸的作用包括PTPN1、POLB、AKR1B10 和PTPN2 等諸多靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，在齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)中PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3和HMGCR 在相互作用網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的樞紐角色。在過去的研究中，齊墩果酸被發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)PPARG 與PPARA 的表達(dá)，其作用可能與齊墩果酸降血糖效應(yīng)有關(guān)[9]。在其他研究中，齊墩果酸及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制PTGS2的蛋白活性及表達(dá)水平抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的激活，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。以上的證據(jù)表明，本研究中預(yù)測的藥物靶點(diǎn)確實(shí)與齊墩果酸的藥理作用密切相關(guān)。

在進(jìn)一步的GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析中，本研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸的藥物靶點(diǎn)富集于肝功能密切相關(guān)的生物過程與信號通路，如脂質(zhì)儲存的負(fù)調(diào)控以及脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)分解的調(diào)控等。另外，BCR 信號通路是GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析共同富集到的結(jié)果。BCR 信號通路在B 淋巴細(xì)胞的骨髓發(fā)育及離開骨髓后的分化過程中扮演著重要的角色[10]?；谙惹霸趧游飳?shí)驗(yàn)中所獲得的結(jié)果，我們認(rèn)為齊墩果酸可能是通過調(diào)控BCR信號通路影響了B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程。在GO 生物過程富集分析和KEGG 信號通路分析中，藥物靶點(diǎn)MAPK3、CD81等被富集于BCR信號通路。CD81在B細(xì)胞的生理功能中扮演著重要的角色。CD81 是將CD19 從細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面必不可少的因子，并且和CD19、CD21分子組成B細(xì)胞共受體復(fù)合物，從而降低了BCR激活的門檻，其純合致殘突變會導(dǎo)致人免疫缺陷綜合征的發(fā)生[11]。與其作用相似，MAPK3 能夠通過影響支持B淋巴細(xì)胞存活的BCR信號維持成熟B淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量穩(wěn)定[12]。值得注意的是，在我們的結(jié)果中，MAPK3 是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)之一，而CD81 在齊墩果酸的靶點(diǎn)預(yù)測中排名靠前。因此，MAPK3 與CD81 可能是齊墩果酸影響B(tài)CR 信號通路的直接藥物靶點(diǎn)。

總之，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步分析了齊墩果酸對體液免疫的調(diào)節(jié)作用和其作用機(jī)制。結(jié)果提示，齊墩果酸具有提高體液免疫力的藥效學(xué)功能，能夠提高骨髓中成熟B 淋巴細(xì)胞亞群的比例。齊墩果酸可能是通過作用于MAPK3與CD81來影響B(tài)CR信號通路，從而在B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在之后的工作中，本研究團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)對齊墩果酸的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行深入研究，以期實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。