孟楊楊 朱 鑫成 嘉陳 琳褚武英賓石玉張建社*

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,桂林 541006;2.長(zhǎng)沙學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410022)

魚類肌肉組織由明顯分層的紅肌和白肌組成,又可稱為慢肌和快肌,它們既是魚類軀干的結(jié)構(gòu)組織和運(yùn)動(dòng)器官,也是人類重要的蛋白源[1]。已有研究證實(shí),多種信號(hào)分子參與了慢肌和快肌發(fā)生分化的調(diào)節(jié)過(guò)程。這些信號(hào)分子主要包括三種類型，即Hedgehog[2]、Wnt[3]和TGF-β家族基因[4]。有關(guān)調(diào)節(jié)肌纖維決定分化的研究主要集Hedgehog和TGFβ家族基因,其研究對(duì)象也主要采用如斑馬魚等模式生物。Echidna hedgeho僅在脊索(Notochord)中表達(dá),Currie等[5]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Echidna hedgehog,具有挽救無(wú)脊索突變體的肌肉先驅(qū)細(xì)胞(Muscle pioneer cells)分化的能力。此外，研究還發(fā)現(xiàn),在野生型胚胎中聯(lián)合異位表達(dá)Echidna hedgehog和sonic hedgehog能夠誘導(dǎo)額外的肌肉先驅(qū)細(xì)胞的生成,這表明這兩種信號(hào)依次作用于體節(jié)發(fā)育。Lewis等[6—8]采用Hedgehog家族蛋白及Hedgehog家族蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Patched1蛋白處理斑馬魚早期胚胎,研究證實(shí)了Hedgehog家族蛋白在誘導(dǎo)斑馬魚慢肌形成中起關(guān)鍵的作用。進(jìn)而探究發(fā)現(xiàn)在野生型斑馬魚胚胎過(guò)表達(dá)Shh或者顯性失活的PKA(Dominant negative PKA)可導(dǎo)致所有的體節(jié)細(xì)胞發(fā)育為慢肌纖維[9,10]。Du等[11]結(jié)合Hedgehog和TGF-β家族成員基因以斑馬魚為研究對(duì)象開展了慢肌分化的機(jī)理研究。該研究揭示,在野生型斑馬魚胚胎過(guò)表達(dá)Hedgehog同源基因或抑制PKA可誘導(dǎo)慢肌肌源細(xì)胞的定向分化,而采用TGF-β家族成員基因Dorsalin-1處理斑馬魚胚胎可抑制肌原細(xì)胞的產(chǎn)生,說(shuō)明Hedgehog和TGF-β家族成員基因在調(diào)控慢肌分化中是拮抗性的,即Hedgehog可誘導(dǎo)慢肌的形成,而TGF-β成員,如BMP4抑制慢肌發(fā)育。然而,目前有關(guān)Hedgehog信號(hào)分子在養(yǎng)殖魚類特別是鱖誘導(dǎo)肌細(xì)胞或肌纖維類型定向分化的研究尚未有報(bào)道,有待深入研究。

Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路內(nèi)存在眾多家族成員基因,目前所熟知的蛋白主要包括分泌性糖蛋白配體Shh、Patched(Ptch)與Smoothened(Smo)膜受體蛋白,以及核轉(zhuǎn)錄因子Gli等。Shh是一種分泌型蛋白,可經(jīng)過(guò)細(xì)胞間的互作將Shh傳遞到受體細(xì)胞中與受體結(jié)合。Ptch屬于12次跨膜蛋白,既是Shh信號(hào)通路中的受體,同時(shí)也是Shh信號(hào)的直接靶基因,并通過(guò)負(fù)反饋抑制Shh信號(hào)的活性[12]。在正常情況下,Ptch抑制Smo蛋白活性,從而抑制下游通路,隨后下游的Gli蛋白在蛋白酶體(Proteasome)內(nèi)被截?cái)?并以羧基端被截?cái)嗟男问竭M(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smo屬于7次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白,同時(shí)也是Shh信號(hào)分子傳遞所必須的受體,當(dāng)Shh信號(hào)分子與Ptch結(jié)合時(shí),解除Ptch對(duì)Smo的抑制作用,促使Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Gli作為Shh信號(hào)通路中發(fā)揮功能作用的核轉(zhuǎn)錄因子,在脊椎動(dòng)物中有3種類型,即Gli1、Gli2和Gli3。其中Gli1只具有轉(zhuǎn)錄激活作用,轉(zhuǎn)錄激活Gli1后會(huì)正反饋調(diào)控更進(jìn)一步增加Gli的活化。而Gli2與Gli3不僅具有轉(zhuǎn)錄激活作用,還同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄抑制作用[13]。

鱖肌肉為高蛋白的優(yōu)質(zhì)肉類,較常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)魚類總氨基酸含量更高,肉質(zhì)鮮美,深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài),具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要名貴特色優(yōu)良品種[14—17]。本研究對(duì)鱖Shh基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了Shh基因的表達(dá)特性。隨后通過(guò)環(huán)巴胺處理鱖胚胎抑制Shh信號(hào)傳導(dǎo),分析了與肌細(xì)胞增殖和分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及肌球蛋白重、輕鏈等基因的表達(dá)水平。結(jié)果揭示,Shh信號(hào)分子被抑制后,所檢測(cè)的相關(guān)基因表達(dá)均顯著降低,表明Shh參與調(diào)控鱖肌細(xì)胞的早期分化和融合。該研究有助于我們從分子水平了解Shh信號(hào)分子的生物信息學(xué)特征,以及魚類肌細(xì)胞分化的潛在機(jī)理,將豐富魚類早期肌肉發(fā)生分化的基礎(chǔ)理論,為健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于實(shí)驗(yàn)的鱖胚胎及用于基因組織表達(dá)檢測(cè)的鱖幼魚均來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期合作單位湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

鱖不同發(fā)育階段胚胎的收集胚胎孵育方法參考劉希良等[18]技術(shù),收集未受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸早期、神經(jīng)胚期、視泡期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心臟搏動(dòng)期、血液循環(huán)期、胸鰭原基期和出膜期胚胎材料,分別取40—50枚卵或胚胎保存于裝有1 mL RNA保護(hù)液(Sample Protector for RNA/DNA,9750 寶日醫(yī)生物,北京)的離心管中,并用液氮快速冷凍,最后保存于-80℃超低溫冰箱待用。

環(huán)巴胺溶液浸泡胚胎樣品收集稱量10 mg環(huán)巴胺(Cyclopamine,HY-17024,MedChemExpress,美國(guó))粉末溶于2.43 mL DMSO溶液中,得到10 mmol/L環(huán)巴胺母液。將環(huán)巴胺母液與曝氣水按 1∶500 的比例稀釋至環(huán)巴胺終濃度20 μmol/L (DMSO終濃度為0.2%)。待胚胎發(fā)育到囊胚期時(shí),分別取100枚胚胎至環(huán)巴胺處理組和 DMSO 對(duì)照組 (濃度為 0.2%,不含環(huán)巴胺) 進(jìn)行浸泡處理,統(tǒng)計(jì)兩組死亡率并記錄,待胚胎發(fā)育到出膜期時(shí)收集胚胎樣品于2 mL離心管中,液氮速凍后,至-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

鱖組織樣品的收集將實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖缸內(nèi)暫養(yǎng)的鱖隨機(jī)選取規(guī)格大小相一致且健康幼魚3尾,體重為(250±10) g。參考吳萍等[19]安樂(lè)處理魚類方式,處理后放置冰上解剖。分別取紅肌、白肌、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、腦和腸道放入2 mL EP管中,在液氮速凍后,迅速放入-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取及cDNA模板合成鱖各時(shí)期胚胎及幼體組織總RNA提取參照RNAiso Plus (9108,寶日醫(yī)生物,北京) 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。提取胚胎總RNA后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳及微量核酸蛋白測(cè)定儀(NanoPhotometer NP80,Implen GmbH,Germany)對(duì)RNA的完整性及濃度進(jìn)行檢測(cè),核酸A260/A280比值在1.8—2.0確保核酸質(zhì)量。并用逆轉(zhuǎn)錄試劑[MonScriptTMRTⅢ Super Mix with dsDNase(Two-Step),Monad,中國(guó)],按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄,獲得的cDNA保存于-80℃冰箱備用。

引物設(shè)計(jì)與合成通過(guò)UCSC及NCBI網(wǎng)站查詢實(shí)驗(yàn)所需鱖基因序列,利用NCBI網(wǎng)頁(yè)中Primer-blast工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成 (表1)。

表1 熒光定量引物Tab.1 The Primers for RT-qPCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR以鱖胚胎及幼鱖組織樣品的cDNA為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),每個(gè)樣品進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系:SYBR Premix ExTaqTMⅡ 6 μL、正反向引物各0.5 μL、DNA模板1 μL、Nuclease-free water 4.5 μL。反應(yīng)條件為: 95℃ 預(yù)變性1min;95℃ 變性5s;58℃ 退火25s;40個(gè)循環(huán);繪制融解曲線的溫度為65—95℃,每0.5℃ 讀板1次。組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)用Rpl13作為內(nèi)參,胚胎時(shí)期表達(dá)實(shí)驗(yàn)用Gapdh作為內(nèi)參。

數(shù)據(jù)處理及分析將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行分析,各基因相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法計(jì)算,并采用SPSS 20軟件對(duì)各組基因表達(dá)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中時(shí)序及組織表達(dá)結(jié)果使用單因素方差分析,環(huán)巴胺浸泡實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。最終所得結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,當(dāng)顯著性P＜0.05 認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)之間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鱖Shh基因生物信息學(xué)特征

Shh基因序列鑒定分析鱖Shh基因mRNA序列全長(zhǎng)2407 bp,5′UTR長(zhǎng)度為160 bp,3′UTR長(zhǎng)度為1005 bp。起始密碼子ATG在161—163 bp處,終止密碼子TGA在1400—1403 bp處。開放閱讀框長(zhǎng)度為1242 bp,編碼413個(gè)氨基酸。

Shh蛋白特性和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)在線Expasy-ProtParam軟件工具預(yù)測(cè)鱖Shh蛋白,結(jié)果顯示其由413個(gè)氨基酸組成,分子量為46.01 kD,等電點(diǎn)為6.57,蛋白偏弱酸性。預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)計(jì)算能35.27,為穩(wěn)定性蛋白。Shh蛋白中含有47個(gè)酸性氨基酸(Asp+Glu),44個(gè)堿性氨基酸(Arg+Lys)。該蛋白質(zhì)預(yù)估半衰期為30h,脂溶系數(shù)為82.83,親水性平均系數(shù)是-0.292,屬親水蛋白,疏水性不強(qiáng)。編碼鱖Shh蛋白的20種氨基酸中,亮氨酸(Leu)最多,占比8.7%,半胱氨酸(Cys)最少,占比1.5%。通過(guò)TMHMM-2.0對(duì)蛋白質(zhì)跨膜域進(jìn)行分析,顯示Shh蛋白存在一處跨膜域結(jié)構(gòu),該蛋白質(zhì)屬于膜結(jié)合蛋白。

采用NCBI保守結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD) 的CD-searcher在線工具預(yù)測(cè),Shh蛋白含有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,即Hh-N和Hh-C結(jié)構(gòu)域。Hh-N結(jié)構(gòu)域中擁有Hh_signal模塊,模塊結(jié)構(gòu)位于39—184位氨基酸處,編碼146個(gè)氨基酸殘基。Hh-C結(jié)構(gòu)域的Hint模塊位于186—399位氨基酸處,編碼214個(gè)氨基酸殘基。

鱖Shh同源蛋白比對(duì)及生物進(jìn)化樹分析在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等20個(gè)物種的Shh氨基酸序列,采用NCBI上Protein BLAST對(duì)蛋白同源性進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,鱖Shh蛋白與魚類Shh蛋白具有較高的同源性,其與長(zhǎng)吻鉆嘴魚(Chelmon rostratus)和大黃魚(Larimichthys crocea)Shh蛋白相似度最高,為97.58%;與其他物種相比,鱖Shh蛋白與家貓(Felis catus)Shh蛋白相似度最低,僅為61.17%。使用DNAMAN軟件對(duì)不同物種間Shh蛋白Hh-N結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì),結(jié)果顯示,其在鱖、大口黑鱸及白梭吻鱸等鱸形目魚類中具有較高的相似性,說(shuō)明Shh蛋白中組成Hh-N結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在不同物種之間較為保守。使用MEGA11軟件對(duì)Shh蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示(圖1),鱖Shh與魚類Shh聚為一支,其中,鱖和鱸形目白梭吻鱸的遺傳距離最近。

圖1 Shh蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the Shh protein

2.2 鱖Shh基因時(shí)空表達(dá)特征

Shh在鱖胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)特征通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Shh基因在鱖胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)量,如圖2所示,Shh在整個(gè)胚胎發(fā)育階段均有不同程度表達(dá),胚胎發(fā)育初期表達(dá)水平相對(duì)較低,隨著胚胎發(fā)育進(jìn)程推進(jìn),其在神經(jīng)胚期表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。Shh在胚胎發(fā)育中后期表達(dá)水平較高,并在出膜期達(dá)到峰值。

Shh在鱖不同組織中的表達(dá)特征通過(guò)RTqPCR檢測(cè)分析Shh基因在鱖不同組織內(nèi)的表達(dá)差異(圖3),結(jié)果表明,在腦和腸道中顯著高于在白肌、紅肌、心臟、腎臟、肝臟和脾臟組織中的表達(dá)(P＜0.05)。

圖3 鱖不同組織中Shh的相對(duì)表達(dá)豐度Fig.3 Relative expression abundance ofShhin different tissues ofSiniperca chuatsi

2.3 環(huán)巴胺抑制Shh信號(hào)通路對(duì)鱖胚胎發(fā)育及肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)控因子的影響

環(huán)巴胺浸泡鱖胚胎對(duì)發(fā)育的影響環(huán)巴胺作為一類Shh信號(hào)分子的特異抑制劑,實(shí)驗(yàn)采用浸泡方式處理鱖胚胎,并采用DMSO浸泡作為對(duì)照處理。實(shí)驗(yàn)期間死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果為,實(shí)驗(yàn)組死亡23枚,對(duì)照組死亡18枚,并利用SPSS 20進(jìn)行卡方檢驗(yàn),無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。如圖4所示,對(duì)照組存活的82枚胚胎軀干全部正常,實(shí)驗(yàn)組存活的77枚胚胎軀干尾端全部呈彎曲狀,致畸率100%,推測(cè)可能是由于其尾部肌肉組織發(fā)育異常,導(dǎo)致胚胎畸形。

圖4 浸泡處理后鱖胚胎呈現(xiàn)的發(fā)育表型Fig.4 Developmental phenotype ofSiniperca chuatsiembryos after immersion treatment

環(huán)巴胺處理對(duì)Shh通路下游基因及生肌調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Shh信號(hào)通路下游靶基因Ptch1、Gli1、Gli2和Gli3的表達(dá)量,評(píng)判Shh信號(hào)傳遞受阻情況。隨后檢測(cè)與肌細(xì)胞增殖和融合相關(guān)基因(Pax3、Pax7和Myomaker)及生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族成員,如Myod、Myog、Mrf4和Myf5基因的表達(dá)量。如圖5所示,經(jīng)環(huán)巴胺浸泡處理的鱖胚胎,所檢測(cè)基因表達(dá)量較對(duì)照組均顯著下降(P＜0.05)。

圖5 鱖出膜期Shh通路下游靶基因、肌細(xì)胞分化與融合相關(guān)基因、生肌調(diào)節(jié)基因MRFs家族成員基因的相對(duì)表達(dá)豐度Fig.5 Relative expression abundance of downstream target genes of the Shh pathway,genes related to myoblast differentiation and fusion,and genes of members of the MRFs family of myogenic regulatory genes inSiniperca chuatsiat the emergence stage

環(huán)巴胺處理對(duì)鱖胚胎肌球蛋白編碼基因表達(dá)影響為探討環(huán)巴胺處理對(duì)鱖肌肉生長(zhǎng)的影響,通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)分析肌球蛋白輕鏈及重鏈基因在鱖出膜期表達(dá)量。如圖6所示,與對(duì)照相比,肌球蛋白輕鏈及輕鏈激酶基因的同分異構(gòu)體包括Myl2、Myl3、Myl6、Mylk和Mylk4基因的表達(dá)量均顯著降低,肌球蛋白重鏈的7個(gè)同分異構(gòu)體如Myh1、Myh2、Myh3、Myh7、Myh9、Myh10和Myh11基因的表達(dá)量同樣顯著下降(P＜0.05)。

圖6 鱖出膜期肌球蛋白及激酶基因表達(dá)豐度Fig.6 Myosin and kinase gene expression abundance in the emergence phase ofSiniperca chuatsi

3 討論

3.1 鱖Shh基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析

本研究對(duì)鱖Shh蛋白結(jié)構(gòu)和同源進(jìn)化特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示,鱖Shh開放閱讀框?yàn)?242 bp,編碼413個(gè)氨基酸,分子量為46.01 kD,等電點(diǎn)為6.57,蛋白偏弱酸性;鱖Shh蛋白脂溶系數(shù)為82.83,為脂溶性蛋白,親水性平均系數(shù)是-0.292,有一處跨膜結(jié)構(gòu),推定為親水性膜結(jié)合蛋白。該基因編碼的蛋白含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,即Hh-N與Hh-C。預(yù)測(cè)得出的Hh_signal模塊與Hint模塊分別屬于氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域。有研究報(bào)道,果蠅與脊椎動(dòng)物Hh前體蛋白通過(guò)C-末端部分催化并自我分割后變?yōu)镹端與C端,果蠅Hh-N過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胚胎表皮特征發(fā)生改變,Hh-C過(guò)表達(dá)則無(wú)任何變化[20—22]。在脊椎動(dòng)物中Shh-N可誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和基底細(xì)胞分化[23]。以上說(shuō)明Hh-N結(jié)構(gòu)域具有Hh蛋白信號(hào)活性。Hh-C的功能則是起到膽固醇轉(zhuǎn)移酶類作用,影響信號(hào)分子的分布[24,25]。

同源進(jìn)化特征分析顯示,鱖Shh蛋白與長(zhǎng)吻鉆嘴魚和大黃魚的Shh蛋白相似度最高,與家貓Shh蛋白相似度最低,且物種間Shh蛋白Hh-N結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列較為保守。鱖Shh蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,鱖Shh蛋白與魚類Shh蛋白聚為一支,并與鱸形目白梭吻鱸遺傳距離最短,親緣關(guān)系最近,說(shuō)明Shh在魚類進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化較為保守。

3.2 鱖Shh基因時(shí)空表達(dá)特征分析

有研究表明,Shh基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中,對(duì)神經(jīng)、消化道及肢芽等組織發(fā)育起到重要調(diào)控作用[26]。尤其在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,脊索或神經(jīng)底板分泌的Shh對(duì)背側(cè)肌節(jié)部位的肌細(xì)胞形成和存活起著至關(guān)重要的作用[27—29]。本研究采用RT-qPCR對(duì)翹嘴鱖12個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期Shh的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果表明Shh在胚胎不同發(fā)育階段都有表達(dá)且具有顯著性差異,并隨胚胎發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn),表達(dá)量在神經(jīng)胚期顯著增高,且整個(gè)胚胎發(fā)育中后階段表達(dá)量保持較高水平,最終在出膜期表達(dá)量達(dá)到峰值。因此,我們推測(cè)Shh可能對(duì)鱖胚胎神經(jīng)的發(fā)育發(fā)揮作用。

有研究報(bào)道,Shh基因在不同動(dòng)物的多組織中表達(dá)[30]。本次研究對(duì)鱖不同組織表達(dá)分析揭示,Shh在檢測(cè)的所有組織中均有表達(dá),腦和腸道中表達(dá)較高,在白肌和紅肌等組織中表達(dá)相對(duì)較低。有研究表明,Shh作為一種分泌蛋白,在海馬體神經(jīng)元回路的形成和可塑性方面發(fā)揮重要作用,其中海馬神經(jīng)元樹突中的Shh受體激活后參與跨神經(jīng)元信號(hào)通路,該通路加速了神經(jīng)軸突生長(zhǎng)[31]。因此,我們推測(cè)Shh可能在幼體鱖的腦神經(jīng)發(fā)育中也有著重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn),Shh在脊椎動(dòng)物體內(nèi)是通過(guò)作用于肌肉干細(xì)胞直接調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育,以及促進(jìn)新的肌纖維數(shù)量增加[32]。Koleva等[33]對(duì)小鼠肌肉干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Shh能夠促進(jìn)肌肉干細(xì)胞增殖。因而推測(cè)Shh可能在鱖肌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起到調(diào)控作用。

3.3 鱖Shh基因?qū)∪獍l(fā)育相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)分析

本研究為探究Shh在鱖肌肉發(fā)育中的作用,采用Shh信號(hào)通路特異性拮抗劑環(huán)巴胺對(duì)鱖魚胚胎進(jìn)行浸泡處理。環(huán)巴胺在Shh信號(hào)通路中的作用機(jī)制是抑制Smo的活性,阻斷Shh信號(hào)的傳遞[34]。本次研究檢測(cè)Shh通路內(nèi)基因(Ptch1、Gli1、Gli2和Gli3)、生肌調(diào)節(jié)因子家族基因、調(diào)控肌肉發(fā)育及相關(guān)肌球蛋白重鏈、輕鏈及輕鏈激酶基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,Ptch1、Gli1、Gli2和Gli3表達(dá)量都顯著降低,說(shuō)明環(huán)巴胺處理后,該通路內(nèi)的基因都受到不同程度的抑制。

Pax3、Pax7、Myf5、Myod、Myog和Mrf4等轉(zhuǎn)錄因子,它們協(xié)同誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞的激活、增殖和定向分化直至形成成熟肌纖維[35]。其中Pax3和Pax7在肌肉干細(xì)胞中特異表達(dá),并在調(diào)控肌肉干細(xì)胞增殖和分化中起重要作用[36]。Pax3、Pax7、Myf5及Myod的表達(dá)是控制肌肉干細(xì)胞激活、增殖與分化的關(guān)鍵要素[37]。另外,Myomaker是一個(gè)近期新發(fā)現(xiàn)的促使肌細(xì)胞融合的重要基因,屬于tmem 8c家族成員,是一種跨膜蛋白[38]。Myomaker體內(nèi)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí),該基因在肌細(xì)胞融合過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用[38],在斑馬魚中,Myomaker基因在快肌中表達(dá),敲除Myomaker后導(dǎo)致肌細(xì)胞融合缺陷[39—41]。同時(shí),過(guò)表達(dá)Myomaker足以誘導(dǎo)快肌細(xì)胞之間的過(guò)度融合,同時(shí)還促使通常無(wú)法融合的慢肌細(xì)胞融合,說(shuō)明該基因在魚類肌細(xì)胞融合中有重要作用[42]。通過(guò)環(huán)巴胺處理鱖胚胎抑制Shh信號(hào)通路后,對(duì)參與調(diào)控肌細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子及肌細(xì)胞膜融合基因進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Pax3、Pax7、Myf5、Myod、Myog、Mrf4和Myomaker的表達(dá)均顯著下降,推測(cè)Shh可能通過(guò)直接或間接調(diào)控生肌調(diào)節(jié)因子等基因表達(dá),影響鱖胚胎肌肉細(xì)胞的發(fā)生與分化。

我們先前在鱖肌纖維中鑒定了多種肌球蛋白重鏈和輕鏈亞型,其中,肌球蛋白是構(gòu)成魚類肌肉的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是一種高度不對(duì)稱且分子量約500 kD的六聚體蛋白,由兩條分子量約230 kD的重鏈和四條分子量約16—20 kD的輕鏈組成[43,44]。另外,研究表明,肌球蛋白重鏈亞型如Myh1、Myh7a、Myh9、Myh10和Myh11基因在慢肌中表達(dá)成倍高于快肌,而Myh2和Myh3的表達(dá)量在快肌中的表達(dá)水平是慢肌的數(shù)倍;肌球蛋白輕鏈及輕鏈激酶亞型如Myl2、Myl3、Myl6、Mylk和Mylk4等基因在慢肌中的表達(dá)是快肌的數(shù)倍[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)Shh信號(hào)傳遞受阻后,肌球蛋白重鏈、輕鏈及輕鏈激酶亞型基因表達(dá)量均顯著降低表達(dá)。由此推測(cè),鱖胚胎發(fā)育畸型的原因是環(huán)巴胺抑制劑處理導(dǎo)致Shh信號(hào)分子傳遞阻斷,繼而抑制肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。因此說(shuō)明,Shh對(duì)鱖肌肉細(xì)胞分化和生長(zhǎng)發(fā)揮重要調(diào)控作用,但其調(diào)控的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。