潘美井 王桂堂吳山功

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,大連 116023;2.中國科學(xué)院水生生物研究所,武漢 430072)

抗生素等化學(xué)藥物的長期使用,造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖中藥物殘留、病原菌耐藥性增強(qiáng)及食品安全等問題,因而受到了許多國家和地區(qū)的限制使用[1]。益生菌能夠改善養(yǎng)殖水環(huán)境,刺激免疫系統(tǒng)發(fā)育,維持腸道微生態(tài)平衡,提高生長性能等[2—5],近年來逐漸地替代抗生素等化學(xué)藥物,應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌[6,7],但是水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的芽孢桿菌很多都不是魚類自身來源的菌株。地衣芽孢桿菌FA6(Bacillus licheniformisFA6)是本實(shí)驗(yàn)室從草魚的腸道中分離出的一株芽孢桿菌,其可以耐受高溫和膽汁酸,分泌多種胞外酶,改善草魚的生長性能、抗氧化能力、腸道屏障能力和抗病性[8]。地衣芽孢桿菌FA6經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)后,可制成應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的菌制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對微生物發(fā)酵液含菌量有很大的影響[9—11],但是地衣芽孢桿菌FA6的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件還不清楚,需要確定和優(yōu)化。

芽孢桿菌液體發(fā)酵工藝優(yōu)化一般使用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),在考察的因素較多時,這些方法不僅實(shí)驗(yàn)量大、成本高、耗時長,而且可能導(dǎo)致不可靠的結(jié)論[12,13]。響應(yīng)面法(Response Surface Methodology,RSM)可同時對影響生物量的各個因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評價,從而快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳的組合[14—16]。

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)對地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得其活菌含量最高的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件,為其在高密度生產(chǎn),產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

地衣芽孢桿菌FA6是本實(shí)驗(yàn)室前期從草魚腸道中分離獲得,菌液保存于-80℃冰箱。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基,含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L,pH 7.0—7.2。固體培養(yǎng)基則在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂作為凝固劑。

1.3 培養(yǎng)條件

種子菌液培養(yǎng)條件: 接種量為一接種環(huán)的單菌落,發(fā)酵溫度37℃、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速120 r/min、發(fā)酵時間24h。

初始發(fā)酵培養(yǎng)條件: 接種量為2%的種子菌液,發(fā)酵溫度37℃、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速120 r/min、發(fā)酵時間24h。

1.4 活菌數(shù)的測定

活菌數(shù)的測定采用稀釋涂布平板計數(shù)法[17]。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

初始發(fā)酵培養(yǎng)基和其他發(fā)酵條件保持不變的情況下,探究培養(yǎng)基初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0時、接種量分別為0.5%、1%、2%、4%或8%時、發(fā)酵時間分別為8h、12h、16h、20h、24h、29h、32h或36h時、發(fā)酵溫度分別為17℃、22℃、27℃、32℃、37℃或42℃時、轉(zhuǎn)速分別為60、90、120、150或180 r/min時,以及裝液量分別為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL或200 mL/250 mL時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的變化。通過地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的比較分析,確定最適的初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速和裝液量,得到最佳發(fā)酵條件。

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組,用10 g/L的可溶性淀粉(原料為馬鈴薯)、玉米淀粉、玉米糊精、乳糖、麥芽糖、蔗糖或葡萄糖替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源(胰蛋白胨)。在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù),以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。再分別添加10、20、30、40、50、60或70 g/L的最佳碳源,以確定最佳碳源的最適添加量。

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組,用10 g/L的蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸膏、豆粕粉、大豆蛋白胨替代初始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源(酵母提取物)。在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù),以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。再分別添加10、20、30、40、50或60 g/L的最佳氮源,以確定最佳氮源的最適添加量。

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組,通過在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1 g/L的MnSO4、CaCl2、KH2SO4、K2HPO4、Na2HPO4或MgSO4,在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù),以確定可以添加至培養(yǎng)基的無機(jī)鹽種類。

1.6 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Plackett-Burman Design(PBD)實(shí)驗(yàn)選取可溶性淀粉、酪蛋白胨、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、K2HPO4、KH2SO4、初始pH、接種量、裝液量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和轉(zhuǎn)速共計13個發(fā)酵因素作為自變量(X1、X2··· X13),以地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)作為響應(yīng)值(Y),篩選出顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的發(fā)酵因素。利用Design expert 11.0軟件制定PBD實(shí)驗(yàn)方案(表1),每個發(fā)酵因素設(shè)置兩個水平,低水平(-1)為其單因素實(shí)驗(yàn)的最佳值,高水平(+1)取低水平的1.25—2倍[18,19];PBD實(shí)驗(yàn)共20個組(表2)。當(dāng)發(fā)酵因素的置信度高于90%(P＜0.05)時,表明其對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)有顯著影響。

表1 Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)的因素及水平Tab.1 Factors and levels of the Plackett-Burman Design experiment

表2 Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman Design experiment

根據(jù)PBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的3個發(fā)酵因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(表3)。參考王瑤等[20]的研究方法,依據(jù)3個發(fā)酵因素影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的正負(fù)效應(yīng),確定其爬坡方向和步長,快速逼近最佳區(qū)域,以此獲得Box-Behnken Design(BBD)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Design and results of Steepest Climbing experiment

根據(jù)PBD實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,使用軟件Design-Expert 11.0設(shè)計3因素3水平的BBD實(shí)驗(yàn)(表4)。BBD試驗(yàn)的因素為PBD實(shí)驗(yàn)篩選出的3個發(fā)酵因素,每個發(fā)酵因素設(shè)置3個水平,零水平(0)為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的中心點(diǎn),低水平(-1)和高水平(+1)為零水平的±1.5倍,其他發(fā)酵因素與其單因素實(shí)驗(yàn)的最佳值保持一致。BBD實(shí)驗(yàn)共17個組,包含5個中心點(diǎn)(表5)。BBD試驗(yàn)結(jié)果采用軟件 Design-Expert 11.0擬合回歸方程和方差分析,并通過回歸方程預(yù)測地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的最優(yōu)值及其對應(yīng)最優(yōu)發(fā)酵工藝。

表4 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)的因素及水平Tab.4 Factors and levels of Box-Behnken Design experiments

表5 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及結(jié)果Tab.5 Design and results of Box-Behnken Design experiment

根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將地衣芽孢桿菌FA6置于預(yù)測的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的實(shí)際值,并計算預(yù)測值與實(shí)際值的相對誤差。將在初始發(fā)酵培養(yǎng)基和初始發(fā)酵條件下發(fā)酵作為對照組,計算優(yōu)化效率。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)組間差異,以P＜0.05作為差異顯著性水平;采用Design Expert 11.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果分析,采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計和分析[21,22]。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

初始pH對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,在初始pH為4.0—10.0,隨著初始pH的增大,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)初始pH為7.0時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)達(dá)到最大,為1.00×109CFU/mL,但與初始pH為5.0、6.0或8.0的活菌數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。當(dāng)初始pH為4.0、9.0或10.0時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)顯著低于初始pH為7.0的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳初始pH為7.0。

圖1 不同發(fā)酵條件對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

接種量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,在接種量為0.5%時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最低,為1.37×109CFU/mL。在接種量為1%時,地衣芽孢桿菌FA6的活菌數(shù)最高,為2.08×109CFU/mL,顯著高于接種量為0.5%的活菌數(shù)(P＜0.05);并高于接種量為2%的活菌數(shù),但不顯著(P＞0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳接種量為1%。

發(fā)酵時間對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,隨著發(fā)酵時間的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。在發(fā)酵時間為20h時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為3.27×109CFU/mL,顯著高于其他所有發(fā)酵時間的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳時間為20h。

發(fā)酵溫度對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,隨著發(fā)酵溫度的升高,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。在發(fā)酵溫度為27℃時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為3.49×109CFU/mL,顯著高于發(fā)酵溫度為22和32℃時的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳溫度為27℃。

轉(zhuǎn)速對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,隨著轉(zhuǎn)速的增大,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為1.42×109CFU/mL,與轉(zhuǎn)速為120和180 r/min的活菌數(shù)無顯著差異(P＞0.05),但顯著高于轉(zhuǎn)速為60 r/min時的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

裝液量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖1所示,隨著裝液量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為0.94×109CFU/mL,并顯著高于裝液量為25 mL/250 mL和100 mL/250 mL的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵的最佳裝液量為50 mL/250 mL。

碳源及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖2所示,當(dāng)可溶性淀粉作為碳源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為1.08×109CFU/mL,其次是玉米淀粉,為1.0×109CFU/mL,且顯著高于對照組的活菌數(shù)(P＜0.05)。當(dāng)葡萄糖或蔗糖作為碳源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)均顯著低于LB培養(yǎng)基中的活菌數(shù)(P＜0.05),分別為3.12×107和4.37×107CFU/mL。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為可溶性淀粉。隨著可溶性淀粉添加量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)可溶性淀粉的添加量為50 g/L時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為3.05×109CFU/mL。綜上所述,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為可溶性淀粉,其最適添加量為50 g/L。

圖2 不同碳源、氮源或無機(jī)鹽及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of different carbon sources,nitrogen sources or inorganic salts and their concentration on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

氮源及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖2所示,當(dāng)酪蛋白胨作為氮源時,地衣芽孢桿菌活菌數(shù)最高,為1.85×109CFU/mL,其次是蛋白胨,為1.68×109CFU/mL,且顯著高于對照組的活菌數(shù)(P＜0.05)。當(dāng)大豆蛋白胨作為氮源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最低,為2.87×108CFU/mL,顯著低于對照組的活菌數(shù)(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源為酪蛋白胨。最佳氮源添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖2所示。隨著酪蛋白胨添加量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)?shù)刺砑恿繛?0 g/L時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為3.97×109CFU/mL。綜上所述,表明地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源為酪蛋白胨,其最適添加量為40 g/L。

無機(jī)鹽對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響如圖2所示,當(dāng)LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加MgSO4、KH2PO4、K2HPO4或Na2HPO4時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)均顯著高于對照組(P＜0.05)。當(dāng)LB培養(yǎng)基添加MgSO4時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最高,為2.84×109CFU/mL,與對照組差異顯著(P＜0.05)。當(dāng)加LB培養(yǎng)基添加CaCl2時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最小,為6.53×108CFU/mL,與對照組差異不顯著(P＞0.05)。綜上所述,MgSO4、KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4可作為無機(jī)鹽,添加至地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)PBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.9060,矯正系數(shù)R2Adj=0.7025,P=0.0385＜0.05,表明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽?表6)。可溶性淀粉(X1)、KH2PO4(X7)、發(fā)酵溫度(X11)和轉(zhuǎn)速(X13)對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)有顯著影響(P＜0.05),其顯著影響大小順序?yàn)? 發(fā)酵溫度＞可溶性淀粉＞轉(zhuǎn)速＞ KH2PO4(表6)。因此,發(fā)酵溫度、可溶性淀粉和轉(zhuǎn)速是影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)最顯著的3個發(fā)酵因素。

表6 Plackett-Burman Design實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.6 Statistical analysis of the Plackett-Burman Design experiment

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中,可溶性淀粉和轉(zhuǎn)速對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響具有正效應(yīng),其水平逐漸增加;發(fā)酵溫度具有負(fù)效應(yīng),水平逐漸減小(表3)。地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)在第3組實(shí)驗(yàn)達(dá)到最高值,為5.46×109CFU/mL,對應(yīng)的淀粉60g/L、發(fā)酵溫度27℃和轉(zhuǎn)速140 r/min可作為BBD實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)(表3)。

Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 10.0軟件對BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到二階回歸方程為:Y=674.00+12495A+27.35B+77.75C+17.20AB+53.85AC+32.20BC-273.43A2-23.08B2-3.27C2。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9326,矯正系數(shù)R2Adj=0.8460,表明該回歸方程的擬合性較好;回歸方程模型P=0.0024(＜0.01),失擬項(xiàng)P=0.6994(＞0.05),表明回歸方程的模型可信(表7)。因此,可用該回歸方程預(yù)測地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的最優(yōu)值?；貧w方程預(yù)測地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的最優(yōu)值為8.20×109CFU/mL,對應(yīng)發(fā)酵因素為: 發(fā)酵溫度(A)28.8℃、可溶性淀粉(B)70 g/L、轉(zhuǎn)速(C)160 r/min。

表7 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.7 Statistical analysis of Box-Behnken Design experiment

方差分析顯示,模型中可溶性淀粉和轉(zhuǎn)速的一次項(xiàng)差異顯著(P＜0.05),發(fā)酵溫度的二次項(xiàng)差異極顯著(P＜0.001),而發(fā)酵溫度、可溶性淀粉和轉(zhuǎn)速間的交互作用差異不顯著(P＞0.05;表7),表明各發(fā)酵因素對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響不是簡單的線性關(guān)系。

在響應(yīng)曲面圖中,發(fā)酵溫度的響應(yīng)曲面變化幅度最大且陡峭,其次是轉(zhuǎn)速,而可溶性淀粉響應(yīng)曲面變化幅度最小且不明顯(圖3),表明發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)。在等高線圖中,發(fā)酵溫度與可溶性淀粉和轉(zhuǎn)速的等高線圖呈橢圓形,可溶性淀粉與轉(zhuǎn)速的等高線圖呈圓弧形(圖3),表明發(fā)酵溫度與可溶性淀粉、轉(zhuǎn)速的交互作用顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù),而可溶性淀粉與轉(zhuǎn)速的交互作用影響不顯著。

圖3 發(fā)酵因素的交互作用影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的響應(yīng)曲面圖及等高線圖Fig.3 The interaction of fermentation factors influenced the response surface and contour plots of the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

優(yōu)化后的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下,實(shí)際發(fā)酵獲得的地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)為7.97×109CFU/mL,與預(yù)測最優(yōu)值的相對誤差為2.8%。對照組地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)為8.77×108CFU/mL,計算優(yōu)化效率為提高8.1倍。

3 討論

工業(yè)發(fā)酵微生物種類繁多,但魚類腸道益生菌發(fā)酵的研究相對較少。地衣芽孢桿菌FA6是本實(shí)驗(yàn)室從草魚腸道分離的一株芽孢桿菌,具有優(yōu)異的生物學(xué)特性和抗逆性,可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[8,23]。一般而言,魚類自身來源的益生菌更適應(yīng)魚類腸道環(huán)境,更易于在腸道中定殖,從而長期發(fā)揮益生作用[24]。優(yōu)化魚源益生芽孢桿菌的發(fā)酵工藝,能夠推動其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用,進(jìn)而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康與可持續(xù)發(fā)展。

適宜的培養(yǎng)條件有助于菌株的快速生長和代謝[25,26]。在本研究中,地衣芽孢桿菌FA6需要高轉(zhuǎn)速和低裝液量,這與丁泓皓等[27]研究結(jié)果一致。提高轉(zhuǎn)速和降低裝液量可以增加培養(yǎng)基的氧容量,從而促進(jìn)微生物的生長[28]。在高密度發(fā)酵時,可在地衣芽孢桿菌FA6的對數(shù)生長期采用增加通氣量和較大轉(zhuǎn)速來提高其生物量。研究發(fā)現(xiàn),溫度和pH會直接影響微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性[13]。地衣芽孢桿菌FA6的最佳發(fā)酵溫度和初始pH與其他研究[29—31]報道的芽孢桿菌的最佳溫度和初始pH不同,表明不同芽孢桿菌的培養(yǎng)條件有差異。因此,探究地衣芽孢桿菌FA6的最佳發(fā)酵條件顯得十分重要,也是開發(fā)優(yōu)良菌株至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素類型及其濃度在微生物的生長和代謝中起到重要作用[32]。碳源的代謝速率會影響微生物的生長和代謝,微生物可以直接吸收利用速效碳源,但速效碳源消耗太快易造成微生物營養(yǎng)缺乏,從而提早衰老和自溶;遲效碳源可以克服速效碳源代謝過快產(chǎn)生的弊端,并且營養(yǎng)豐富,來源廣泛,價格低廉[33]。值得注意的是,在本研究中可溶性淀粉比葡萄糖更合適作為地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。這與張皎皎等[26]研究結(jié)果相似,即可溶性淀粉作為碳源時,甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌WM-1的抑菌活性最強(qiáng),蔗糖作為碳源時,抑菌活性最低。本研究發(fā)現(xiàn),豆粕粉可以作為地衣芽孢桿菌FA6發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源,表明地衣芽孢桿菌FA6可以利用植物性蛋白。這使地衣芽孢桿菌FA6采用價格更便宜的植物性蛋白進(jìn)行發(fā)酵,降低發(fā)酵成本成為可能。在優(yōu)化無機(jī)鹽的實(shí)驗(yàn)中,無機(jī)鹽MgSO4對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的增加具有促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)镸g2+作為許多酶、ATP化合物、核糖體和細(xì)胞膜穩(wěn)定的輔助因子,能促進(jìn)微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用及其能量轉(zhuǎn)導(dǎo),從而提高微生物活菌數(shù)[32]。本研究篩選出的碳源、氮源和無機(jī)鹽及其濃度,對于后續(xù)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)具有重要的參考意義。

響應(yīng)面法是一種周期短、試驗(yàn)次數(shù)少和精度高且能同時研究多個因素的交互作用的分析方法,廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵工程[34,35]。目前利用響應(yīng)面法對芽孢桿菌產(chǎn)酶、胞外多糖和氨基酸等代謝產(chǎn)物的發(fā)酵優(yōu)化較為常見[36—38]。本研究通過PBD實(shí)驗(yàn)篩選出了顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的三個發(fā)酵因素: 可溶性淀粉、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度。進(jìn)一步分析等高線圖,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度與可溶性淀粉及轉(zhuǎn)速的交互作用對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響顯著,這與BBD實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果相反。推測是發(fā)酵溫度對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)的影響最顯著,并且發(fā)酵溫度逐漸升高時,對地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)增加具有極顯著的抑制作用,從而導(dǎo)致其與其他發(fā)酵因素的交互作用顯著。地衣芽孢桿菌FA6采用最佳發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵,實(shí)際獲得的活菌數(shù)與預(yù)測值的相對誤差小于5%,表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝可行且有效[39]。

4 結(jié)論

本研究以地衣芽孢桿菌FA6為研究對象,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)對發(fā)酵初始pH、接種量和發(fā)酵時間等發(fā)酵條件,以及培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機(jī)鹽的種類及添加量進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基: 70 g/L可溶性淀粉、40 g/L酪蛋白胨、2 g/L K2HPO4、1 g/L KH2PO4、2 g/L Na2HPO4、2 g/L MgSO4和8 g/L NaCl;以及最佳發(fā)酵條件: 初始pH 7.0、接種量 1%、發(fā)酵溫度 28.8℃、發(fā)酵時間 31h、裝液量 50 mL/250 mL和轉(zhuǎn)速160 r/min。在此發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下,地衣芽孢桿菌FA6活菌數(shù)可達(dá)7.97×109CFU/mL,較優(yōu)化前提高了8.1倍。最佳發(fā)酵工藝的獲得,將能夠?yàn)轸~源芽孢桿菌的高密度生產(chǎn),產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)。