趙雅潔 李國慶 王業(yè)平 金齊德 鄧道貴

(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,淮北 235000)

溞屬枝角類隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼亞門、鰓足綱,它們不僅能夠濾食水體中的細菌、藻類及碎屑,而且還是一些無脊椎動物和淡水魚類的重要餌料,在水生食物鏈中發(fā)揮著承上啟下的作用[1,2]。通常,溞屬枝角類的生殖方式有兩種,即孤雌生殖和兩性生殖。當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化時,枝角類可通過生殖方式的改變以適應(yīng)變化的環(huán)境[3,4]。當(dāng)環(huán)境條件良好時(如食物豐富、溫度適宜等),枝角類進行孤雌生殖,迅速擴大種群數(shù)量,而當(dāng)環(huán)境條件惡化時(如溫度過高或過低、食物匱乏、種群密度高等),枝角類進行兩性生殖,產(chǎn)生雄體和兩性生殖雌體,受精后形成休眠卵[1,5]。

有關(guān)甲殼動物生殖的分子機制研究已有一些報道,但主要集中在生殖轉(zhuǎn)換方面的研究。隆線溞(Daphnia carinata)中的dsx1基因和蚤狀溞(Daphnia pulex)中的tra基因在兩性生殖雌性中的表達量均高于孤雌生殖雌性[6,7]。Li等[8]還發(fā)現(xiàn),CSP2和CSP3基因在隆線溞兩性生殖雌體的表達量高于孤雌生殖雌體。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn),MrFoxl2基因可能在雌性和雄性羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的性腺發(fā)育中發(fā)揮作用。通過不同生活史階段的轉(zhuǎn)錄組分析,Wang等[10]篩選了中華擬同形溞與雄性偏向相關(guān)的基因(Male-biased genes)。上述研究關(guān)注了甲殼動物中雌雄轉(zhuǎn)化或性別決定中一些特定基因的作用。但與甲殼動物生殖直接相關(guān)的基因研究較少。通常,卵黃蛋白原(Vtg)是卵生動物卵黃蛋白的前體,為卵生生物的胚胎發(fā)育提供能量儲備,在生殖和胚胎發(fā)育中起著十分重要作用[11]。Schlotz等[12]觀察到,大型溞生殖量的增加伴隨著卵黃蛋白原(Vtg)基因表達量的增加。當(dāng)大型溞暴露于鄰苯二甲酸丁芐酯或聚氯乙烯微塑料后,其體內(nèi)卵黃蛋白基因的表達量降低,相應(yīng)的后代數(shù)量也減少[13,14]。此外,另一些基因也參與了甲殼動物的生殖和胚胎發(fā)育。Zhao等[15]認為MnCatL基因參與了日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的卵巢成熟與胚胎發(fā)育。通過RNA干擾實驗,Kato等[16]發(fā)現(xiàn),Distal-less(Dll)基因的沉默抑制了大型溞(Daphnia magna)的胚胎發(fā)育。Cho等[17]研究發(fā)現(xiàn),對苯基苯酚能夠影響大型溞生殖和發(fā)育基因(EcR-A、EcR-B、Jhe和Vtg)的表達。由此可見,與溞屬枝角類生殖相關(guān)的分子機理研究是十分不足的。

中華擬同形溞(D.sinensis)是一種常見的溞屬枝角類,廣泛分布于長江中下游湖泊中[18]。有研究顯示,在受到魚類信息素脅迫時,溞屬枝角類性腺發(fā)育的加快導(dǎo)致了性成熟提前,且首次懷卵數(shù)增加、后代體型變小[19,20]。在本研究中,在鳙信息素的誘導(dǎo)下,使用轉(zhuǎn)錄組測序和qPCR技術(shù),篩選了中華擬同形溞與生殖相關(guān)的候選基因,并運用RNA干擾技術(shù)對2個候選基因的功能進行了分析,我們的結(jié)果將為進一步研究枝角類生殖的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斜生四鏈藻(Tetradesmus obliquus)購于中國科學(xué)院水生生物研究所,置于溫度為(25±1)℃、光照強度為2200 lx、光暗比為12h∶12h的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(G70P-270D型,寧波賽福),培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基。當(dāng)細胞達到指數(shù)生長期時收集,濃縮后放于4℃冰箱中保存。

鳙(Aristichthys nobilis)1條,來自1個小型漁業(yè)養(yǎng)殖湖泊,其鮮重約為1 kg、體長約30 cm。在實驗室水族箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)液為20 L曝氣48h以上的自來水),每天更換培養(yǎng)液,并投喂約1000只的中華擬同形溞,共收集2d的鳙生活水用于后續(xù)實驗,魚類生活水的收集參照Hahn等[21]和Alkimin等[22]的方法。鳙生活水首先用100目篩子(孔徑為0.15 mm)過濾,去除較大顆粒的雜質(zhì),再使用0.45 μm的Whatman(GF/F)玻璃纖維濾膜過濾,濾過液保存在-20℃冰箱中待用。

1.2 中華擬同形溞的培養(yǎng)與收集

中華擬同形溞來自安徽巢湖的休眠卵孵化,培養(yǎng)在智能光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃、光照強度為2200 lx、光暗比為12h∶12h,食物為20 mg/L濕重的斜生四鏈藻。

為了開展不同齡期中華擬同形溞的轉(zhuǎn)錄組分析,雌性幼溞(JF)、成熟前1齡雌溞(BM)、第1成齡雌溞(MA)和第4成齡雌溞(RF)等4個齡期的中華擬同形溞樣本被收集。每個雌性幼溞樣本約500只,其他3個齡期每個樣本約60只。每個齡期收集3個樣本作為生物學(xué)重復(fù),進行轉(zhuǎn)錄組測序。實驗時,在每個50 mL燒杯中放入1只中華擬同形溞,加入40 mL的培養(yǎng)液,培養(yǎng)液為曝氣48h以上的自來水,2d更換1次培養(yǎng)液。約540只實驗溞均來自同一中華擬同形溞克隆出生不超過6h的后代,分四批培養(yǎng),分別收集4個不同齡期的中華擬同形溞樣本。其中,成熟前1齡雌溞、第1成齡雌溞和第4成齡雌溞等樣本各需180只實驗溞(即540只,60×3×3);另20只實驗溞培養(yǎng)后,用于收集1500只幼溞樣本(即500×3),幼溞均為產(chǎn)出后不超過6h的后代。每個燒杯中的食物均為20 mg/L濕重的斜生四鏈藻,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃、光照強度為2200 lx、光暗比為12h∶12h。將收集到的JF、BM、MA和RF樣本分別放入含有RNA保存液的1.5 mL EP管中,在4℃冰箱中過夜,再放入-80℃冰箱中保存。

1.3 篩選中華擬同形溞與生殖相關(guān)基因的樣本收集

根據(jù)孫雨琛[23]的實驗結(jié)果,鳙信息素(鳙生活水)能夠顯著增大中華擬同形溞的生殖量。在本實驗中,設(shè)置3個鳙生活水濃度組,即F0組(40 mL培養(yǎng)液)、F20組(8 mL魚水+32 mL培養(yǎng)液)和F30組(12 mL魚水+28 mL培養(yǎng)液)。實驗時,在每個50 mL燒杯中放入1只中華擬同形溞(出生時間＜6h),每天更換1次相應(yīng)的魚水和培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為曝氣48h以上的自來水。在實驗期間記錄中華擬同形溞的產(chǎn)幼溞數(shù),并收集第4成齡的中華擬同形溞作為檢測其候選基因表達量的樣本。統(tǒng)計分析顯示,F20和F30組下第4成齡的中華擬同形溞產(chǎn)幼溞數(shù)均顯著大于F0組(P＜0.05)。

1.4 中華擬同形溞轉(zhuǎn)錄組序列分析

RNA提取與檢測、文庫構(gòu)建與質(zhì)檢采用RNA試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)提取中華擬同形溞中的總RNA,而后對RNA樣品進行嚴格質(zhì)控,在NEB Fragmentation Buffer中使用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷,并按照NEB建庫方式建庫。再使用Qubit2.0 Fluorometer對文庫進行初步定量,隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer(Santa Clara,CA,USA)對文庫的insert size進行檢測,qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量,最后由Illumina測序。

轉(zhuǎn)錄本的拼接與功能注釋對于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序,獲得clean reads后,采用Trinity進行拼接[24]。為了識別個別樣品中低表達或者只檢測到部分片段的基因,對所有樣品進行了合并組裝。結(jié)合unigene序列,在Nr、Nt、KOG、Swissprot、Uniprot、KEGG和GO等七大數(shù)據(jù)庫中進行基因功能注釋[25]。

差異表達基因與富集分析使用DEGseq2對JFvs.BM、JFvs.MA、JFvs.RF、MAvs.RF、BMvs.MA和BMvs.RF等6個組合的差異表達基因進行分析,篩選標準為|log2(FoldChange)|＞1和padj＜0.05。采用diamond和clusterProfiler軟件對差異表達基因進行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析等。

與生殖相關(guān)的候選基因的篩選在BMvs.JF、MAvs.JF、RFvs.JF、RFvs.MA、MAvs.BM和RFvs.BM等6個組合中,選擇每個組合的前30個上調(diào)基因進行篩選,一共篩選出163個差異表達基因。使用Beacon Designer軟件設(shè)計引物,內(nèi)參基因為GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)。GADPH是一種多功能蛋白,是糖代謝的關(guān)鍵酶,在不同生物中具有高度保守性,常作為內(nèi)參基因用于基因表達定量的研究中[26,27]。qPCR使用LightCycler?96 儀器,反應(yīng)程序為: 95℃預(yù)變性10min;95℃變性 10s,60℃退火30s,40個循環(huán),數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算。根據(jù)魚類信息素脅迫實驗結(jié)果,收集魚類信息素組與對照組第五成齡的中華擬同形溞為樣本進行qPCR實驗,根據(jù)其表達量的差異(F20與F30組的表達量顯著高于F0,且F20與F30無顯著性差異)篩選出與生殖相關(guān)的候選基因。RNA提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑均來自TaKaRa公司。

1.5 RNA干擾

dsRNA制備根據(jù)qPCR結(jié)果,選擇Cluster-13168.22885 (Dsmapk)和Cluster-13168.32243(Dsussp)基因作為目的基因進行功能分析。目的質(zhì)粒(質(zhì)粒載體均為L4440)由通用生物公司構(gòu)建,將L4440空載、L4440-EGFP質(zhì)粒和目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入HT115感受態(tài)細胞,菌種在雙抗培養(yǎng)基(四環(huán)素:10 μg/mL,氨芐青霉素: 100 μg/mL)中擴大培養(yǎng)至A600≈0.8,而后使用IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)或乳糖誘導(dǎo)dsRNA[28]。經(jīng)凝膠電泳檢測,其中一號泳道(496 bp)和4號泳道(518 bp)為目的條帶(圖1)。L4440為空白對照,EGFP為陰性對照[16]。

圖1 dsRNA誘導(dǎo)圖Fig.1 The induction of double strand RNA

RNA干擾飼喂實驗實驗設(shè)置2個食物濃度,即2%大腸桿菌濃度組(2%大腸桿菌+98%斜生四鏈藻)和5%大腸桿菌濃度組(5%大腸桿菌+95%斜生四鏈藻),食物總生物量為20 mg/L。除含有L4440空載的大腸桿菌不需誘導(dǎo)外,含有L4440-Dsmapk、L4440-Dsussp和EGFP質(zhì)粒的大腸桿菌均需分別誘導(dǎo)出其dsRNA后再用于飼喂實驗。在每個食物濃度組下,分別培養(yǎng)15個中華擬同形溞,設(shè)3個平行,共計45個實驗溞。實驗溞為中華擬同形溞第三代幼溞(出生時間＜6h)。實驗時,在每個50 mL燒杯中放入1只中華擬同形溞,加入40 mL培養(yǎng)液,每天更換培養(yǎng)液,實驗持續(xù)10d,實驗溞可生長到第7齡期。實驗期間,記錄中華擬同形溞的首次懷卵數(shù)、產(chǎn)幼溞數(shù)。實驗結(jié)束后收集樣本,使用qPCR檢測RNA干擾后目的基因(Dsussp和Dsmapk)的表達量變化。目的基因的引物見表1,GAPDH基因作為參照。

表1 引物名稱及序列Tab.1 Names and sequences of primers used in the experiment

2 結(jié)果

2.1 中華擬同形溞轉(zhuǎn)錄組的裝配、注釋及物種同源性分析

對中華擬同形溞的JF、BM、MA和RF樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得105789條transcripts,總長度238094433 bp,平均長度2250.6 bp,N50長度4890 bp;獲得104071條unigenes,總長度237614979 bp,平均長度2283.2 bp,N50長度4898 bp(表2)。結(jié)合BLASTX程序與Nr、KOG、Uniprot等數(shù)據(jù)庫,與獲得的unigenes進行比對,Nr數(shù)據(jù)庫注釋到的最多(74586條,占71.67%),其次為Nt(20690條,占19.88%;表3)。將中華擬同形溞unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫中進行相似序列匹配,與其同源性序列比例較高的近緣物種分別為D.magna(76.37%)、other(14.88%)、Diploscap ter pachys(3.22%)、D.pulex(3.11%)、Ricinus communis(1.3%)和Beauveria bassiana D1-5(1.12%)。

表2 中華擬同形溞的轉(zhuǎn)錄組裝配分析Tab.2 Assembly analysis of transcriptome inD.sinensis

表3 中華擬同形溞轉(zhuǎn)錄組unigenes功能注釋與統(tǒng)計Tab.3 Summary statistics of function annotation of unigenes inD.sinensis

2.2 中華擬同形溞不同齡期基因的差異表達分析

將JF、BM、MA和RF四個齡期測序所獲得的基因進行兩兩比較,BMvs.MA的DEGs中有1248個上調(diào)基因、331個下調(diào)基因;BMvs.RF的DEGs中有184個上調(diào)基因、111個下調(diào)基因;JFvs.BM的DEGs中有750個上調(diào)基因、1441個下調(diào)基因;JFvs.MA的DEGs中有4650個上調(diào)基因、2496個下調(diào)基因;JFvs.RF的DEGs中有541個上調(diào)基因、755個下調(diào)基因;MAvs.RF的DEGs中有243個上調(diào)基因、1146個下調(diào)基因。

2.3 中華擬同形溞基因的富集分析和功能注釋

GO富集分析顯示,中華擬同形溞的unigenes序列分為3大類,60個小類,其中1—20歸入生物過程(Biological process),21—40歸入細胞組分(Cellular component),41—60歸入分子功能(Molecular function)。細胞分化(Cell differentiation)和多細胞生物發(fā)育(Multicellular organism development)在生物過程分類中占比較高,細胞質(zhì)(Cytoplasm)和細胞核(Nucleus)在細胞組分分類中占比較高,而催化活性(Catalytic activity)和蛋白結(jié)合(Protein binding)在分子功能分類中占比較高(圖2)。

圖2 中華擬同形溞unigenes的GO功能分類Fig.2 GO functional classificati on of unigenes inD.sinensis

2.4 候選基因的篩選

在魚類信息素脅迫下,中華擬同形溞在第4至第6成齡的產(chǎn)幼溞數(shù)明顯高于對照組(圖3),且在第4、5和6成齡時F0組的產(chǎn)幼溞數(shù)均顯著小于F20和F30組(P＜0.05),而F20組的產(chǎn)幼溞數(shù)與F30組則沒有顯著性差異。我們選取了第5成齡的中華擬同形溞作為后續(xù)qPCR驗證的實驗樣本。

圖3 不同魚類信息素濃度下中華擬同形溞的產(chǎn)幼溞數(shù)Fig.3 Number of offspring ofD.sinensisunder different fish kairomone concentrations

分別在BMvs.JF、MAvs.JF、RFvs.JF、RFvs.MA、MAvs.BM、RFvs.BM組合中選擇前30個上調(diào)基因,共獲得163個差異表達基因。再通過qPCR驗證,篩選出19個與中華擬同形溞生殖相關(guān)的候選基因。這些基因在F0中的表達量均顯著小于F20和F30(P＜0.05),推測這些基因可能與中華擬同形溞的生殖相關(guān)(圖4和表4)。其中一些基因被注釋為酶,一些被注釋為蛋白,還有一些未被注釋,Cluster-13169.30254基因在Nr中被注釋為vitellogenin,卵黃蛋白原在生殖和發(fā)育中起重要作用(表4)。

圖4 與中華擬同形溞生殖相關(guān)基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of mRNA of the genes related to reproduction ofD.sinensis

2.5 兩個候選基因的功能分析

根據(jù)19個中華擬同形溞與生殖相關(guān)的候選基因表達水平,Dsmapk和Dsussp基因被選擇進行功能分析。在2%大腸桿菌濃度組,與EGFP組相比,Dsmapk和Dsussp基因的表達量分別下降了28.1%和32.3%;在5%大腸桿菌濃度組,Dsmapk和Dsussp基因的表達量與EGFP組相比分別下降了41.1%和55.6%。在2%和5%大腸桿菌濃度下,L4440組與EGFP組的表達量間均無顯著差異。這些結(jié)果表明,較高濃度大腸桿菌的RNA干擾對中華擬同形溞的Dsmapk和Dsussp基因的干擾效果更明顯(圖5)。

圖5 RNA干擾后中華擬同形溞Dsmapk和Dsussp基因的相對表達量Fig.5 Relative expression mRNA ofDsmapkandDsusspgenes inD.sinensisafter RNAi

在2%大腸桿菌濃度下,Dsmapk和Dsussp組的首次懷卵數(shù)均顯著小于L4440組和EGFP組(P＜0.01);在第5、第6和第7齡期,Dsmapk和Dsussp組的產(chǎn)幼溞數(shù)均顯著小于L4440組和EGFP組(P＜0.01)。在5%大腸桿菌濃度下,Dsussp組的首次懷卵數(shù)顯著小于L4440組(P=0.017);在第5、第6和第7齡期,Dsmapk和Dsussp組的產(chǎn)幼溞數(shù)均顯著小于L4440組和EGFP組(P＜0.01;圖6)。

圖6 RNA干擾后中華擬同形溞的首次懷卵數(shù)及產(chǎn)幼溞數(shù)變化Fig.6 Number of eggs at the first pregnancy and number of offspring ofD.sinensisafter RNAi

3 討論

枝角類生殖轉(zhuǎn)換的分子機理一直是生物學(xué)家研究的熱點[6,10,29]。Chen等[6]通過RACE技術(shù)克隆了蚤狀溞tra基因的全長,并觀察到在其雄性、兩性生殖雌性、孤雌生殖雌性、休眠卵和雌性幼體中tra基因的表達量逐漸降低。Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn),角質(zhì)層蛋白(CP)在隆線溞兩性生殖雌性中的表達量高于孤雌生殖雌性,并認為這可能與卵鞍角質(zhì)層的形成有關(guān)。CSP2和CSP3基因在隆線溞兩性生殖雌性中的表達量高于孤雌生殖雌性,且主要在卵巢、胸肢和第二觸角處表達[8],這暗示CSP2和CSP3可能與隆線溞的生殖轉(zhuǎn)換有關(guān)。此外,Zhang等[7]發(fā)現(xiàn),Dsx1基因在隆線溞孤雌生殖雌性中的表達量明顯小于兩性生殖雌性,并認為Dsx1基因在隆線溞生殖轉(zhuǎn)換和性別分化過程中也可能發(fā)揮著重要作用。但是,與枝角類生殖相關(guān)基因的研究偏少。通常,卵黃蛋白原被認為與動物的生殖發(fā)育密切相關(guān),它是雌性個體在卵子發(fā)生過程中對雌二醇正常周期的反應(yīng)而產(chǎn)生的,并在卵母細胞內(nèi)進行蛋白水解,形成積累的卵黃蛋白,其中最為常見的是脂蛋白和磷脂[31,32]。Gust等[33]發(fā)現(xiàn),1-甲基-3-硝基-1-硝基胍(MeNQ)會使蚤狀溞的后代數(shù)量減少,伴隨著vtg-1前體的mRNA表達量降低,并認為卵黃蛋白原在溞屬的生殖中起著重要的作用,是卵母細胞大小及質(zhì)量的關(guān)鍵指標。

在枝角類中,蚤狀溞的全基因組序列已被檢測,包含至少30907個基因,其中擴增最多的基因家族是枝角類譜系特有的[34],這為我們開展溞屬枝角類相關(guān)分子機理研究提供了基礎(chǔ)。此外,由于RNA序列具有高度敏感性,科研工作者常用RNA-seq研究生態(tài)學(xué)和生物進化中的重要問題[35—38]。Klumpen等[39]研究發(fā)現(xiàn),處于饑餓狀態(tài)下的蚤狀溞的蛋白質(zhì)生物合成基因表達量下調(diào)了,而碳水化合物代謝基因表達量上調(diào)了,這與動物在饑餓時先利用碳水化合物、而后利用脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的機理相吻合。在本研究中,對中華擬同形溞雌性幼溞(JF)、成熟前1齡雌溞(BM)、第1成齡雌溞(MA)和第4成齡雌溞(RF)等4個齡期樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序,通過qPCR分析,共篩選出19個與中華擬同形溞生殖相關(guān)的候選基因。

RNAi技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用在枝角類相關(guān)基因的功能分析上。Kato等[11]發(fā)現(xiàn),將DII基因的dsRNA注射到大型溞的卵中,導(dǎo)致了大型溞體內(nèi)的DIImRNA降解,并造成大型溞的第二觸角發(fā)生斷裂。此外,將猩紅直系同源體(St)基因的dsRNA注射到大型溞的卵中,Ismail等[40]觀察到大型溞胚胎的復(fù)眼和單眼中的黑色素均消失了。通過將蚤狀溞浸泡在tradsRNA溶液中的實驗,Guo等[41]發(fā)現(xiàn),蚤狀溞體內(nèi)tra基因的表達量顯著下降了。通過飼喂含有誘導(dǎo)的CYP302A1dsRNA的大腸桿菌,Qi等[42]發(fā)現(xiàn),中華擬同形溞體內(nèi)的CYP302A1基因表達量顯著下降了。在本研究中,通過飼喂含有目的基因dsRNA的5%大腸桿菌,中華擬同形溞體內(nèi)目的基因(Dsmapk和Dsussp)的表達量均顯著下降了。同時,與對照組(EGFP)相比,Dsmapk和Dsussp組中的中華擬同形溞生殖量顯著減少,且經(jīng)過RNAi后實驗?zāi)笢挟a(chǎn)出的后代甚至出現(xiàn)發(fā)育不完全或畸形的現(xiàn)象,這些結(jié)果均證實Dsmapk和Dsussp基因與中華擬同形溞的生殖活動密切相關(guān)。此外,Dsmapk基因在2%和5%大腸桿菌濃度組的表達量分別下降了28.1%和41.1%,而Dsussp基因在2%和5%大腸桿菌濃度組的表達量分別下降了32.3%和55.6%,這暗示較高濃度的大腸桿菌對中華擬同形溞目的基因的干擾效果更明顯,同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在中華擬同形溞與蛻皮相關(guān)的基因中[42]。由此可見,本研究認為Dsmapk和Dsussp基因參與了中華擬同形溞的生殖活動。本實驗結(jié)果可為今后深入開展Dsmapk和Dsussp基因的功能研究提供參考。