賈曉丹 梁旭方 何 珊

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚(yú)研究中心,武漢 430070;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

體色在動(dòng)物的生存繁衍、逃避敵害、信號(hào)交流和光保護(hù)等方面起著重要作用,是脊椎動(dòng)物多樣性最豐富的形態(tài)之一[1]。魚(yú)體顏色不僅會(huì)隨著生命周期的改變而改變,紫外線、攝食及水體背景顏色也會(huì)影響魚(yú)體顏色[2]。例如斑馬魚(yú)(Danio rerio)會(huì)迅速通過(guò)細(xì)胞中黑色素的聚集或分散來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化[3]。魚(yú)類之所以擁有五彩斑斕的體色,是由于魚(yú)體中存在無(wú)數(shù)的色素細(xì)胞,而黑色素細(xì)胞是目前研究最為廣泛且深入的色素細(xì)胞類型[4,5]。

黑素皮質(zhì)素 1 受體基因(Melanocortin 1 receptor,mc1r)屬于黑素皮質(zhì)素家族成員,最早在黑色素細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),是皮膚黑色素合成的關(guān)鍵基因[1],mc1r無(wú)內(nèi)含子且其蛋白包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,mc1r可以與促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)與促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)結(jié)合形成偶聯(lián)受體,并且α-MSH與mc1r的親和力更高,是皮膚黑色素合成主要信號(hào)通路[7,8]。目前,mc1r結(jié)構(gòu)、功能及毛色表型在人、鼠、豬和牛等哺乳動(dòng)物中已有較為深入研究,在大菱鲆(Scophthalmus maximus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)和斑馬魚(yú)等少數(shù)魚(yú)類中也進(jìn)行了初步研究[4,9,10]。有研究顯示魚(yú)類體色的深淺與mc1r基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[11]。斑馬魚(yú)mc1r基因敲除導(dǎo)致其背部和腹側(cè)皮膚色素沉著顯著減少[12]。mc1r基因的改變與穴居魚(yú)(Astyanax)色素沉積減少有關(guān)[13]。甌江彩鯉(Cyprinus carpio var.color)在敲除mc1r基因后,會(huì)改變皮膚斑塊形成模式[14]。在日本比目魚(yú)(Paralichthys olivaceus)中發(fā)現(xiàn)mc1r在色素沉著區(qū)域具有高的基因表達(dá)量[15]。同時(shí)mc1r可以作為魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育研究的良好分子標(biāo)記。

鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目,真鱸科,鱖屬,是主要原產(chǎn)湖北的我國(guó)傳統(tǒng)名貴肉食性魚(yú),肉質(zhì)細(xì)嫩,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的理想選擇[16]。養(yǎng)殖過(guò)程發(fā)現(xiàn),同種鱖在不同的養(yǎng)殖環(huán)境中其體色及色彩圖案有明顯區(qū)別。為了清楚mc1r在不同表型魚(yú)體中的表達(dá)模式,以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)擬以鱖為研究對(duì)象,從鱖基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取mc1r基因序列并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析,其次通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同養(yǎng)殖背景下產(chǎn)生的深淺色鱖組織表達(dá)差異。最后通過(guò)對(duì)mc1r基因5′-側(cè)翼區(qū)啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆和轉(zhuǎn)錄活性分析,鑒定鱖mc1r基因核心啟動(dòng)子區(qū)域及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,從而為魚(yú)類mc1r基因的表達(dá)調(diào)控及后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)所用鱖來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖研究中心,將實(shí)驗(yàn)魚(yú)分別放入黑、白背景并帶有連續(xù)水過(guò)濾和通風(fēng)系統(tǒng)的圓形魚(yú)缸中,魚(yú)缸直徑為1 m,水深1.2 m,光照為自然光。每個(gè)魚(yú)缸12尾魚(yú)(80±5) g,每組3個(gè)重復(fù),正常飼養(yǎng)3個(gè)月。在養(yǎng)殖結(jié)束后,從每個(gè)魚(yú)缸中隨機(jī)選取6尾魚(yú),150 mg/L MS-222麻醉后解剖以獲得肝臟、腸道、肌肉、背部皮膚、腹部皮膚、鰓、心臟、眼睛、大腦和腎臟組織,并在液氮中快速冷凍,隨后在-80℃冰箱保存,用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.2 mc1r生物信息學(xué)分析

鱖mc1r基因序列來(lái)自筆者所在課題組翹嘴鱖基因組數(shù)據(jù)庫(kù),利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 檢索人(NP_002377.4)、鼠(NP_032585.2)、歐洲鱸(CAY39344.1)、大口黑鱸(XP_038556432.1)、尼羅羅非魚(yú)(XP_005467175.1)、青鳉(XP_01149 0066.1)、斑馬魚(yú)(NP_851301.1)、虹鱒(NP_00118 2107.1)、河豚(NP_001127927.1)、大西洋鮭(XP_013982515.1)、大菱鲆(XP_035485284.1)、日本比目魚(yú)(XP_019954259.1)、尖吻鱸(XP_01852 3508.1)、雞(NP_001026633.2)氨基酸序列。使用SMART(https://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)分析蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),利用Clustal分析氨基酸序列一致性,并利用MEGA10.0軟件以鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(bootstrap=1000)。

1.3 組織表達(dá)分析

利用NCBI設(shè)計(jì)mc1r的特異性引物mc1r-F和mc1r-R,并以鱖核糖體蛋白L13a(rpl13a)作內(nèi)參基因用于組織表達(dá)分析,所用引物見(jiàn)表1。使用RNAiso Plus (TaKaRa)提取鱖不同組織總RNA,然后用多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的純度和濃度。使用HiScript?ⅡReverse Transcriptase (Vazyme)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,置于-20℃ 冰箱保存。以cDNA為模板,使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)進(jìn)行RT-qPCR,RT-qPCR反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μL,上游引物和下游引物各0.4 μL,SYBR 10 μL,用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃,預(yù)變性3min,95℃變性10s,57℃退火30s,進(jìn)行39個(gè)循環(huán),72℃延伸45s。并使用2-ΔΔCt值法測(cè)定mc1r基因的相對(duì)表達(dá)量[17]。

表1 組織表達(dá)分析所用引物Tab.1 Primers for tissue expression analysis

1.4 mc1r基因啟動(dòng)子不同片段克隆和分析

通過(guò)在線軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net)、AliBaba2.1(http://gene regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)預(yù)測(cè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)和TATA盒由BDGP(http://www.fruitfly.org/seqtools/promoter.html) 和Promoter 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測(cè)。以鱖仔魚(yú)DNA為模板,選擇鱖mc1r第一外顯子之前的啟動(dòng)子序列作為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段的擴(kuò)增引物,所設(shè)計(jì)的引物見(jiàn)表2,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL: 鱖基因組DNA 1 μL,ddH2O 8 μL,高保真酶10 μL,上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,57℃退火15s,72℃延伸(2 kb/min),35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。

表2 鱖魚(yú)基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段的擴(kuò)增引物Tab.2 Primers used for fragments amplification of Chinese perchmc1rpromoter

1.5 雙熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建

將pGL3-Basic質(zhì)粒用kpnⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶雙酶切。將擴(kuò)增正確的PCR產(chǎn)物膠回收后克隆到雙酶切的pGL3-Basic質(zhì)粒中,選擇陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-2065、pGL3-1903、pGL3-1730、pGL3-991和pGL3-461。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性測(cè)定

如前所述,進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性測(cè)定[18]。HEK 293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前在24孔板中鋪板,并在37°C的充滿5% CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng),使轉(zhuǎn)染當(dāng)天的細(xì)胞總量達(dá)到75%。然后按照制造商的說(shuō)明使用lip2000 (Promega) 以pGL3-basic載體作為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染鱖mc1r不同啟動(dòng)子片段重組質(zhì)粒。每孔轉(zhuǎn)染液為opti-MEM培養(yǎng)基100 μL,質(zhì)粒500 ng,pRL-TK 20 ng,lip2000 1.5 μg。培養(yǎng)24h后,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用1x DPBS洗滌兩次后用裂解緩沖液(Promega)裂解細(xì)胞,之后收集細(xì)胞,并根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)檢測(cè)mc1r啟動(dòng)子相對(duì)活性。啟動(dòng)子的相對(duì)活性用螢火熒光素酶的值/海腎熒光素酶的值表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以鱖rpl13a作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平[17],單因素方差分析(One-way ANOVA)用來(lái)檢測(cè)樣本之間的差異性。使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行繪圖。統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 鱖體色

鱖體色如圖1所示,在黑色和白色背景魚(yú)缸中養(yǎng)殖3個(gè)月后,黑色背景魚(yú)缸中養(yǎng)殖的鱖體色較深(圖1A),而白色背景魚(yú)缸中養(yǎng)殖的鱖體色較淺(圖1B)。

圖1 黑、白色養(yǎng)殖背景產(chǎn)生的深色鱖和淺色鱖Fig.1 Black and white tank backgrounds produced the dark and light-colored Chinese perch phenotype

2.2 鱖mc1r基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)鱖基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI下載的基因序列可知,mc1r基因開(kāi)閱讀框?yàn)?78 bp,編碼325個(gè)氨基酸且3′末端具有1 bp的Poly(A)尾巴,但不含脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)(AATAAA)。通過(guò)TMHMM和Conserved Domains分析發(fā)現(xiàn)鱖mc1r基因的蛋白也為7跨膜結(jié)構(gòu)域,其他報(bào)道物種相符。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示Mc1r蛋白包含169個(gè)α螺旋(52.00%)、10個(gè)β折疊(3.08%)、98個(gè)無(wú)規(guī)卷曲(27.38%)和57個(gè)延伸結(jié)構(gòu)(17.54%)。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明,該蛋白也主要以α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主(圖2)。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,鱖mc1r基因與大口黑鱸(Micropterus salmoides)同源性高達(dá)95.7%,與歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)同源性為95.4%,且聚為一支;其他魚(yú)類如斑馬魚(yú)(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鮭(Salmo salar)聚為另一支;而與人類(Homo sapiens)及小鼠(Mus musculus)的同源性較低(圖3)。

圖2 鱖Mc1r蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of Mc1r protein in Chinese perch

圖3 鱖與其他脊椎動(dòng)物mc1r基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequence ofmc1rgene in andarin fish and other vertebrates

2.3 表達(dá)差異分析

如圖4所示,對(duì)于深色體表鱖,其表達(dá)量由高到低依次為背部皮膚、腹部皮膚、肝臟、眼、腦、腎臟、肌肉、心臟、鰓和腸,且背部皮膚表達(dá)量最高,顯著高于其他組(P＜0.05)。在淺色體表鱖中,腦中表達(dá)量最高,其次是腹部皮膚,且顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖4 鱖mc1r在不同組織中的表達(dá)分析Fig.4 Analysis ofmc1rexpression among different tissues in Chinese perch

2.4 mc1r基因啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建

將構(gòu)建成功的pGL3-2065、pGL3-1903、pGL3-1730、pGL3-991和pGL3-461重組質(zhì)粒電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn),目的條帶與PCR產(chǎn)物條帶一致,經(jīng)測(cè)序與啟動(dòng)子序列一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并可以用于啟動(dòng)子活性分析。

2.5 mc1r啟動(dòng)子報(bào)告基因活性檢測(cè)

將構(gòu)建好的鱖mc1r重組質(zhì)粒和pGL3-basic對(duì)照質(zhì)粒分別與pRL-TK瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞,培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞,并檢測(cè)各重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的熒光值,分析各個(gè)重組質(zhì)粒的活性。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒熒光活性與對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic均有顯著性差異(P＜0.05),其中pGL3-461的相對(duì)熒光活性最高,提示-159∽+292為鱖mc1r基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域。隨著啟動(dòng)子區(qū)域逐漸截短,pGL3-991熒光素酶活性明顯低于pGL3-461,說(shuō)明-159∽+292 bp可能存在轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合位點(diǎn)或正向調(diào)控元件;-698∽-160 bp可能具有轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)調(diào)控元件(圖5)。通過(guò)在線軟件JASPAR和AliBaba 2.1預(yù)測(cè)可知預(yù)測(cè)出的核心啟動(dòng)子區(qū)域存在小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)和SP-1等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。

圖5 鱖mc1r基因不同啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性Fig.5 Relative luciferase activity of recombinant plasmid ofmc1rgene in Chinese perch

圖6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Transcription factor binding sites

3 討論

3.1 鱖mc1r分子特征及系統(tǒng)發(fā)育

盡管已有100多個(gè)基因位點(diǎn)被確定與脊椎動(dòng)物色素沉著有關(guān),但黑皮質(zhì)素系統(tǒng)始終是色素表型的關(guān)鍵決定因素[19,20]。有大量的研究表明mc1r與動(dòng)物毛色、膚色等緊密相關(guān),其在參與色素合成及色素沉積方面發(fā)揮了重要作用。哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類的皮膚和毛發(fā)顏色變化緩慢,通常需要數(shù)周時(shí)間。然而,在不同的養(yǎng)殖環(huán)境中,魚(yú)類可以通過(guò)黑色素顆粒的快速運(yùn)動(dòng)迅速改變身體顏色[21]。在本研究中,通過(guò)對(duì)鱖mc1r序列分析可知mc1r基因開(kāi)閱讀框?yàn)?78 bp,編碼325個(gè)氨基酸,屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,在魚(yú)類及哺乳動(dòng)物序列中高度保守,有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,與其他報(bào)道物種相符[21,22]。mc1r在迄今為止分析的所有魚(yú)類和四足動(dòng)物物種中以單拷貝基因存在[12,24]。通過(guò)氨基酸序列同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),鱖mc1r在硬骨魚(yú)類和哺乳動(dòng)物間呈現(xiàn)不同的同源性及親緣關(guān)系。其中,鱖與歐洲鱸和大口黑鱸序列相似性最高,親緣關(guān)系更近,與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這與鱖隸屬于鱸形目相符合。

3.2 不同養(yǎng)殖背景下鱖體色及mc1r組織表達(dá)差異

本研究將鱖分別養(yǎng)殖在黑、白色背景魚(yú)缸中,與白色養(yǎng)殖背景中的淺色體表鱖相比較,在深色魚(yú)缸中鱖體色呈現(xiàn)黃綠色,頭部的細(xì)長(zhǎng)條紋、軀干部縱寬的條紋、斑塊及鰭上的斑點(diǎn)都更清晰可見(jiàn),與野生型鱖更為接近。鱖是生活在江河、湖泊、水庫(kù)中的底棲性魚(yú)類,通常白天棲息于水底或草叢茂密的地方,到晨昏或夜間才到臨岸的草叢中覓食,因此黃綠色體色及體表的斑塊或條紋更有利于隱藏自身來(lái)達(dá)到躲避敵害和順利捕食的目的[23,24]。因此,從生活習(xí)性角度考慮鱖可能更適合于養(yǎng)殖在黑色或深色背景中,這可能也有利于獲得健康優(yōu)質(zhì)鱖,促進(jìn)鱖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

本研究采用 RT-qPCR 方法檢測(cè)了鱖mc1r在不同養(yǎng)殖環(huán)境中的組織表達(dá)差異,結(jié)果顯示,在深色和淺色體表中鱖mc1r基因表達(dá)有很大差異。對(duì)于深色體表鱖,其背部皮膚表達(dá)量最高,其次是腹部皮膚、肝、眼、腦、腎,在心、鰓、肌肉和腸道表達(dá)量最低;對(duì)于淺色體表鱖,其在腦中表達(dá)量最高,其次是腹部皮膚和心,在背部皮膚、肌肉、鰓、腸道、腎、眼和肝中表達(dá)量最低,且腦中mc1r表達(dá)量與其他組織相比差異極顯著。這與mc1r基因參與色素沉積及與黑素皮質(zhì)激素(α-MSH和ACTH)結(jié)合在魚(yú)類黑素生成途徑中發(fā)揮重要作用相一致。通過(guò)對(duì)不同背景顏色培養(yǎng)的東星斑 (Plectropomus leopardus)背部皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,揭示mc1r表達(dá)量隨著背景顏色的加深而增加[25]。有研究表明,明亮的背景會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體的黑色素聚集,從而導(dǎo)致皮膚顏色變淺;而背景顏色加深會(huì)使得黑色素分散,從而使得整個(gè)皮膚顏色加深[26]。然而,在不同魚(yú)類中,mc1r基因有著不同的表達(dá)模式。斑馬魚(yú)在大腦、眼睛、皮膚和精巢中表達(dá),但在鰓、肝臟、肌肉和卵巢中不表達(dá)[25]。青鳉在所有組織中都有表達(dá),包括大腦、眼睛、肌肉和皮膚等[24]。在錦鯉(Cyprinus carpio)中,其在黑色皮膚和眼中有最高的表達(dá)量,在白色皮膚、腦和肌肉表達(dá)量稍低,鰓、腎和肝臟表達(dá)量最低[26]。一些研究表明,在長(zhǎng)期適應(yīng)亮或暗背景的過(guò)程中,魚(yú)也可以通過(guò)減少或增加黑色素細(xì)胞的數(shù)量和大小來(lái)改變其顏色[21,27]。研究顯示在硬骨魚(yú)類中,背側(cè)和腹側(cè)區(qū)域顏色之間的明顯分界通過(guò)色素細(xì)胞的圖案化分布實(shí)現(xiàn)[20]。

3.3 鱖核心啟動(dòng)子區(qū)域及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子分析

為了探究鱖mc1r啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性,根據(jù)在線軟件初步預(yù)測(cè)的核心啟動(dòng)子區(qū)域,構(gòu)建了5個(gè)5′端序列缺失報(bào)告基因載體,結(jié)果顯示不同缺失片段啟動(dòng)子活性之間存在顯著差異,且-159∽+292 bp啟動(dòng)子區(qū)域熒光活性最高,推測(cè)該區(qū)域?yàn)楹诵膯?dòng)子區(qū)域。通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)出核心啟動(dòng)子區(qū)域存在SP-1、MITF等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明,在黑色素瘤細(xì)胞中,人的mc1r啟動(dòng)子在-517∽-282 bp區(qū)域具有最高的熒光素酶活性,且該區(qū)域內(nèi)的SP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)刪除后其熒光活性顯著降低[28]。在小鼠中,MITF共轉(zhuǎn)染情況下,其mc1r啟動(dòng)子區(qū)域從-483 bp熒光活性顯著增加,表明MITF可以調(diào)控mc1r基因的表達(dá)[29]。MITF被認(rèn)為是黑色素細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子,因?yàn)樗{(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、存活和黑色素合成。同時(shí),MITF也被證明參與mc1r的轉(zhuǎn)錄[30,31],一致的,有研究表明MITF可以通過(guò)黑色素細(xì)胞特異性基因(mc1r)中的E-box結(jié)合位點(diǎn)直接激活轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控黑色素細(xì)胞的分化[35]。因此,SP-1和MITF可能通過(guò)與mc1r啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程,促進(jìn)黑色素細(xì)胞的分化與黑色素顆沉積,從而改變體色。

綜上所述,本研究中鱖mc1r基因在深淺色體表鱖組織表達(dá)存在顯著差異,深色體表鱖在背部皮膚和腹部皮膚高表達(dá),淺色體表鱖在腦中和腹部皮膚高表達(dá)。報(bào)告基因顯示-159∽+292 bp啟動(dòng)子區(qū)域熒光活性最高,推測(cè)該區(qū)域?yàn)楹诵膯?dòng)子區(qū)域。本研究首次克隆了鱖mc1r基因啟動(dòng)子區(qū)域并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄活性分析,并且對(duì)潛在的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測(cè),為魚(yú)類mc1r基因分子機(jī)制表達(dá)調(diào)控及表皮顏色可控性研究提供了理論依據(jù)。