胡婧萍綜述，劉存寶審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南 昆明 650500

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）屬皰疹病毒α亞科，具有獨特的4層結(jié)構(gòu)。HSV核心是長約152 000 bp 的線性雙鏈DNA，由二十面體衣殼包圍，衣殼外為被膜，內(nèi)包含二十多種能調(diào)節(jié)病毒復制周期的重要蛋白，是皰疹病毒的特征性結(jié)構(gòu)，可聯(lián)絡衣殼與囊膜形成完整的病毒粒子［1］。HSV 最外層為脂質(zhì)雙分子層包膜，膜上至少含12 種病毒膜蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、gN）［2-4］，對病毒進入宿主細胞及病毒免疫逃逸均至關重要。HSV 有2 種血清型：單純皰疹病毒-1 型（HSV-1）和HSV-2，它們在氨基酸序列上有83%的同源性［5］。HSV-1 感染可引起人體的口唇炎癥，感染嚴重時可誘發(fā)結(jié)膜炎導致失明，還可能入侵神經(jīng)細胞損傷神經(jīng)系統(tǒng)導致腦炎。HSV-2 為生殖器皰疹的主要病原，患者一旦感染將終生攜帶該病毒，并且出現(xiàn)周期性的生殖器皰疹性損傷。近年的流行病學研究表明，HSV-2 感染導致的生殖器損傷會提高HSV-2 攜帶者感染和傳播人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的風險［6-7］，即使是在不引起生殖器損傷的情況下發(fā)生病毒脫落也會顯著增加HIV的傳播機率［8］。

不同的皰疹病毒具有相似的病毒結(jié)構(gòu)，并能通過相似的膜融合機制進入宿主細胞。膜融合需要病毒表面4 種基本糖蛋白（gB、gD、gH 和gL）相互作用，這4種糖蛋白構(gòu)成的復合物被稱為核心融合機制［9-10］，它們通常位于病毒包膜表面并能通過級聯(lián)作用將激活信號從gD 傳遞至gB，引起gB 發(fā)生構(gòu)象變化，在宿主細胞膜上形成融合孔從而實現(xiàn)膜融合，使病毒能夠成功將核衣殼和DNA 釋放至宿主細胞中進行新一輪的復制［11］。

近年來對HSV 的研究不斷取得突破，本文重點綜述了HSV 包膜糖蛋白gB、gD、gH、gL 的結(jié)構(gòu)以及這4 種蛋白在膜融合中相互作用的方式。了解病毒結(jié)構(gòu)和膜融合機制有助于尋找合適的靶點開發(fā)藥物或疫苗，通過抑制HSV 進入宿主細胞來阻斷HSV 的潛伏感染。

1 HSV進入宿主細胞的機制

HSV 在融合蛋白的幫助下可感染包括神經(jīng)元、上皮細胞和成纖維細胞在內(nèi)的多種細胞。在目前的研究模型中，HSV 與宿主細胞上的受體特異性結(jié)合后可引起病毒表面糖蛋白的構(gòu)象變化，從而介導HSV進入細胞。作用機制通過2種類似的途徑實現(xiàn)：①通過病毒包膜與宿主細胞質(zhì)膜的直接融合進入細胞（見圖1），病毒采用該途徑進入成纖維細胞和淋巴細胞；②病毒觸發(fā)宿主細胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成內(nèi)體，通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)中，病毒采用該途徑進入神經(jīng)元細胞［12］。但具體以哪種途徑進入可能取決于宿主細胞表面受體的類型［13］，如gB 的配對免疫球蛋白樣受體α（paired immunoglobulin-like receptor alpha，PILRα），以及gH-gL的整合素受體αvβ3、αvβ6、αvβ8，可能與病毒非必需包膜蛋白（gC、gE、gG、gI、gJ、gK、gM、gN）的作用有關［14］，宿主細胞膜上的受體數(shù)量也可能會影響病毒的進入方式。

圖1 HSV包膜糖蛋白介導融合的基本步驟示意圖Fig.1 Schematic diagram of essential steps in HSV glycoprotein-mediated fusion

1.1 gD蛋白與宿主細胞特異性結(jié)合 游離狀態(tài)的病毒與宿主細胞特異性受體結(jié)合前，帶正電荷的包膜糖蛋白gC、gB會先結(jié)合宿主細胞表面帶負電荷的硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）［15-16］，這有助于在宿主細胞表面濃縮病毒顆粒［17］，但該過程不引發(fā)特異性的膜融合。缺失HSPG 受體會降低病毒的結(jié)合效率但不會終止感染，說明該過程對于病毒進入宿主細胞不是必須的［15，18-19］。緊接著，結(jié)合蛋白gD 發(fā)揮作用，識別并結(jié)合宿主細胞表面的特異性受體，該過程是啟動融合反應所必須的。HSV 包括3 類受體［11，20］：①HVEM，是第一個被鑒定的gD 受體，屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族，主要在免疫細胞、神經(jīng)元、上皮細胞、成纖維細胞上表達。②凝集素-1／凝集素-2（nectin-1／nectin-2），是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白家族。nectin-1 是一種細胞黏附蛋白，可作為大多數(shù)α 皰疹病毒的進入受體，在神經(jīng)元等多種組織中表達，并且在HSV-2 感染中比其他gD 受體發(fā)揮更大的作用［21-22］；nectin-2 能介導少數(shù)HSV-1 和HSV-2 毒株進入宿主細胞。③硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的3-O-磺化衍生物（3-O-sulfonated derivatives of heparan sulfate，3-OST-HS），是HS高度硫酸化形式，主要作為HSV-1的進入受體。

gD 是全長為369 個氨基酸的跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域的長度為316個氨基酸。從電鏡中觀察gD的晶體結(jié)構(gòu)可以看到，gD 胞外結(jié)構(gòu)域的核心為V 型的免疫球蛋白樣折疊，N-末端和C-末端的延伸圍繞在核心的兩側(cè)［23-24］（見圖2A）。N-末端含有受體結(jié)合區(qū)（receptor binding domain，RBD），能影響gD 與特定的宿主細胞受體結(jié)合，因此在HSV 感染中發(fā)揮重要作用。C-末端是柔性結(jié)構(gòu)，經(jīng)過折疊后緊靠gD 核心的V 型區(qū)域，C-末端的最后16 個氨基酸殘基大致平行于N-末端。

圖2 HSV-1 gD的胞外結(jié)構(gòu)域Fig.2 Ectodomain of HSV-1 gD

在gD 與其特異性受體結(jié)合前，N-末端一直處于紊亂狀態(tài)，gD呈現(xiàn)自我抑制的閉合構(gòu)象以防止gD與gH-gL 或gB 結(jié)合而過早激活膜融合反應［23，25］，該構(gòu)象的形成可能有以下幾個原因：①C-末端掩藏了gD的受體結(jié)合位點；②C-末端的最后16 個氨基酸與N-末端相互作用，同時C-末端上Trp294、Pro291等氨基酸側(cè)鏈能嵌入gD 表面的凹槽中；③N-末端的Gln27氨基酸側(cè)鏈可與His295 主鏈上的氮、氧原子形成氫鍵限制N-末端和C-末端的相對位置［23］。當HVEM或nectin-1 等特異性受體以開放形式結(jié)合gD 的同時C-末端發(fā)生移位，gD轉(zhuǎn)換為開放構(gòu)象，暴露出N-末端上的RBD［21］（見圖2B）。LAZEAR 等［26］的研究表明，HVEM 可結(jié)合至HSV-1gD 的N-末端，使N-末端從無序狀態(tài)折疊形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前16個殘基與gD閉合構(gòu)象中的C-末端占據(jù)相同的空間。

另外C-末端的PFD 富含脯氨基酸，可能是融合信號向下游傳遞的部位［27-28］。有實驗設計獲得一種將C-末端延伸鎖定在gD 核心的突變體，該突變體保留了與受體結(jié)合的能力，但未能觸發(fā)融合［29］。證明gD 的C-末端上可能存在與gH-gL 相互作用的位點，或者是C-末端的移動能暴露出gD上的gH-gL相互作用位點［30］。但由于gD 與gH-gL 之間的作用非常短暫，且親和力較低，因此尚未觀察到α皰疹病毒gD與gH-gL之間的復合物。

1.2 gH-gL 蛋白的信號傳遞作用 gH-gL 異二聚體是皰疹病毒融合機制中的重要組成部分，在融合過程中的作用較為復雜，且在所有皰疹病毒中均是保守的。目前主流的觀點認為，α 類皰疹病毒家族中g(shù)H-gL的結(jié)構(gòu)不同于任何已知的融合蛋白，該異二聚體可能發(fā)揮信號傳遞作用，將受體結(jié)合信號從gD 傳遞至gB，而不直接作為融合蛋白［31-33］。

糖蛋白gH 是由UL22基因編碼的Ⅰ型糖蛋白，長度為838 個氨基酸，具有較長的胞外結(jié)構(gòu)域、單通道跨膜片段和14 個氨基酸的胞質(zhì)尾區(qū)［34］。HSV-2的gH-gL 晶體結(jié)構(gòu)已被解析，其中g(shù)H 的胞外結(jié)構(gòu)域可分為H1、H2、H3、H4四部分［見圖3，該圖選自結(jié)構(gòu)生物信息學蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank，RCSB PDB），gH-gL的PDB編號為3M1C］，在這4個結(jié)構(gòu)域中，H1、H2結(jié)構(gòu)域最不保守，H3結(jié)構(gòu)域中度保守，H4結(jié)構(gòu)域最保守。高度多樣化的H1、H2結(jié)構(gòu)域可接收各種激活信號，經(jīng)過保守的H3、H4結(jié)構(gòu)域的加工處理后，將這些信息傳遞至gB［35］。gL 是由UL1基因編碼的含224 個氨基酸的糖蛋白，缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，不能獨立錨定在細胞膜上［36］，因此，gH 和gL 在HSV 感染的細胞和成熟的病毒體上總是以穩(wěn)定的1∶1 異源二聚體復合物存在。gH N-末端的H1和H2結(jié)構(gòu)域能夾住gL，同時H1結(jié)構(gòu)域能很好地填充至gL 分子頂部的V形凹槽中，且H1 結(jié)構(gòu)域與gL 相互作用的表面高度互補，說明該異二聚體需要彼此的存在才能正確折疊［37］。在HSV 缺乏gL 的情況下，宿主細胞內(nèi)合成的gH 可能會滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位，不會被整合至病毒包膜中；在缺乏gH時，一些gL能從細胞內(nèi)分泌出來，但不能單獨錨定在病毒包膜上，剩下的大量gL 仍以未成熟的形式存在細胞內(nèi)［38］。gH-gL 異二聚體在形態(tài)上表現(xiàn)為以H4結(jié)構(gòu)域為靴頭的獨特靴形結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與任何已知的病毒融合蛋白結(jié)構(gòu)均不相似，表明該異二聚體蛋白不具有直接的融合功能［36］，而是作為一種融合調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用［32］。

圖3 HSV-1 gH-gL的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure of HSV-1 gH-gL ectodomain

有研究發(fā)現(xiàn)，gH-gL的多個結(jié)構(gòu)域能與不同的中和抗體結(jié)合，如mAb LP11能結(jié)合至gH-gL的H3結(jié)構(gòu)域，而mAb 52S 結(jié)合至復合物另一面的H2 結(jié)構(gòu)域［36，39］。說明gH-gL必須與多種病毒膜蛋白結(jié)合，才能將融合信號從gD 傳遞至gB，且作用的位點不同。目前為止，α 皰疹病毒gD 與gH-gL 復合物的結(jié)構(gòu)尚未觀察到，但AVITABILE 等［40］通過雙分子熒光互補技術(shù)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）在活細胞中觀察到gD 與gH-gL 之間直接的相互作用，并且通過BiFC 標簽穩(wěn)定gD 與gH-gL 復合體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定gD與gH-gL復合體會抑制膜融合作用，說明gD與gH-gL之間的交互作用可能是短暫的。

gH-gL作為一個中間的信號傳遞分子，與其他病毒膜蛋白的結(jié)合是如何實現(xiàn)的一直是一個難題。CAIRNS 等［30］的研究使用不同mAb 結(jié)合至gH-gL 上，結(jié)果顯示gD 與gH-gL 的結(jié)合位點可能位于gH 的N-末端和gL 的C-末端，且gH 的N-末端可能會部分封閉gL的C-末端直至與gD 結(jié)合。ROGALIN 等［41］的研究證明，gH C-末端的胞質(zhì)尾區(qū)可能與gB的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用并調(diào)節(jié)和激活核心融合機制，gH 的胞質(zhì)尾區(qū)的插入或者截斷均會直接影響病毒融合活性。因此，gH可能作為一種楔形物，破壞gB的自我抑制，這可能是gH-gL 傳遞激活信號的一種方式，即通過物理作用直接與gD 及gB 結(jié)合。另外gH-gL 與其高親和力受體整合素αvβ6、αvβ8 的結(jié)合有利于HSV 進入宿主細胞［42］，GIANNI 等［43］、LEONI 等［44］的研究發(fā)現(xiàn)，gH-gL 可通過與αvβ3 或Toll 樣受體2 結(jié)合，激活NF-κB 和先天性免疫應答；GIANNI 等［45］研究還發(fā)現(xiàn)，αvβ3、αvβ6、αvβ8 的信號能改變HSV 進入宿主細胞的模式，但這些通路與gH-gL 及其他膜蛋白之間信號傳遞的分子機制是否有關尚不清楚。

另外，PATAKI等［46］利用靈敏度更高的活細胞實時蛋白相互作用檢測技術(shù)NanoBiT?，提出了gD、gHgL、gB 之間結(jié)合的新模型，即活細胞中g(shù)D、gH-gL、gB在gD 與受體結(jié)合前先形成復合物，復合物的形成獨立于融合之前，并且在整個融合過程中保持不變。這與先前認為gD 與特異性受體結(jié)合后再依次結(jié)合gH-gL、gB 的途徑有所不同，具體以哪種方式發(fā)揮作用目前尚不清楚。

1.3 gB蛋白介導膜融合作用 gB是一種Ⅲ類膜融合蛋白，是皰疹病毒中最保守的膜融合糖蛋白。gB 最初以融合前構(gòu)象錨定在病毒包膜上［47］，在收到上游傳遞的激活信號后，gB 發(fā)生構(gòu)象變化重新折疊成融合后構(gòu)象（見圖4），融合后構(gòu)象能將自身疏水性的殘基插入宿主細胞膜中促進融合孔的形成［48］，從而驅(qū)動病毒包膜和宿主細胞膜融合。有研究認為，該融合過程所需的能量來自于融合前的高能量構(gòu)象重新折疊成融合后的低能量構(gòu)象這一過程所釋放的［49］。

圖4 gB蛋白融合前和融合后的構(gòu)象示意圖Fig.4 Conformational diagrams of gB protein pre- and postfusion

融合后構(gòu)象的X 射線晶體學結(jié)構(gòu)表明，gB 胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)類似三聚體尖峰或者棒狀結(jié)構(gòu)，每個亞基由5 個排列成發(fā)夾形狀的不同結(jié)構(gòu)域組成［50］。這些結(jié)構(gòu)域與其他亞基上的等效對應的結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)［4］。其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ包含2 個融合環(huán)，靠近跨膜段，稱為融合域（fusion domain）［51］；結(jié)構(gòu)域Ⅱ上含有與gH-gL相互作用位點，因此稱其為gH-gL 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（gH-gL binding domain）；結(jié)構(gòu)域Ⅲ由α-螺旋組成，形成了gB 的特征性三聚體螺旋中心；結(jié)構(gòu)域Ⅳ位于gB 融合后形式的頂部，這個部位也稱為冠結(jié)構(gòu)域（crown domain），能在宿主細胞上形成疏水的孔道介導gB與宿主細胞的融合［24］；結(jié)構(gòu)域Ⅴ由一段長的延伸部分組成，能填充至其他2個原聚體間的凹槽中，將原聚體連接在一起［24，51］（見圖5，該圖選自RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫，gB 蛋白的PDB 編號為5V2S）。其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅰ的上部區(qū)域包含2個串聯(lián)排列的pleckstrin 同源性結(jié)構(gòu)域（pleckstrin homology，PH），其可能具有結(jié)合脂質(zhì)的功能［9，52］。

圖5 HSV-1 gB的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of HSV-1 gB

在gB 中，除了胞外結(jié)構(gòu)域外，還包含3個重要的區(qū)域：MPR、TMD和CTD，MPR-TMD-CTD 在胞外結(jié)構(gòu)域的下方形成了一個獨特折疊的疏水性三聚體基座，這些結(jié)構(gòu)域約占gB 單體多肽的20%，很大程度上影響了胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能，并且可與膜發(fā)生相互作用（見圖5）。其中CTD 結(jié)構(gòu)對gB 的折疊和表達至關重要，CTD 的突變可能會影響整個融合過程［53］。COOPER 等［54］研究發(fā)現(xiàn)，CTD 能穩(wěn)定gB 融合前構(gòu)象并抑制gB 的融合活性，提出了HSV 融合的鉗楔模型。CTD 作為鉗夾以某種高能量的形式將gB的胞外結(jié)構(gòu)域限制在其高能預融合形式，當gD 與其特異性受體結(jié)合后激活gH-gL 二聚體，激活的gH-gL胞外結(jié)構(gòu)域與gB的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用，gH的胞質(zhì)尾區(qū)充當楔形物破壞CTD 核心或破壞其與膜的相互作用，不穩(wěn)定的鉗夾就失去了對胞外結(jié)構(gòu)域的控制［34］。解除抑制的gB 胞外結(jié)構(gòu)域繼續(xù)重新折疊成熱力學上有利的融合后構(gòu)象，而CTD 則恢復至其初始構(gòu)象，在這個變化過程中，該三聚體不需完全分離。病毒和細胞的融合水平與gH的胞質(zhì)尾區(qū)的長度有關，gH 胞質(zhì)尾區(qū)的截短會導致細胞融合水平降低［55］。另外，為了影響胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，CTD 必須通過介入MPR和TMD傳達其自身的狀態(tài)，因此TMD螺旋延伸進入CTD 空間，可能作為一個中間體將CTD 的運動信息有效傳輸至TMD［48］。但信息從CTD 傳輸至MPR這一過程的具體機制尚不清楚。

除了通過gH-gL 的激活外，gB 還需與特定受體結(jié)合才能實現(xiàn)HSV的融合。PILRα主要介導HSV-1進入宿主細胞，該受體主要在免疫細胞中表達，如單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞等，是第1 個被鑒定的gB受體。在中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）試驗中發(fā)現(xiàn)，gB與PILRα的結(jié)合能將HSV-1的進入途徑從內(nèi)吞轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯尤诤希?3］。另外，gB 的受體還包括位于神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面的髓鞘相關糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）［56］以及主要在細胞質(zhì)中表達的非肌肉肌球蛋白重鏈-ⅡA（nonmuscle myosin heavy chain-ⅡA，NMHC-ⅡA）［57］。

2 總結(jié)與展望

科學技術(shù)的進步使HSV 的感染機制逐漸清晰，冷凍電子顯微鏡成像技術(shù)的應用展示了gB 蛋白的融合前構(gòu)象，實時蛋白相互作用檢測技術(shù)NanoBiT?有望揭示gD、gH-gL和gB蛋白激活的先后順序，未來的結(jié)構(gòu)蛋白和晶體學研究將繼續(xù)探索病毒糖蛋白間的相互作用位點和構(gòu)象變化。除了通過復雜的作用機制進入宿主細胞，HSV 還具有高超的逃避免疫和藥物治療的能力，因此HSV 在很長一段時間內(nèi)仍可能是人類所面對的棘手病原體之一。但對HSV進入宿主細胞的一些結(jié)構(gòu)細節(jié)的解析，將有助于設計更好、更有效的疫苗。如對gB融合前結(jié)構(gòu)的解析有助于設計能將gB 鎖定在其融合前結(jié)構(gòu)的亞單位疫苗［47］，避免gB 蛋白在宿主細胞膜上形成融合孔從而阻斷膜融合。另外，由于所有皰疹病毒均需gH-gL和gB 3種蛋白，HSV 疫苗的成功研發(fā)不僅對預防HSV 感染有重要意義，還可能為其他皰疹病毒疫苗的開發(fā)提供思路。