金麗婷，黃岳，張素勤，肖文俊，朱克駿，張健，江秋虹

安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司研發(fā)中心，安徽 合肥 230088

高效液相色譜法是目前應(yīng)用較為廣泛的一種分離分析技術(shù)，是根據(jù)混合物各組分在互不相溶的兩相中因吸附能力、分配系數(shù)等性能差異將待測的各組分分離；同時還具有分離效能高、靈敏度高、分析快、應(yīng)用范圍廣等特點［1-2］。高效液相色譜法因保留時間與組分的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，常被用于藥物鑒別［3-5］，此外，該方法對于特定物質(zhì)檢測具有迅速、準(zhǔn)確的特點，可控制產(chǎn)品質(zhì)量［6-7］。

重組結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的主要分泌蛋白抗原85b（Ag85b）是卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）、Mtb 及其他分枝桿菌最主要的分泌蛋白，也是BCG 在體內(nèi)外發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分［8］。Ag85b 蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答［9-10］，因此被廣泛用于結(jié)核疫苗開發(fā)。重組MTB Ag85b 蛋白是將構(gòu)建的基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)、純化后獲得，因此，重組蛋白類疫苗在規(guī)模化生產(chǎn)過程中可能會引入影響其純度的物質(zhì)，對疫苗活性及安全性產(chǎn)生影響，有必要在生產(chǎn)或研究過程中嚴(yán)格控制蛋白純度［11-12］。本研究旨在建立重組MTB Ag85b 蛋白純度檢測的反相高效液相色潽法，并進(jìn)行驗證，以達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的［13］。

1 材料與方法

1.1 供試品 重組MTB Ag85b 蛋白原液由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備，批號：M20190102，蛋白含量：500μg／mL。

1.2 主要試劑及儀器 乙腈、甲醇、氯化鉀購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀購自湖南九典宏陽制藥有限公司；氯化鈉購自江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀購自美國Waters 公司；Sepax PolyRP-1000 色譜柱（2.1 mm×100 mm，5μm）購自蘇州賽分科技股份有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 流動相 A液（99.9%水，0.1%TFA）［14］：取TFA 0.5 mL，加純化水至500 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，備用；B液（99.9%乙腈，0.1%TFA）：取TFA 0.5 mL，加乙腈至500 mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。

1.3.2 1 × PBS 緩沖液 取磷酸氫二鈉1.44 g、磷酸二氫鉀0.24 g、氯化鈉8.00 g、氯化鉀0.22 g，加入純化水溶解后，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.4，過濾備用。

1.3.3 測試溶液 取重組MTB Ag85b蛋白原液120μL，加入80 μL 1 × PBS 緩沖液，配制成300 μg／mL 待測溶液。

1.4 檢測條件的選擇 選取有機(jī)相洗脫梯度比例（A）、檢測溫度（B）、進(jìn)樣量（C）、95%有機(jī)相洗脫時間（D）4個因素對初步色譜條件［色譜柱：Sepax PolyRP-1000（2.1 mm×100 mm，5μm）；流動相：A液→B液；重復(fù)進(jìn)樣：3次；上樣量：10μL；檢測波長：280 nm］進(jìn)行優(yōu)化，并設(shè)計4因素3水平正交試驗，見表1和表2。將面積（%）、拖尾因子、峰面積、峰面積RSD（%）作為評價指標(biāo)對正交試驗結(jié)果進(jìn)行分析，摸索最適檢測條件。

表1 色譜條件的因素和水平選擇Tab.1 Selection of factors and levels of chromatographic conditions

表2 正交試驗設(shè)計表Tab.2 Orthogonal test design table

1.5 方法驗證

按照《中國藥典》四部（2020 版）9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求進(jìn)行驗證［15-19］。

1.5.1 專屬性 取測試溶液、1×PBS緩沖液，按照優(yōu)化后的色譜條件上樣。

1.5.2 線性范圍 取Ag85b蛋白原液，用1×PBS緩沖液溶解配制成不同濃度（180、240、300、360、420μg／mL）后，按照優(yōu)化后的色譜條件上樣。以樣品濃度為橫坐標(biāo)（X）、主峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制線性圖，進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.5.3 精密度

1.5.3.1 重復(fù)性 取測試溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件上樣，重復(fù)進(jìn)樣6次。計算Ag85b蛋白原液保留時間及純度的RSD。

1.5.3.2 中間精密度 取測試溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件上樣。由1名實驗員在3個不同日期以及3名實驗人員在同一日期進(jìn)行檢測。計算Ag85b 蛋白原液主峰保留時間及純度RSD。

1.5.4 耐用性

1.5.4.1 流速變化范圍考察 取測試溶液，單獨改變試驗條件中的流速（0.20 ～0.22 mL／min），上樣考察流速變化對檢測結(jié)果的影響。

1.5.4.2 柱溫變化范圍考察 取測試溶液，單獨改變試驗條件中的柱溫（30 ～40 ℃），上樣考察柱溫變化對檢測結(jié)果的影響。

1.6 數(shù)據(jù)采集及分析 使用Waters Empower 3 軟件對色譜結(jié)果進(jìn)行采集及處理；使用Minitab 21.3.1.0軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗結(jié)果 4因素3水平9組正交試驗結(jié)果見表3，以面積、拖尾因子、峰面積、峰面積RSD為指標(biāo)，通過軟件進(jìn)行分析，以影響4 個評價指標(biāo)的第1影響條件為最佳檢測條件，由表4 可知，檢測溫度35 ℃、進(jìn)樣量3 或5 μg、95%有機(jī)相洗脫時間5 或15 min 為最佳檢測條件。從柱壓穩(wěn)定的角度考慮，由于初步色譜條件選擇的平衡條件為70%A液、30%B 液，因此選取的有機(jī)相洗脫比例為30% ～95%；進(jìn)樣量最終選擇3μg，95%有機(jī)相洗脫時間為15 min，即最終確定的色譜條件為：色譜柱Sepax PolyRP-1000（2.1 mm×100 mm，5μm）；流動相：A液→B液；平衡條件：70%A、30%B平衡60 min；流速：0.21 mL／min；樣品濃度：300 μg／mL；進(jìn)樣量：3 μg，重復(fù)進(jìn)樣3次；檢測溫度：35 ℃；檢測波長：280 nm。洗脫流程見表5。

表3 Ag85b蛋白檢測結(jié)果Tab.3 Detection results of Ag85b protein

表4 軟件分析結(jié)果Tab.4 Software analysis results

表5 反向高效液相色譜法檢測Ag85b 蛋白原液的梯度洗脫流程Tab.5 Detection of gradient elution process of Ag85b protein stock solution by reversed phase high-performance liquid chromatography

2.2 方法驗證結(jié)果

2.2.1 專屬性 供試品溶液在約20 min 時有最大吸收峰，1 × PBS 緩沖液對供試品溶液出峰無干擾，表明溶劑不影響Ag85b 蛋白的檢測，方法專屬性良好，見圖1。

圖1 專屬性驗證色譜圖Fig.1 Chromatogram of specificity verification

2.2.2 線性范圍 得到的回歸方程為：y=4 300.5x+29 739，Ag85b 蛋白在180 ～420μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.998 5，見圖2和表6。

圖2 Ag85b蛋白線性回歸曲線Fig.2 Ag85b protein linear regression curve

表6 線性范圍驗證結(jié)果Tab.6 Linear range verification results

2.2.3 精密度

2.2.3.1 重復(fù)性 Ag85b 蛋白6 次上樣保留時間的RSD為0.01%，純度均為100%，表明該方法重復(fù)性良好，見圖3和表7。

圖3 重復(fù)性驗證色譜圖Fig.3 Chromatogram of reproducibility verification

表7 Ag85b蛋白重復(fù)性驗證結(jié)果Tab.7 Ag85b protein reproducibility verification results

2.2.3.2 中間精密度 不同實驗員同一時間測定的純度及主峰保留時間RSD分別為0 和0.08%，同一實驗員不同時間測定的純度及主峰保留時間RSD分別為0、0.21%，表明該方法中間精密度良好，見表8。

表8 Ag85b蛋白中間精密度驗證結(jié)果Tab.8 Intermediate precision verification results of Ag85b protein

2.2.4 耐用性 流速為0.20、0.21、0.22 mL／min，柱溫為30、35、40 ℃時，對Ag85b蛋白的檢測無影響，表明該方法耐用性良好，見表9。

表9 耐用性驗證結(jié)果Tab.9 Durability verification results

3 討論

方法驗證是制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，只有經(jīng)過驗證的分析方法才能達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的［20-21］。本研究建立了檢測重組Mtb Ag85b 蛋白原液純度的反向高效液相色譜法，為證明該方法能夠準(zhǔn)確檢測Ag85b 蛋白原液純度，同時達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的，分別進(jìn)行了專屬性、線性范圍、重復(fù)性、中間精密度和耐用性驗證，各項驗證結(jié)果均符合《中國藥典》四部（2020 版）9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則相關(guān)要求［15］，但本研究未能探討流動相pH 值對樣品純度的影響，同時也未優(yōu)化該方法的檢測時間，后續(xù)將從以上兩方面進(jìn)行深入研究。

疫苗生產(chǎn)采用生物活性原材料，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長且對生產(chǎn)環(huán)境要求高，在儲存運輸過程中的溫濕度變化也會對產(chǎn)品造成不良影響，需要疫苗生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中進(jìn)行嚴(yán)格的控制和質(zhì)量管理。本研究采用反向高效液相色譜法對蛋白原液進(jìn)行檢測能夠及時反映生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的問題，色譜圖可直觀分析樣品純化效果［22-23］，而圖譜積分分析結(jié)果及保留時間能夠制定樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量［24］。

綜上所述，本研究建立的重組Mtb Ag85b蛋白原液純度的反向高效液相色譜法操作簡便，準(zhǔn)確度、精密度高，專屬性強(qiáng)，干擾小［25-26］，適用于重組Mtb Ag85b蛋白原液生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制，對疫苗生產(chǎn)具有重要意義。