張宗欣，趙紀(jì)元，孫紅賓

鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002

根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的2020 年全球結(jié)核病報告，2019 年全球新診斷并報告的結(jié)核病患者約710萬，每年至少有100萬兒童患結(jié)核病，其中約20萬死亡病例，結(jié)核病仍是威脅全球人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一［1-2］。目前，感染多重耐藥結(jié)核桿菌人數(shù)的持續(xù)增加及結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuber-culosis，Mtb）在人體內(nèi)休眠期的延長均給結(jié)核病的治療帶來極大挑戰(zhàn)［3-4］。尋找新靶點以開發(fā)新的抗結(jié)核藥物成為急需解決的問題。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類廣泛存在于原核和真核生物中的熱應(yīng)激蛋白，根據(jù)其同源程度和相對分子質(zhì)量，可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 及小分子熱休克蛋白（small HSPs，sHSPs）［5-6］。Mtb中的sHSPs高度保守，且可顯著增強機(jī)體抗Mtb感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力［7］。Mtb 在不同應(yīng)激狀態(tài)下可高表達(dá)兩類sHSPs：一類為hspX基因編碼的Acr1蛋白（又稱Hsp16.3、16 ku抗原或HspX），另一類為acr2基因編碼的Acr2 蛋白［8］，這兩類蛋白具有相似的sHSPs 特征，均含有保守的α-晶體結(jié)構(gòu)域（α-crystalline domain，ACD），該結(jié)構(gòu)域可形成大的寡聚復(fù)合物，且在體外具有不依賴ATP的伴侶功能［9-10］。據(jù)報道，ACD 與Mtb 長期潛伏在人體內(nèi)導(dǎo)致的持續(xù)感染有關(guān)［11］。在缺氧或存在一氧化氮的條件下，可誘導(dǎo)Mtb 表達(dá)Hsp16.3 蛋白［12-13］；在熱休克、氧化應(yīng)激和巨噬細(xì)胞攝取條件下，可誘導(dǎo)Mtb 表達(dá)Acr2 蛋白，且在體外具有分子伴侶活性［14-16］。Acr2 蛋白表達(dá)調(diào)控在Mtb 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其上調(diào)可顯著提高機(jī)體抗Mtb 感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，降低Mtb 在感染期間的存活率［7］。大多數(shù)蛋白在高溫下變性并發(fā)生熱聚集，如作為測定sHSPs分子伴侶功能的底物，包括檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）、胰島素和蘋果酸激酶（malate dehydrogenase，MDH）等［17］。本研究通過E.coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Acr2，經(jīng)Ni-NTA 層析及SuperdexTM200 10／300 GL 凝膠過濾層析后，采用底物結(jié)合試驗檢測其在體外的分子伴侶活性，以期為制備具有天然活性的結(jié)核桿菌蛋白抗原提供新策略。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 重組質(zhì)粒pET-28a-Acr2由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院蛋白純化實驗室構(gòu)建（經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定，證明構(gòu)建正確）；感受態(tài)E.coliBL21（DE3）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 MDH購自美國Sigma公司；IPTG、硫酸卡那霉素（Kan）、DTT、Ni-NTA 樹脂及其他化學(xué)試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；天然Acr2蛋白由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院蛋白純化實驗室制備；凝血酶購自北京索萊寶科技有限公司；SuperdexTM200 10／300 GL 凝膠過濾層析柱購自美國GE Healthcare 公司；圓二色譜儀購自英國Chirascan公司。

1.3 Acr2 的表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pET-28a-Acr2轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3），當(dāng)A600達(dá)0.6 時，加入IPTG 至終濃度為1 mmo／L，37 ℃誘導(dǎo)4 h；于4 ℃，2 920×g離心15 min，收集重組菌，用裂解緩沖液A（25 mmo／L Tris-HCl，500 mmo／L NaCl，1%甘油，10 mmo／L 咪唑，1 mmo／L PMSF，pH 8.0）重懸，經(jīng)高壓破菌儀裂解細(xì)胞后，4 ℃，7 592×g離心30 min；取上清，經(jīng)Ni-NTA 層析柱純化，依次采用含30、80、150、250、350、500 mmol／L 咪唑的緩沖液A 進(jìn)行梯度洗脫。收集含有目標(biāo)蛋白洗脫液，置緩沖液B（50 mmo／L 磷酸緩沖液，100 mmo／L NaCl，pH 7.0）中，于4 ℃濃縮透析過夜至2.5 mL；用凝血酶切除His標(biāo)簽，經(jīng)緩沖液B預(yù)平衡的SuperdexTM200 10／300 GL凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化，純化樣品經(jīng)超濾離心管超濾濃縮至500μL，紫外吸收光譜法檢測蛋白濃度。取各步驟樣品，經(jīng)還原型16.5%SDS-PAGE分析。

1.4 變性對Acr2蛋白二級結(jié)構(gòu)影響的檢測

1.4.1 Acr2 的變性及復(fù)性 將純化Acr2 蛋白樣品按1∶1 的體積分?jǐn)?shù)溶于緩沖液B，100 ℃溫浴15 min（熱變性），立即置于冰上冷卻5 min。另將純化Acr2蛋白按1∶1 的體積分?jǐn)?shù)溶于8 mol／L 尿素中，37 ℃溫浴4 h（化學(xué)變性）；置200 倍體積緩沖液B 中透析12 h，去除變性劑。

1.4.2 圓二色性光譜法 將Acr2 蛋白熱變性、化學(xué)變性及其復(fù)性樣品分別用緩沖液B 稀釋至濃度為0.5 mg／mL，采用圓二色譜儀于200～260 nm 光譜范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，間隔時間為0.1 min，掃描速率為100 nm／min。

1.4.3 非還原型SDS-PAGE 分析 將Acr2 蛋白兩種變性后的復(fù)性樣品，以Tris-甘氨酸為緩沖系統(tǒng)，于4 ℃進(jìn)行非還原型6%SDS-PAGE分析。

1.5 Acr2 蛋白體外分子伴侶活性檢測 采用底物結(jié)合試驗。將MDH（13.4 μmol／L）分別與天然Acr2蛋白和兩種變性后復(fù)性的Acr2蛋白（50μmol／L）混合，置25和48 ℃溫控水浴中孵育2 h；于4 ℃，7 008×g離心5 min，取上清，對其進(jìn)行分子排阻色譜分析（size exclusion chromatography，SEC），即上樣至預(yù)填充柱SuperdexTM200 10／300 GL，流動相為50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（含100 mmol／L NaCl，pH 7.0），流速為0.5 mL／min，溫度為4 ℃。收集各峰樣品，進(jìn)行還原型16.5%SDS-PAGE分析。

1.6 數(shù)據(jù)采集及分析 應(yīng)用UNICRONTM7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析，Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 Acr2 蛋白純化產(chǎn)物的鑒定 80、150、250、350、500 mmol／L咪唑緩沖液洗脫樣品中的His-Acr2蛋白相對分子質(zhì)量約23 000，大小與預(yù)期相符，且純度較高，見圖1。His-Acr2 蛋白經(jīng)SuperdexTM200 10／300 GL 凝膠過濾層析柱純化后，于7 mL體積處被洗脫出來，相對分子質(zhì)量約為232 000，與理論值相差較大，表明Acr2在溶液中以多聚體形式存在，見圖2。目的峰蛋白純度達(dá)90%以上，濃度約為2 mg／mL，見圖3。

圖1 Ni-NTA 層析柱純化His-Acr2 蛋白的還原型SDSPAGE分析Fig. 1 Reduced SDS-PAGE analysis of His-Acr2 protein purified by Ni-NTA chromatographic column

圖2 Acr2蛋白凝膠過濾層析純化圖譜Fig.2 Profile of Acr2 protein purified by gel filtration chromatography

圖3 凝膠過濾層析純化Acr2 蛋白的還原型SDS-PAGE分析Fig. 3 Reduced SDS-PAGE analysis of Acr2 protein purified by gel filtration chromatography

2.2 變性對Acr2二級結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 圓二色性光譜法 熱變性及化學(xué)變性的Acr2的圓二色性光譜顯示，其不再是以β 折疊為核心的特征光譜，表明兩種變性條件可導(dǎo)致Acr2 蛋白天然的二級結(jié)構(gòu)喪失，兩種復(fù)性蛋白的圓二色性光譜與天然Acr2 蛋白一致，表明變性后復(fù)性的Acr2 蛋白可恢復(fù)其原來的二級結(jié)構(gòu)。見圖4。

圖4 Acr2蛋白的圓二色性光譜分析Fig.4 Circular dichroism spectroscopy analysis of Acr2 protein

2.2.2 非變性SDS-PAGE 分析 兩種復(fù)性Acr2 蛋白經(jīng)非還原型6%SDS-PAGE 分析，可見目的蛋白與天然Acr2 蛋白大小一致，見圖5。表明Acr2 的二級結(jié)構(gòu)在變性條件下發(fā)生的變化是完全可逆的。

圖5 Acr2蛋白的非還原型SDS-PAGE分析Fig.5 Non-reduced SDS-PAGE analysis of Acr2 protein

2.3 Acr2蛋白的體外分子伴侶活性

2.3.1 天然Acr2 蛋白 將天然Acr2 蛋白與MDH 48 ℃混合，經(jīng)SEC 色譜分析，于體積8.5 mL 處可見1個清晰的峰（峰1），該峰由MDH 和天然Acr2 蛋白組成，峰2 和峰3 由天然Acr2 蛋白組成，峰4 由MDH組成；經(jīng)25 ℃混合后，于體積14.5 mL處可見1個清晰的峰（峰4），該峰由MDH 組成，峰1、峰2 和峰3 由天然Acr2 蛋白組成。經(jīng)還原型16. 5% SDS-PAGE 分析，可見4 個洗脫峰對應(yīng)的條帶大小與理論值均相符。見圖6 和圖7。表明天然的Acr2 蛋白可與MDH 在高溫條件下形成復(fù)合物，防止MDH形成熱聚集。

圖7 天然Acr2蛋白與MDH混合物（25 ℃）的鑒定Fig. 7 Identification of mixture of natural Acr2 protein and MDH（25 ℃）

2.3.2 復(fù)性Acr2 蛋白 將兩種復(fù)性Acr2 蛋白與MDH 48 ℃混合，經(jīng)SEC 色譜分析，于體積8.5 mL 處可見1個清晰的峰（峰1），該峰由MDH和兩種復(fù)性Acr2蛋白組成，峰2 和峰3 由兩種復(fù)性Acr2 蛋白組成，峰4由MDH 組成；經(jīng)25 ℃混合后，于體積14.5 mL處可見1 個清晰的峰（峰4），該峰由MDH 組成，峰1、峰2和峰3 為兩種復(fù)性Acr2 蛋白組成。經(jīng)還原型16.5%SDS-PAGE 分析，可見4 個洗脫峰對應(yīng)條帶的大小與理論值相符。見圖8～11。表明變復(fù)性后的Acr2 蛋白具有體外分子伴侶活性。

圖8 熱變性-復(fù)性Acr2蛋白與MDH混合物（48 ℃）的鑒定Fig.8 Identification of mixture of Acr2 protein and MDH after thermal denaturation-renaturation（48 ℃）

圖9 熱變性-復(fù)性Acr2蛋白與MDH混合物（25 ℃）的鑒定Fig.9 Identification of mixture of Acr2 protein and MDH after thermal denaturation-renaturation（25 ℃）

圖10 化學(xué)變性-復(fù)性Acr2蛋白與MDH混合物（48 ℃）的鑒定Fig. 10 Identification of mixture of Acr2 protein and MDH after chemical denaturation-renaturation（48 ℃）

3 討論

Mtb是引發(fā)結(jié)核病的病原體，可潛伏在肺部巨噬細(xì)胞達(dá)數(shù)十年，且在該狀態(tài)下，Mtb 的復(fù)制與機(jī)體的免疫系統(tǒng)應(yīng)答處于動態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)核病較難根治［18］。Mtb 感染早期采取的一種免疫逃逸策略是為了延緩?fù)淌审w的成熟及免疫識別。研究發(fā)現(xiàn)，Acr2 的早期表達(dá)不僅可保護(hù)處于潛伏狀態(tài)的Mtb 免受體內(nèi)環(huán)境的攻擊，還可使Mtb 暴露于免疫應(yīng)答之中。因此Acr2 可能成為新型抗結(jié)核病藥物的理想靶點［19］。

本研究在E.coli中成功表達(dá)了重組蛋白Acr2，經(jīng)純化獲得了較高純度的蛋白。通過洗脫峰色譜圖發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量與理論值差異較大，推斷Acr2蛋白具有多聚性，形成相對分子質(zhì)量較大的多聚體。由于SDS-PAGE 具有解聚性，使Acr2 蛋白在電泳圖中的相對分子質(zhì)量與其單體大小相符。熱變性和化學(xué)變性是使蛋白變性的最常用方法。二級結(jié)構(gòu)大多以β-折疊為核心是sHSPs 家族成員的典型特征之一，Acr2蛋白分別經(jīng)高溫加熱和高濃度尿素兩種途徑變性，復(fù)性過程在無其他輔助蛋白參與下，通過自發(fā)再折疊和再組裝，可恢復(fù)至其二級結(jié)構(gòu)的天然構(gòu)象，這對維持Acr2蛋白的生物學(xué)活性和功能十分重要。本研究結(jié)果表明，由于Acr2 蛋白自身所具有的聚合特性，經(jīng)變性-復(fù)性后的Acr2蛋白可在48 ℃熱激條件下與變性的MDH 形成穩(wěn)定的復(fù)合物。根據(jù)Acr2 蛋白的多聚性使Acr2 蛋白及其與MDH 形成的復(fù)合物出峰位置與單體蛋白的出峰位置差異較大，SDS-PAGE的解聚性使電泳圖中Acr2蛋白及其復(fù)合物的蛋白條帶均顯示以單體形式存在。表明經(jīng)變性-復(fù)性后的Acr2蛋白在體外也能與底物結(jié)合發(fā)揮其分子伴侶活性。本研究制備的Mtb 分子伴侶Acr2 蛋白有望作為有效診斷Mtb 潛伏感染的靶標(biāo)蛋白，對治療人類Mtb 潛伏期感染藥物的研發(fā)具有重要意義。