唐琪，劉宏博，張哲罡，張家友，曹慧，楊曉明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430207；2.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430207；3.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量保證部，北京 100029；4.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）最早被認(rèn)為是一類調(diào)控微小RNA（micro RNA，miRNA），稱為“miRNA海綿”的非編碼RNA［1-3］，目前僅部分內(nèi)源性circRNA被證明可作為蛋白質(zhì)翻譯模板［4］。隨著circRNA 的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）與開(kāi)放閱讀框（open read frame，ORF）的發(fā)現(xiàn)［5］，circRNA的編碼表達(dá)潛力逐漸引起關(guān)注［6-7］。不同于線性構(gòu)象的mRNA，circRNA 是單鏈共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)［8］，無(wú)5'帽結(jié)構(gòu)和3'聚腺苷酸化（polyA）尾巴，高度穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解［9］。相比于mRNA體外制備過(guò)程，circRNA的體外合成省去了加帽、加尾工序，制備成本更低［10］。另有報(bào)道稱，RNA環(huán)化可降低自身免疫原性，延長(zhǎng)體內(nèi)表達(dá)時(shí)間，進(jìn)一步減少RNA修飾等加工步驟［11］，有望成為繼mRNA 疫苗下一代的新型核酸疫苗［12］。此外，circRNA在腫瘤治療領(lǐng)域也展現(xiàn)出極大潛力［13-14］。

在WESSELHOEFT 等［6］的研究中，根據(jù)真核生物內(nèi)含子外顯子置換（permuted intron exon，PIE）策略，利用Ⅰ型催化內(nèi)含子（groupⅠcatalytic intron）自剪接核酶的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)了RNA 體外環(huán)化（in vitrocyclization，IVC）所需的環(huán)化臂，選取柯薩奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）株的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）作為circRNA 翻譯起始元件，表達(dá)了高西亞熒光素酶（Gaussia luciferase，GLuc）。同樣，QU 等［15］在狂犬病疫苗的研究中，也采用該形式環(huán)化的circRNA 獲得極佳的抗原表達(dá)及免疫效果?？紤]到目的蛋白大小和類型對(duì)circRNA 表達(dá)的影響，本研究依次選取714 bp的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、1 653 bp的螢火蟲(chóng)熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）及1 602 bp 的流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）IVR-180 基因序列構(gòu)建模板質(zhì)粒并IVC RNA，轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞觀察表達(dá)情況，探討circRNA 在示蹤表達(dá)及流感疫苗應(yīng)用上的可能性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HEK-293T 細(xì)胞由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：R70-18M）、螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：RG006）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司；核糖核酸酶R（RibonucleaseR，RNase R）（貨號(hào)：R0301S）購(gòu)自吉賽生物有限責(zé)任公司；LiCl（貨號(hào)：AM9480）、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑lip3000（貨號(hào)：L3000-015）、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；綿羊來(lái)源的HA IVR-180多抗（編號(hào)：17／106）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的驢抗綿羊抗體購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司。

1.3 模板線性化及體外轉(zhuǎn)錄（in vitrotranscription，IVT） 環(huán)化模板序列主要由Ⅰ型催化內(nèi)含子環(huán)化臂、CVB3-IRES 翻譯起始元件及目的基因構(gòu)成，分別包含目的基因EGFP、Fluc、HA（IVR-180）的環(huán)化模板擴(kuò)增質(zhì)粒pB-circRNA-EGFP、pB-circRNA-Fluc、pBcircRNA-HA［均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］。在轉(zhuǎn)錄序列兩側(cè)環(huán)化臂上設(shè)計(jì)上下游引物（F1：5'-ATTAAGTTGGGTAACGCC-3'，R1：-CTAGATATGCTGTTATCCGTC-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用PCR分別線性化EGFPcircRNA、Fluc-circRNA、HA-circRNA 的IVT 模板，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收純化該線性模板；取0.5 μg DNA，20 μL 轉(zhuǎn)錄體系37 ℃孵育2 h；加入無(wú)RNA 酶水80 μL 及1 μL DNaseⅠ，進(jìn)行DNA 模板消化，37 ℃5 min。

1.4 IVC、RNase R 消化及LiCl純化 制備終濃度含250 mmol／L Tris-HCl、50 mmol／L MgCl2、5 mmol／L DTT、10 mmol／L GTP，pH 7.5的環(huán)化試劑。取1.3項(xiàng)80 μL IVT 產(chǎn)物與20 μL 環(huán)化試劑混勻，55 ℃孵育15 ～30 min完成IVC；用RNase R消化circRNA，37 ℃孵育10 min；用終濃度2.5 mol／L LiCl，-20 ℃沉降1 h；4 ℃，10 000 ×g離心10 min；棄上清，用無(wú)RNA酶水復(fù)溶沉降物。

1.5 HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)及circRNA轉(zhuǎn)染 用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基37 ℃，5%CO2培養(yǎng)HEK-293T 細(xì)胞，經(jīng)3 次傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)至70% ～80%匯合度時(shí)，按1 × 106個(gè)／孔鋪至6 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜；取circRNA 與lip3000 混合，室溫孵育15 min；加至6孔板對(duì)應(yīng)細(xì)胞孔中，每孔轉(zhuǎn)染1 ～3 μg circRNA，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

1.6 EGFP 在HEK-293T 細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)分別將EGFP-circRNA 環(huán)化前后1μg 核酸與3μL lip3000 混合孵育后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、96及144 h，收集細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，曝光時(shí)間為200 ms，拍照并記錄。

1.7 Fluc在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè) 分別將1、2、3 μg Fluc-circRNA 與5 μL lip3000 混合孵育后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，裂解釋放蛋白，與熒光底物混合，于酶標(biāo)儀下檢測(cè)熒光數(shù)值（relative light unit，RLU），對(duì)circRNA 的表達(dá)能力進(jìn)行相對(duì)定量并分析。以未轉(zhuǎn)染Fluc-circRNA 的細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照。具體操作按照螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 HA在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。將2μg HA-circRNA 與5μL lip3000 混合孵育后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，與還原性loading buffer 混勻后100 ℃煮沸10 min，制備SDS-PAGE 樣品。將樣品經(jīng)12%SDS-PAGE 分離及轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜；以綿羊來(lái)源的HA IVR-180 多抗為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；以偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的驢抗綿羊抗體為二抗，室溫孵育2 h；將自發(fā)光底物涂于孵育后膜表面，于成像儀下掃描拍照并記錄。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 包含Ⅰ型催化內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的RNA 環(huán)化模板鑒定 IVT 的模板擴(kuò)增質(zhì)粒pB-circRNA-EGFP、pBcircRNA-Fluc、pB-circRNA-HA的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，分別借由上、下游PCR獲得線性化DNA模板，再經(jīng)IVT獲得線性RNA，在環(huán)化試劑作用下以包含Ⅰ型催化內(nèi)含子的5'和3'環(huán)化臂配對(duì)進(jìn)行自剪接反應(yīng)，完成環(huán)化并因環(huán)化臂的脫落產(chǎn)生小片段。

圖1 模板擴(kuò)增質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及circRNA IVC示意圖Fig.1 Schematic diagram of template amplification plasmid structure and circRNA IVC

2.2 IVC后RNA抵抗RNase R 消化 由IVT環(huán)化的RNA 因其環(huán)化過(guò)程脫落2 條大小不一的環(huán)化臂，其電泳條帶變小，同時(shí)泳道中增加了2 個(gè)小條帶，以EGFP-circRNA 環(huán)化為例，見(jiàn)圖2A。用RNase R 分別消化環(huán)化前后RNA，未環(huán)化RNA 完全降解，而環(huán)化后RNA 可部分保留；此外，將環(huán)化時(shí)間由15 min 延長(zhǎng)至30 min，發(fā)現(xiàn)環(huán)化泳道中RNA的彌散方式改變，且經(jīng)RNase R 消化后保留的RNA 有所增加。鑒于RNase R 消化方式，可利用其對(duì)環(huán)化后RNA 進(jìn)行純化。見(jiàn)圖2B。

圖2 EGFP-circRNA 環(huán)化及RNase R 消化處理的核酸電泳圖Fig.2 NucleicacidelectrophoreticprofilesofEGFP-circRNA cyclization and RNase R digestion treatment

2.3 EGFP-circRNA在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染EGFP-circRNA 環(huán)化RNA 的HEK-293T 細(xì)胞在24、48、96、144 h，于熒光顯微鏡下均可見(jiàn)明顯的綠色熒光；連續(xù)培養(yǎng)144 h 后，HEK-293T 細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)堆積、漂??；而轉(zhuǎn)染未環(huán)化RNA 的HEK-293T 細(xì)胞均未見(jiàn)熒光。見(jiàn)圖3。表明含有IRES-CVB3 翻譯起始元件的RNA，其環(huán)化對(duì)于蛋白的表達(dá)是必要的，且在轉(zhuǎn)染后24 h即有較好表達(dá)。

圖3 EGFP-circRNA 轉(zhuǎn)染后HEK-293T 細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察（×20）Fig.3 Fluorescence microscope observation of HEK-293T cells transfected with EGFP-circRNA（×20）

2.4 Fluc-circRNA在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)將表達(dá)的目的蛋白更換為相對(duì)分子質(zhì)量較大的Fluc 蛋白，IVC前Fluc-circRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的熒光值為87.50，約為空白對(duì)照組（16.67）的5 倍，而IVC 后Fluc-circ-RNA 的表達(dá)更顯著，1、2 和3 μg 轉(zhuǎn)染劑量組平均熒光值分別為2 116.67、3 250.00 和3 795.83，分別為空白對(duì)照組的127（t= 40.93，P＜0.000 1）、195（t=17.27，P＜0.000 1）、228倍（t=24.35，P＜0.000 1）。見(jiàn)圖4。

圖4 Fluc蛋白表達(dá)檢測(cè)的熒光數(shù)值Fig.4 RLU for Fluc expression detection

2.5 HA-circRNA在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá) Western blot分析顯示，circRNA上有HA蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖5。

圖5 HA 蛋白在HEK-293T 細(xì)胞上表達(dá)的Western blot分析Fig.5 Western blotting of HA protein expressed in HEK-293T cells

3 討論

2019年，SARS-CoV-2的暴發(fā)推動(dòng)了全球mRNA疫苗領(lǐng)域的飛速發(fā)展［16-17］，但mRNA疫苗在體內(nèi)遞送和儲(chǔ)存方面的問(wèn)題增加了生產(chǎn)和運(yùn)輸成本［18］。相比之下，circRNA 的環(huán)形結(jié)構(gòu)不易被RNA 酶降解，其穩(wěn)定性更適于RNA水平生物信息的傳遞及處理［19-20］，尤其是隨著可編碼circRNA的發(fā)現(xiàn)，使其成為繼mRNA疫苗后最具潛力的新型核酸疫苗［4］。人工設(shè)計(jì)的circRNA已在COVID-19 及難以治療的黑色素瘤惡性腫瘤中表現(xiàn)出預(yù)防及治療效果［21-22］。

本研究參考WESSELHOEFT 等［6］方法，利用Ⅰ型催化內(nèi)含子結(jié)構(gòu)構(gòu)建的5'和3'環(huán)化臂及IRES-CVB3翻譯起始元件成功表達(dá)了報(bào)告基因EGFP、Fluc及具有應(yīng)用價(jià)值的流感HA。該種RNA IVC 方式是利用PIE策略中雙酯交換反應(yīng)，因此在環(huán)化過(guò)程中產(chǎn)生兩端同源臂脫落的小片段，可據(jù)此作為IVC 發(fā)生的標(biāo)志。雖然文獻(xiàn)［6］顯示該方法環(huán)化率高達(dá)90%以上，但經(jīng)RNase R 處理過(guò)的RNA 條帶灰度不到50%，可能如QU 等［15］的研究結(jié)果，較長(zhǎng)時(shí)間的RNase R 處理會(huì)對(duì)circRNA 產(chǎn)生一定降解作用。此外，本研究在circRNA 表達(dá)EGFP時(shí)，轉(zhuǎn)染未環(huán)化的RNA未觀察到綠色熒光，而在Fluc的表達(dá)中，IVT-RNA 組檢測(cè)到的數(shù)值比空白組高5倍，提示該circRNA 上元件在環(huán)化前線性RNA 形態(tài)下也有一定的表達(dá)功能，或者能在未添加環(huán)化試劑時(shí)自發(fā)環(huán)化。最后，利用流感HA（IVR-180）抗原蛋白也驗(yàn)證了這種體外制備可編碼circRNA骨架的普遍適用性，同時(shí)也為流感HA-circRNA疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。