蔣 艷,黎雪梅,鄒吳春,任 麗,何 春,陽袁莉

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院資陽醫(yī)院/資陽市第一人民醫(yī)院婦科,四川 資陽 641300;2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川 成都 610000)

以卵巢癌為代表的婦科疾病被稱為是導(dǎo)致女性死亡的婦科腫瘤三大殺手之一,在發(fā)展中國家屬于最常見的婦科惡性腫瘤[1]。高級(jí)別漿液性卵巢癌(advanced high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是上皮性卵巢癌的常見亞型之一,因其具有典型的組織學(xué)和分子學(xué)異質(zhì)性,檢測(cè)手段缺乏特異性,患者因感不適就診時(shí)多已至中晚期[2]。目前卵巢癌的發(fā)病率控制方面的進(jìn)展甚微,且越來越呈年輕化趨勢(shì)。最近有學(xué)者指出,腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TILs)通過某些途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,如從血管滲出進(jìn)入實(shí)體瘤微環(huán)境的CD8+細(xì)胞,其水平表達(dá)與結(jié)直腸癌的微血管密度密切相關(guān),聯(lián)合靶向治療促進(jìn)CD8+細(xì)胞水平能達(dá)到抗血管生成的目的[3];作為B7家族的跨膜蛋白B7-H3(CD276),其在腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)中起著復(fù)雜作用,能直接作用于靶細(xì)胞作為免疫檢查點(diǎn),同時(shí)還可能參與癌細(xì)胞的胞內(nèi)信息傳遞,為眾多腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)提供了可能性[4]。但目前關(guān)于血清CD276與HGSOC臨床結(jié)局的關(guān)系尚存在爭議。本研究收集73例晚期HGSOC患者的臨床資料,旨在分析血清可溶性CD276(sCD276)對(duì)晚期HGSOC患者免疫環(huán)境的影響及與預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床資料完整,所有受試者均能配合隨訪;②術(shù)前為進(jìn)行放療、靶向、免疫和化療等治療;③HGSOC均為原發(fā)性病變,病理分期為IIIc期及IV期。排除標(biāo)準(zhǔn):①有血液系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病;②合并重大臟器損傷等影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的并發(fā)癥;③存在其他惡性腫瘤和全身感染者;④存在認(rèn)知功能障礙和精神疾病者;⑤卵巢癌復(fù)發(fā)者;剔除標(biāo)準(zhǔn):①未能定期隨訪者;②隨訪時(shí)間不足者;③實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果不完整的受試者。將2017 年3 月至2020 年3 月于資陽市第一人民醫(yī)院就診的晚期HGSOC患者73 例納入A組,年齡42～78 歲[(62.75±6.24)歲];根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟臨床分期[5]分為IIIc期42例、IV期31例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57 例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例。選取同期入院治療的其他類型卵巢癌患者80 例納入B組,年齡41～76 歲[(62.24±7.27)歲],根據(jù)疾病類型分為子宮內(nèi)膜樣癌32 例,黏液性癌24 例,透明細(xì)胞癌17 例,低級(jí)別漿液性癌7 例;臨床分期分為IIIc期48 例、IV期32 例;根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可分為:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60 例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例。另選擇80 名健康人群作為健康人群組,年齡43 歲～72 歲[(62.53±6.58)歲]。三組受試者的年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn),受試者同意接受治療并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血清指標(biāo)的檢測(cè) 三組受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 ml,進(jìn)行離心處理(3000 r/min,10min),凝固分離得到血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清sCD276的表達(dá)水平。

1.2.2組織標(biāo)本獲取及檢測(cè) 收集所選晚期HGSOC患者術(shù)后癌中間組織、距腫瘤邊緣約5 cm癌旁組織制作成標(biāo)本,采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè),將標(biāo)本置于10%甲醛溶液中固定,后經(jīng)石蠟包埋處理后制成5 μm的切片標(biāo)本,檢測(cè)細(xì)胞表面CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和調(diào)節(jié)性叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(regulatory forkhead transcription factor P3,FoxP3+)的表達(dá)。將其編碼并在70 ℃烤箱中烘干,后加入二甲苯液脫蠟、95%乙醇浸泡水化處理、高溫高壓抗原修復(fù)等一系列操作后,加入鼠抗人單克隆抗體作為一抗,按照試劑盒合適比例稀釋,保證一抗溶液能完全覆蓋切片標(biāo)本,再37 ℃孵育1 h,使用磷酸緩沖溶液清洗后甩干玻片,于組織中央加入二抗,在25 ℃下孵育1 h,使用磷酸緩沖溶液清洗后滴加現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺染色液,再清水沖洗二氨基聯(lián)苯胺染色液后將玻片置于蘇木素染液中浸潤復(fù)染,最后切片梯度酒精脫水(濃度依次為75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇),脫水后置于二甲苯中透明處理,中性樹膠封片,蓋玻片覆蓋晾干處理。使用光學(xué)顯微鏡高倍視野下觀察切片,磷酸緩沖溶液代替一抗作為空白對(duì)照。陽性結(jié)果染色強(qiáng)度由弱至強(qiáng)評(píng)分:0 分(無著色)、1 分(淺黃色)、2 分(棕黃色)、3 分(棕褐色)。陽性細(xì)胞比例評(píng)分:0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2 分(26%～50%)、3 分(51%～75%)、4分(76%～100%)。將染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞比例評(píng)分的總分作為最終分值[6]:0 分為陰性(-),1～5 分為弱陽性(+),6～9 分為中度陽性(++),10～12 分為強(qiáng)陽性(+++),綜合評(píng)價(jià)最終分值<5分為CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和FoxP3+陰性,最終分值≥5分為CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+、CD276+和FoxP3+陽性。CD276以腫瘤細(xì)胞膜免疫反應(yīng)陽性為標(biāo)志。

1.3 隨訪指標(biāo)通過門診、電話或住院方式對(duì)腫瘤患者第1 年至少每3 個(gè)月隨訪1 次,第2～3年至少每6 個(gè)月隨訪1 次,持續(xù)隨訪3 年,隨訪終點(diǎn)以患者死亡或失訪為終點(diǎn)事件。其中總生存率定義為初始診斷癌癥時(shí)間至死亡或失訪時(shí)間,無進(jìn)展生存期定義為癌癥初始診斷至首次復(fù)發(fā)或死亡或失訪時(shí)間,無病生存率定義為患者腫瘤切除結(jié)束至局部復(fù)發(fā)或死亡或失訪時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier描繪生存曲線,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行預(yù)后多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清sCD276表達(dá)水平的比較A組和B組血清sCD276表達(dá)水平分別為(496.24±78.85) pg/ml、(403.66±70.47) pg/ml,均高于健康人群組(242.07±25.56) pg/ml(P<0.05),且A組血清sCD276表達(dá)水平高于B組(P<0.05)。

2.2 血清sCD276表達(dá)水平在卵巢癌患者中的預(yù)后表達(dá)情況比較將A、B兩組卵巢癌患者依據(jù)血清sCD276表達(dá)水平中位數(shù)進(jìn)行分組,分為高表達(dá)組(≥451.26 pg/ml)和低表達(dá)組(<451.26 pg/ml)。A組中低表達(dá)組患者的無病生存率及總生存率均高于高表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。A組中無病生存時(shí)間≥12個(gè)月的患者血清sCD276表達(dá)水平(214.58±74.10) pg/ml,低于無病生存時(shí)間<12個(gè)月組(316.61±85.27) pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.96,P<0.05)。

表1 A組不同血清sCD276表達(dá)水平患者的無病生存率、總生存率比較 (%)

2.3 A組不同血清sCD276表達(dá)水平患者的臨床特征比較A組患者依據(jù)血清sCD276表達(dá)水平分為sCD276≥451.26 pg/ml組和sCD276<451.26 pg/ml組。兩組患者在年齡、有無絕經(jīng)、臨床分期、CA125水平、BRCA基因突變、有無新輔助化療、有無CD4+、CD8+、CD80+、CD86+陽性等方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無術(shù)后殘余病灶、有無CD3+陽性、FoxP3+陽性等方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 A組不同血清sCD276表達(dá)水平患者的臨床特征比較[n(%)]

2.4 影響晚期HGSOC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析將HGSOC患者預(yù)后作為因變量,以有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有術(shù)后殘余病灶、CD3+陽性、FoxP3+陽性、血清sCD276≥451.26 pg/ml作為自變量,經(jīng)多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析得出,有術(shù)后殘余病灶、CD3+陽性、FoxP3+陽性、血清sCD276≥451.26 pg/ml均是晚期HGSOC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響晚期HGSOC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

2.5 腫瘤組織膜CD276不同表達(dá)亞組患者中血清sCD276及TILs的表達(dá)情況經(jīng)免疫組化法對(duì)腫瘤組織檢測(cè)得出,A組中有59例患者膜CD276表達(dá)為陽性,14例患者膜CD276表達(dá)為陰性。膜CD276陽性組的血清sCD276表達(dá)及FoxP3+陽性比例均明顯高于膜CD276陰性組(P<0.05),兩組CD3+陽性、CD4+陽性、CD8+陽性、CD80+陽性、CD86+陽性比例等指標(biāo)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 腫瘤組織膜CD276不同表達(dá)亞組患者中血清sCD276及TILs的表達(dá)情況比較

3 討論

卵巢癌在中國女性常見癌癥中排名第三位,5年生存率為30%～40%[7]。近幾年,臨床學(xué)術(shù)界迎來了免疫逃逸學(xué)熱潮,主要是研究人體免疫系統(tǒng)和惡性腫瘤關(guān)聯(lián)的惡性生物學(xué)行為[8]。CD276是一種I型跨膜蛋白,基于蛋白序列的相似性,被認(rèn)為是B7家族的免疫檢查點(diǎn)成員,在腫瘤領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注[9]。迄今為止,有多數(shù)研究闡述稱,CD276的促腫瘤功能與腫瘤生長、葡萄糖和脂肪酸代謝、細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移、藥物和化療抗性等有關(guān)[10,11]。也有學(xué)者表示,CD276抑制了T細(xì)胞的細(xì)胞毒性,這種細(xì)胞毒性允許腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。本研究從sCD276著手,探討其與晚期卵巢癌的聯(lián)系。

在本研究中,高血清sCD276表達(dá)是晚期HGSOC患者復(fù)發(fā)或死亡的危險(xiǎn)因素之一,同時(shí)還比較了晚期HGSOC患者腫瘤組織膜CD276表達(dá)情況與TILs的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)膜CD276水平的增高與FoxP3+細(xì)胞浸潤數(shù)量有一定相關(guān)性。這提示CD276在晚期HGSOC患者中有免疫調(diào)節(jié)作用。盡管大多數(shù)正常人體組織都有CD276 mRNA表達(dá),但CD276蛋白的表達(dá)在健康人群細(xì)胞中通過嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控后是高度保守的,而其在許多腫瘤中通常以細(xì)胞外形式過度表達(dá)和升高,這說明腫瘤細(xì)胞獲得了破壞CD276轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的能力[13],因此血清sCD276或許能成為腫瘤免疫浸潤的新型非侵入性分子標(biāo)志物。

臨床試驗(yàn)證明,PD-1/PD-L1抗體僅在25%左右的復(fù)發(fā)性卵巢癌患者中觸發(fā)客觀腫瘤反應(yīng),PD-1/PD-L1抑制治療對(duì)卵巢癌的療效有限,免疫治療尚未成為標(biāo)準(zhǔn)治療方案[14～16]。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)與高應(yīng)答率相關(guān)性強(qiáng)的生物分子標(biāo)志物,雖然對(duì)于PD-1/PD-L1抑制治療存在應(yīng)答反應(yīng)的患者,腫瘤細(xì)胞中和免疫細(xì)胞中可通過PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估,但其也存在局限性,需要結(jié)合病理學(xué)樣本進(jìn)行,同時(shí)還可能因?yàn)槟[瘤的異質(zhì)性,并不能保證病理學(xué)樣本一定能反映疾病情況[17～19]。因此,除了PD-1/PD-L1抑制治療外,還需尋求新的方法來針對(duì)晚期HGSOC中免疫多樣性腫瘤微環(huán)境。血清sCD276作為腫瘤免疫浸潤的替代標(biāo)志物,除了作為一種免疫檢查點(diǎn)分子外,還用于晚期HGSOC的腫瘤微環(huán)境免疫抑制治療試驗(yàn)。國外有學(xué)者選取了147對(duì)晚期HGSOC匹配的樣本,并用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和深入的DNA/RNA測(cè)序評(píng)估了新輔助化療對(duì)晚期HGSOC免疫應(yīng)答的影響,發(fā)現(xiàn)新輔助化療增加了晚期HGSOC免疫浸潤程度,導(dǎo)致大量CD8+T細(xì)胞表達(dá),增強(qiáng)了免疫活性[20]。因此,血清sCD276作為腫瘤免疫浸潤的替代分子標(biāo)志物,為晚期HGSOC新輔助化療期間的免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)提供了可能性,臨床醫(yī)師可考慮在化療實(shí)施后依據(jù)晚期HGSOC腫瘤免疫浸潤程度實(shí)時(shí)聯(lián)合免疫抑制療法來改善患者預(yù)后。

本研究選取了同期住院治療的其他病理類型晚期卵巢癌進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示A組與B組的無病生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示血清sCD276與除晚期HGSOC病理類型的晚期卵巢癌的預(yù)后無相關(guān)性。同時(shí)本研究結(jié)果顯示膜CD276陽性組血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+陽性的比例均明顯高于膜CD276陰性組(P<0.05),同時(shí)經(jīng)多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析模型提示,血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+陽性是晚期HGSOC患者復(fù)發(fā)或死亡的危險(xiǎn)因素。

綜上,血清sCD276在晚期HGSOC呈高表達(dá)水平,其水平升高與TILs標(biāo)志物FoxP3+T細(xì)胞數(shù)量均是晚期HGSOC患者復(fù)發(fā)或死亡的危險(xiǎn)因素,與患者預(yù)后關(guān)系密切,同時(shí)血清sCD276除了作為一種免疫檢查點(diǎn)分子外,還為晚期HGSOC新輔助化療期間的免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)提供了可能性。本研究亦存在不足,研究納入樣本量少,隨訪時(shí)間較短,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能受樣本數(shù)量、地域性差異影響,使結(jié)果存在誤差,故為推動(dòng)后續(xù)研究進(jìn)一步深入,還需增加樣本量、豐富病例的地域性,實(shí)施更長時(shí)間、更大規(guī)模的動(dòng)態(tài)隨訪。