張小丹 王喻燁 嚴雪冰 王成海

1 揚州大學醫(yī)學院,江蘇省揚州市 225009; 2 東臺市中醫(yī)院

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其復發(fā)率和死亡率位居所有惡性腫瘤之首[1-2]。根據(jù)形態(tài)學特征,肺癌分為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌。NSCLC中最常見類型為肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)[3]。盡管最近醫(yī)療技術取得了較大的進步,但LUAD的5年生存率仍然很低[4-5],主要是因為LUAD在早期缺乏明顯的癥狀,難以檢測。因此,迫切需要尋找新的肺癌診斷指標和治療方法。

PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)是一種非編碼小RNA,長度約為30個核苷酸[6]。研究表明,PIRNA和PIWI蛋白在各種癌癥中的異常表達可能成為腫瘤診斷和治療的新生物標志物和治療靶點[7]。Li等[8]通過人類小RNA表達譜測序分析了五對LUAD組織中piRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)piR-30636、piR-26925和piR-5444在LUAD組織中表達顯著上調(diào),但文中僅研究了piR-26925和piR-5444作為LUAD診斷的生物學指標,并沒有對piR-30636的作用進行相關研究。因此本文通過研究肺腺癌組織中piR-30636的表達、臨床意義及對遷移的影響,以便發(fā)現(xiàn)LUAD中piR-30636的生物學功能。

1 材料和方法

1.1 樣本和資料 選取2020年1月—2022年12月期間,在揚州大學附屬醫(yī)院和東臺市中醫(yī)院接受肺癌手術切除的76例患者作為研究對象,年齡35～68歲,中位年齡52歲。(1)納入標準:①臨床資料、病理資料無缺失者;②經(jīng)病理醫(yī)師確診為肺腺癌患者;③術前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者;④對本研究知情同意者;⑤預期生存時間>3個月;⑥患者具有良好的器官功能。(2)排除標準:①合并其他部位惡性腫瘤者;②合并腦轉(zhuǎn)移;③藥物不可控制的高血壓[收縮壓≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa),舒張壓≥90mmHg];④心、肝、腎功能不全;⑤自身免疫性疾病、感染性疾病患者;⑥有出血傾向或正接受抗凝治療者。收集76例配對的LUAD組織和鄰近的正常肺組織以及相關病理資料。本實驗經(jīng)揚州大學醫(yī)學院倫理委員會批準,并與患者簽署知情同意書。

1.2 質(zhì)粒和細胞 piR-30636 mimic和si-piR-30636質(zhì)粒合成于南京金斯瑞生物科技公司。肺上皮細胞系16HBE和人肺腺癌細胞系A549購自上海中科院細胞庫。通過Lipofectamine 2000細胞轉(zhuǎn)染試劑盒將piR-30636 mimic和si-piR-30636質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549宮頸癌細胞株,并將細胞株均放置在含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后放置在37℃,含有5% CO2濃度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培育。

1.3 實時熒光定量PCR實驗 肺腺癌總RNA的抽提是通過TRIZOL試劑裂解萃取并通過分光光度計測定RNA濃度。然后通過Takara公司的cDNA合成試劑盒合成cDNA。實時熒光定量PCR運用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara公司),并按試劑說明書進行。piR-30636的上游引物為AGGUCCUCAGCUCUCAUG,下游引物為AGGACCCCUGUCCUAGGU。將包含反應體系的檢測樣本在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system進行qRT-PCR實驗,實驗步驟包括:(1)預變性:95℃ 時間為30s。(2)PCR反應:重復:40個循環(huán),95℃ 時間為5s; 60℃ 時間為45s。

1.4 原位雜交檢測piR-30636的表達 76例新鮮標本進行組織切片。在室溫下,過氧化氫處理可消除內(nèi)源性過氧化物酶。使用胃蛋白酶消化組織切片。用預雜交液在培養(yǎng)箱中孵育組織切片,然后加入雜交液孵育12h。清洗后加入密封液。加入生物素化地高辛。組織中加入SABC。加入生物素化過氧化物酶。組織進行DAB染色、蘇木精復染、洗滌、脫水、透明、封閉。用預雜交液代替含有探針的雜交液作為空白對照,piR-30636寡核苷酸探針序列為:(1)ACCUAGGACAGGUCCUCAGCUCUCAUG,(2)AUGAGAGCUCAGGACCCCUGUCCUAGGU。每個樣本取5個高倍視野計算陽性細胞比例:陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.5 Transwell遷移實驗 首先將細胞在無血清的培養(yǎng)液饑餓12h,胰酶消化后制備無血清培養(yǎng)液重懸細胞(5×105/ml)。取細胞懸液100μl加到Transwell小室中央中,下室加入2.5% FBS 的 600μl培養(yǎng)液,將小室放進37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室, PBS清洗后甲醇固定30min,將Transwell小室適當風干;0.1%結晶紫染色20min左右,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,用PBS洗3次;400倍光學顯微鏡下隨即挑選5個視野觀察遷移的細胞,并計數(shù)穿膜的A549細胞個數(shù)并拍照。分組包括過表達piR-30636組、沉默表達piR-30636(si-piR-30636)組和正常A549細胞(NC)組。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS16.0和Graph Pad 5.0軟件分析數(shù)據(jù)和編輯圖片。計數(shù)資料組間采用Pearson’s法χ2檢驗,計量資料采用均數(shù)±標準差表示,符合正態(tài)分布,兩組間行t檢驗,多組間行ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LUAD組織中piR-30636的表達 qRT-PCR實驗結果如圖1所示,在LUAD組中 piR-30636的表達水平為6.975±2.336,明顯高于癌旁正常肺組織的表達水平(1.796±0.922),兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=22.461,P<0.05)。

圖1 qRT-PCR檢測piR-30636的表達水平

圖2 RISH顯示LUAD組織中piR-30636的陽性表達

2.2 RISH檢測piR-30636的陽性表達 采用RNA原位分子雜交(RISH)檢測76對LUAD組織和癌旁正常肺組織中piR-30636的陽性表達情況。如圖2所示,在LUAD組織中piR-30636主要為陽性表達,胞漿著色為棕黃色的是陽性細胞。piR-30636陽性率為72.37%(55/76)明顯高于鄰近正常組織的15.79%(12/76),兩組間有統(tǒng)計學差異(χ2=5.441,P=0.020<0.05)。

2.3 piR-30636陽性表達及其臨床病理意義 根據(jù)piR-30636的陽性表達情況,將LUAD病例分為陽性表達組55例和陰性表達組21例。如表1所示, piR-30636陽性表達與腫瘤分級、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05),而與患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、TNM分期無關(均P>0.05)。提示piR-30636參與了肺腺癌的淋巴結轉(zhuǎn)移過程。

表1 piR-30636陽性表達及其臨床病理意義

2.4 Transwell實驗檢測piR-30636對肺癌細胞遷移的影響 上述臨床病理意義結果表明piR-30636與LUAD的淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關,因此通過Transwell實驗進一步研究piR-30636對肺癌細胞遷移的影響。首先驗證過表達或沉默piR-30636表達的有效性:應用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染實驗,將過表達或沉默piR-30636表達的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染A549細胞。結果發(fā)現(xiàn)過表達piR-30636后,piR-30636的表達水平升高,而沉默表達piR-30636后piR-30636的表達水平降低(如圖3所示)。與未轉(zhuǎn)染相關質(zhì)粒的對照組(NC)相比,兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。說明過表達和沉默piR-30636表達的質(zhì)粒有效。

圖3 在A549中過表達或沉默piR-30636的有效性分析結果

然后進行Transwell遷移實驗,結果如圖4所示,piR-30636的過表達顯著促進了肺癌細胞株A549的遷移,而沉默表達piR-30636則明顯阻礙了A549的遷移,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。實驗結果表明piR-30636對肺癌細胞的遷移作用。

圖4 Transwell檢測piR-30636對肺癌細胞的遷移結果

3 討論

目前在中國,肺癌的發(fā)病率已排在惡性腫瘤的首位,每年發(fā)病人數(shù)約78.1萬,死亡人數(shù)也達到62.6萬左右[9],患者死亡的主要原因在于肺癌的轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥性。近年來隨著臨床治療方案的不斷改進,越來越多的靶向藥物和新的生物免疫療法的綜合應用,肺癌患者的生存和預后得到了明顯的提高和改善[10]。

與PIWI蛋白相作用的非編碼單鏈小RNA稱為piRNAs,其生物學功能包括沉默轉(zhuǎn)錄基因過程、維持生殖系和干細胞功能,調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性等[11]。目前piRNA已成為惡性腫瘤研究的熱點之一[12]。例如,在非小細胞肺癌中piR-651表達水平上調(diào),能促進肺癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。Peng等[14]檢測發(fā)現(xiàn)肺癌組織中piR-55490的表達水平下調(diào),能促進肺癌細胞凋亡而抑制細胞增殖,具有抑癌基因的作用。piR-1366在NSCLC中表達水平升高,是一個新的促癌基因,能促進肺癌淋巴結的轉(zhuǎn)移[15]。本文通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)在76例LUAD組織中piR-30636的表達上調(diào),驗證了piR-30636在表達譜測序的結果[8],這也說明了piR-30636是一個致癌基因。本文以piR-30636作為研究對象,研究其在LUAD生物學作用。

RISH顯示LUAD組織中piR-30636 主要呈陽性表達,而正常肺組織中主要為陰性表達。實驗結果進一步表明piR-30636在LUAD中表達上調(diào),發(fā)揮促癌基因的作用。在分析piR-30636不同的陽性表達水平與臨床資料的關系時發(fā)現(xiàn)piR-30636的陽性表達與LUAD的腫瘤分級和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關,該結果說明piR-30636表達水平越高則腫瘤越容易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移,piR-30636可作為判斷患者預后的一個指標。為了進一步證明piR-30636對LUAD肺癌細胞轉(zhuǎn)移的影響,我們進行了Transwell遷移實驗。本研究表明piR-30636的過表達顯著促進了肺腺癌A549細胞的遷移,降低piR-30636表達則明顯阻礙了A549的遷移;該結果表明piR-30636能促進肺腺癌細胞的遷移和遠處轉(zhuǎn)移,也為 piR-30636作為靶點治療轉(zhuǎn)移性肺腺癌提供依據(jù)。本研究不足之處在于目前只研究了piR-30636在肺腺癌中的功能,并沒有對促轉(zhuǎn)移作用機制進行探究。

總之,本文認為piR-30636與肺腺癌的生物學行為有一定的相關性。piR-30636在肺腺癌組織中表達水平上調(diào),是一個新的促癌基因;高表達的piR-30636與腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移有相關性,piR-30636有促進肺癌細胞遷移作用,本次實驗為進一步研究肺腺癌伴有淋巴結轉(zhuǎn)移機制提供了一定的理論依據(jù),piR-30636有可能成為治療轉(zhuǎn)移性肺腺癌的新靶點。