梁偉華

石河子大學(xué)病理學(xué)系,新疆石河子市 832000

子宮內(nèi)膜癌是在子宮內(nèi)膜腺體上發(fā)展的常見惡性腫瘤,其中絕經(jīng)后和圍絕經(jīng)期女性發(fā)生率較高。當(dāng)前子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制尚無(wú)明確定論,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與過(guò)度肥胖、生活方式以及高血壓病史等相關(guān)[1]。手術(shù)結(jié)合術(shù)后放化療是當(dāng)前子宮內(nèi)膜癌常見的治療方案。研究發(fā)現(xiàn)[2],不同病理特征的分類能夠準(zhǔn)確指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌患者的手術(shù)及術(shù)后治療,針對(duì)個(gè)體化差異提升放化療敏感性,改善患者預(yù)后水平。程序性死亡受體1(Programmed death receptor 1,PD-1)、程序性死亡配體1(Programmed death ligand 1,PD-L1)在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)有助于篩選適當(dāng)?shù)淖訉m內(nèi)膜癌患者,并通過(guò)免疫治療,使其得到更好的生存獲益[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4],腫瘤分化程度越高的患者會(huì)呈現(xiàn)PD-1、PD-L1高表達(dá)現(xiàn)象,對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑更為敏感。但臨床病理特征檢查方法較為復(fù)雜,因此應(yīng)用免疫組化檢查來(lái)代替臨床病理相關(guān)特征對(duì)子宮內(nèi)膜癌的臨床治療提供參考被越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)可。有研究發(fā)現(xiàn)[5],錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair,MMR)基因突變會(huì)導(dǎo)致癌癥患者表型異常及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性積累,形成高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定,促使癌癥發(fā)生發(fā)展。所以,采取免疫組化法檢測(cè)MMR蛋白表達(dá),對(duì)于分析子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理特征具有重要價(jià)值。因此,本研究探討了PD-1、PD-L1、MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及與患者臨床病理特征的相關(guān)性,具體總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2020年6月—2023年6月收治的80例子宮內(nèi)膜癌患者作為研究對(duì)象,患者年齡45～72歲,平均年齡(62.36±5.63)歲,均為初診子宮內(nèi)膜癌患者,且均行病理活檢切片檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤者;復(fù)發(fā)者;曾接受過(guò)化療或放療者;無(wú)法進(jìn)行免疫組化檢查者;臨床病理資料不全者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 MMR蛋白檢測(cè)方法:將所有標(biāo)本應(yīng)用4%的中性甲醇液進(jìn)行固定處理,隨后采取石蠟包埋,HE染色。應(yīng)用Max Vision兩步法進(jìn)行免疫組化,并進(jìn)行石蠟切片脫蠟,在水化之后進(jìn)行PBS沖洗,并應(yīng)用過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性。加入鼠抗人單克隆抗體 MLHl作為一抗之后,進(jìn)行室溫孵育,隨后加入生物素標(biāo)記二抗與鏈霉素抗生素過(guò)氧化酶溶液,孵化之后加入DAB進(jìn)行顯色,并采取蘇木素復(fù)染,隨后常規(guī)脫水,封片處理。MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)試劑盒均由福州邁新生物科技有限公司提供。并且對(duì)腫瘤周圍正常上皮細(xì)胞進(jìn)行上述免疫組化,并作為對(duì)照。結(jié)果判定:MMR蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,MLH1、PMS2、MSH2和MSH6缺少一種著色可判定表達(dá)缺失,并在400倍高倍鏡下,將陽(yáng)性細(xì)胞依照染色強(qiáng)度和深度進(jìn)行分級(jí),其中棕黃色為3分,黃色為2分,淡黃色為1分,無(wú)著色為0分。陽(yáng)性細(xì)胞比例>75%為4分,51%～75%為3分,11%～50%為2分,≤10%為1分,無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分。兩項(xiàng)得分成績(jī)?cè)?分以內(nèi)為表達(dá)缺失,≥2分為非缺失。MLH1、PMS2、MSH2和MSH6一種及以上蛋白缺失可判定為MMR蛋白表達(dá)缺失。所有檢測(cè)項(xiàng)目均由相同的2位檢驗(yàn)科醫(yī)師負(fù)責(zé)。

PD-1、PD-L1檢測(cè)方法:免疫組化染色法與MMR蛋白檢測(cè)方法相同,PD-1、PD-L1試劑盒由福州邁新生物科技有限公司提供。封片后隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野的計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,評(píng)估樣品PD-1、PD-L1的染色強(qiáng)度及深度。計(jì)數(shù)細(xì)胞≥1%為陽(yáng)性,<1%為陰性,黃色或棕黃色染色為陽(yáng)性,無(wú)著色或淺黃色為陰性。

1.3 觀察指標(biāo) 收集所有患者臨床病理信息,其中包括:年齡、腫瘤部位、腫瘤最大直徑、病理類型、細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。(1)分析PD-1、PD-L1、MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平;(2)不同病理特征患者PD-1、PD-L1表達(dá)情況對(duì)比;(3)不同病理特征患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)缺失率情況對(duì)比;(4)PD-1、PD-L1、MMR蛋白表達(dá)情況與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1、MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平分析 80例子宮內(nèi)膜癌患者中,子宮內(nèi)膜癌組織PD-1陽(yáng)性表達(dá)率為63.75%(51/80),PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為67.50%(54/80);MMR蛋白表達(dá)缺失率為70.00%(56/80),且患者多存在MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白一種或多種缺失情況,其中MLH1缺失率為20.00%(16/80),PMS2缺失率為40.00%(32/80),MSH2缺失率為8.75%(7/80),MSH6缺失率為7.50%(6/80),PD-1/PD-L1、MMR蛋白具體表達(dá)情況見圖1。

圖1 PD-1/PD-L1、MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平

2.2 不同病理特征患者PD-1、PD-L1表達(dá)情況及MMR蛋白表達(dá)缺失率對(duì)比 80例子宮內(nèi)膜癌患者中PD-1陽(yáng)性與陰性患者的細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比差異顯著,PD-L1陽(yáng)性患者與陰性患者的病理類型、細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比差異顯著,MMR蛋白基因缺失與基因完整患者的腫瘤部位、細(xì)胞分化程度、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比差異顯著(P<0.05),見表1。

表1 不同病理特征患者PD-1、PD-L1表達(dá)情況及MMR蛋白表達(dá)缺失率對(duì)比(n=80)

2.3 PD-1、PD-L1、MMR蛋白與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性 PD-1與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),PD-L1與病理類型、細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),MMR蛋白與子宮內(nèi)膜癌腫瘤部位、細(xì)胞分化程度、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 PD-1、PD-L1、MMR蛋白與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的相關(guān)性(r)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌作為女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一,發(fā)生率約為所有女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的30%[6]。子宮內(nèi)膜癌患者早期多無(wú)明顯異常,隨著腫瘤進(jìn)展,可出現(xiàn)直腸刺激癥狀、不孕不育、痛經(jīng)、月經(jīng)異常、疼痛以及白帶異常等癥狀,降低患者生活質(zhì)量,威脅患者生命安全。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)[7],腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境相關(guān),而腫瘤微環(huán)境由炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴管或血管以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。其中PD-1、PD-L1在腫瘤的免疫逃逸之中發(fā)揮了重要作用,是表達(dá)在B細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及T細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)受體,且其配體和受體相互作用,對(duì)T細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制,從而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[8]。另外有研究發(fā)現(xiàn)[9],子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生主要由DNA錯(cuò)配修復(fù)基因的MLH1、PMS2、MSH2或MSH6胚系突變所導(dǎo)致。MMR是糾正堿基錯(cuò)配的一個(gè)重要因子,利用修復(fù)DNA的復(fù)制所產(chǎn)生堿基對(duì)錯(cuò)誤,維持基因組的穩(wěn)定性和完整性,避免出現(xiàn)突變,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但當(dāng)前我國(guó)關(guān)于PD-1、PD-L1、MMR蛋白和子宮內(nèi)膜癌的病理特征相關(guān)研究依然處在初始階段,并沒(méi)有給予充分的重視。

本研究結(jié)果表明:(1)80例子宮內(nèi)膜癌患者中,子宮內(nèi)膜癌組織PD-1陽(yáng)性表達(dá)率為63.75%,PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為67.50%;MMR蛋白表達(dá)缺失率為70.00%。提示大多子宮內(nèi)膜癌患者存在PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)及MMR蛋白缺失情況。與鄭大煒等[10]相關(guān)研究結(jié)果相符,均表明非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤微環(huán)境和DGFR突變相關(guān),特別是腫瘤之中存在PD-L1高表達(dá)現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)[11],PD-1、PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)均明顯升高,特別是對(duì)于淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移患者的CD3陽(yáng)性效應(yīng)T細(xì)胞表達(dá)升高。而對(duì)于子宮內(nèi)膜癌患者來(lái)說(shuō),PD-1多分布在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜之中。PD-L1多分布在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上,少數(shù)分布在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。PD-L1作為PD-1特異性配體,能夠發(fā)揮分子屏蔽作用,導(dǎo)致PD-L1表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞免受CD8陽(yáng)性T細(xì)胞介導(dǎo)免疫殺傷作用。因此,PD-1/PD-L1通路也是腫瘤微環(huán)境影響腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。阻斷PD-1/PD-L1通路可以在具有高度免疫原型腫瘤表現(xiàn)出更持久的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)[12],應(yīng)用免疫組化檢測(cè)MMR蛋白也是篩查L(zhǎng)ynch綜合征相關(guān)直腸癌的重要流程,而近年來(lái)Lynch綜合征相關(guān)子宮內(nèi)膜癌也備受關(guān)注。有報(bào)道指出[13],MMR缺失的多種腫瘤受益于PD-1單抗治療。因此,檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者PD-1、PD-L1、MMR蛋白的表達(dá)具有重要價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)[14],PD-1、PD-L1過(guò)度表達(dá)和癌癥患者的預(yù)后情況具有重要關(guān)系,但與病理特征的關(guān)系尚無(wú)確切定論。(2)在80例子宮內(nèi)膜癌患者中,PD-1、PD-L1過(guò)度表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的細(xì)胞分化程度、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有一定關(guān)系。這是因?yàn)?PD-L1與細(xì)胞膜上的受體PD-1結(jié)合后,會(huì)產(chǎn)生抑制信號(hào),抑制CD4+T細(xì)胞的活化和增殖,同時(shí)降低INF-α及IL-2水平,抑制T細(xì)胞功能,導(dǎo)致腫瘤免疫抑制微環(huán)境的出現(xiàn),促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生與發(fā)展。(3)本研究結(jié)果顯示,MMR蛋白基因缺失與基因完整患者的腫瘤部位、細(xì)胞分化程度、子宮肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比差異顯著(P<0.05)。MMR蛋白缺失型的子宮內(nèi)膜癌患者多數(shù)為散發(fā)病例,約有3%的患者存在Lynch綜合征,同時(shí)Lynch綜合征也是MMR基因突變導(dǎo)致染色體遺傳病的重要因素,增加女性子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率。有研究發(fā)現(xiàn)[15],MMR缺失型子宮內(nèi)膜癌患者更容易出現(xiàn)磷酸酶張力蛋白同源酶突變,容易出現(xiàn)淋巴結(jié)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,與本研究結(jié)果相符。本次研究結(jié)果表明,PD-1、PD-L1、MMR蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理特征具有密切關(guān)系。提示,PD-1、PD-L1基因表達(dá)和MMR蛋白的檢測(cè)對(duì)于判斷子宮內(nèi)膜癌的臨床病理分期具有重要價(jià)值,為子宮內(nèi)膜癌的治療提供參考意見。但由于本研究樣本量過(guò)少,可能存在一定局限,因此還需在后續(xù)研究中增加樣本量進(jìn)行持續(xù)深入分析,并分期其變化與臨床病理特征相關(guān)的機(jī)理。

綜上所述,PD-1、PD-L1、MMR蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理特征具有密切關(guān)系,臨床可考慮應(yīng)用三者對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷與預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià),為臨床提供參考意義。