謝阿貴

（1.片仔癀（上海）生物科技研發(fā)有限公司，上海 200030； 2.福建片仔癀化妝品有限公司，福建 漳州，363000）

“頭發(fā)有彈性，有自然光澤，沒有頭屑”是世界衛(wèi)生組織公布的身體健康的標(biāo)準(zhǔn)之一［1］。由于環(huán)境污染的逐步加重以及人們生活壓力增大等多方面因素的影響，頭發(fā)黯淡無光、脫發(fā)短發(fā)、頭皮屑滋生、頭皮瘙癢等一系列問題隨之而來，這給人們的日常生活帶來了煩惱，甚至影響了身心健康［2］。在臨床上，頭皮脫落的原因主要包含單純頭皮屑脫落及脂溢性皮炎［3］。單純頭皮屑是指“正?！钡念^皮所脫落的灰白色疏松干燥的小片狀鱗屑；脂溢性皮炎是一種皮脂溢出區(qū)的慢性炎癥性皮膚病，通常表現(xiàn)為鱗屑增多、頭皮瘙癢、基底泛紅，嚴(yán)重者頭皮會(huì)出現(xiàn)紅斑且有黏性物質(zhì)滲出［4-5］。

馬拉色菌是生長在人類皮膚角質(zhì)層的常駐菌，它能破壞頭皮微環(huán)境，導(dǎo)致頭部表皮細(xì)胞代謝紊亂，產(chǎn)生大量頭皮屑［6］。因此，頭皮去屑止癢的關(guān)鍵就在于抑制馬拉色菌的過度生長，改善頭皮微環(huán)境，進(jìn)而抑制頭皮炎癥的發(fā)生［7］。目前臨床上使用的去屑洗護(hù)用品大致分為三個(gè)類型：抗真菌制劑、角質(zhì)層剝脫劑、角質(zhì)層細(xì)胞生長抑制劑。長期使用這類制劑會(huì)破壞頭皮微環(huán)境，對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激，發(fā)生頭皮干燥易過敏等現(xiàn)象［8-10］。

近年來中外文獻(xiàn)開始深入研究中藥提取物對(duì)頭皮去屑止癢的功效，側(cè)柏葉、當(dāng)歸、白鮮皮、苦參等多種中藥已被發(fā)現(xiàn)具有明顯抑制馬拉色菌的作用［11-12］。另外，研究發(fā)現(xiàn)部分中藥提取物同時(shí)具有顯著的抗炎效果，且因其具有綠色天然、安全可靠、種類齊全等多種優(yōu)勢(shì)，具有很高的研究價(jià)值［13-17］。本研究選用徐長卿洗劑（出自《中醫(yī)皮膚病學(xué)簡編》，有調(diào)整）進(jìn)行體外抗菌、抗炎和豚鼠皮膚感染馬拉色菌的治療實(shí)驗(yàn)，研究其去屑止癢功效。

1 材料

1.1 藥品及試劑

藥材徐長卿、黃連、蔓荊子、五倍子由江蘇省中醫(yī)藥研究院提供，并由江蘇省中醫(yī)藥研究院蘇克雷博士鑒定。

沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液、脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2 菌株、細(xì)胞及動(dòng)物

馬拉色菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；RAW264.7細(xì)胞（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；雄性豚鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心開展，合格證號(hào)SYXK（蘇）2016-0019。

1.3 儀器型號(hào)

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BX41奧林巴斯顯微鏡（南京艾朗儀器有限公司）；ReadMax 1000F酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；SU8600掃描電鏡（日本日立公司）。

2 方法

2.1 徐長卿洗劑的制備

徐長卿洗劑由徐長卿30 g、黃連20 g、蔓荊子20 g、五倍子10 g組成。將藥材置于 10倍體積的蒸餾水中浸泡30 min，加熱到100℃，加熱 1 h 后除去藥渣，獲得濾液。再補(bǔ)充 8 倍體積的蒸餾水于同樣的條件下第二次加熱。將兩次獲得的濾液混合，得到濃度為0.056 g/mL的樣品并分裝保存于-80℃冰箱。

2.2 最低殺菌濃度測(cè)定

將接種馬拉色菌的含藥培養(yǎng)基置于32℃培養(yǎng)箱中孵育4 d，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照：取抑菌實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照管的生長菌接種于不含藥物的培養(yǎng)基；陰性對(duì)照：不加菌且不含藥物的培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后，在自然光線下通過肉眼判讀菌落生長情況。判定結(jié)果要求：陰性對(duì)照管清晰透明，無菌落生長，陽性對(duì)照管菌落生長良好，將每管生長情況與對(duì)照管相比較，以無培養(yǎng)物生長的培養(yǎng)基所使用的最低濃度作為最低殺菌濃度（Minimal fungicidal concentration， MFC）。

2.3 掃描電鏡觀察藥物處理的馬拉色菌

將藥物處理的馬拉色菌培養(yǎng)液在1 500 r/min條件下離心10 min，棄上清，置于pH 7.4的2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定24 h。隨后，用1%鋨酸固定2 h，再用丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋后制備超薄切片，用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛溶液進(jìn)行染色，最后使用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，添加10% FBS及1%雙抗（抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體），隨后在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃條件下培養(yǎng)。

2.5 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)tnf-α及il-6 的表達(dá)

參照吳陽陽等［18］的方法，取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 × 105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜；將各孔培養(yǎng)液棄去，分組處理，使用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，加入不同濃度（0.1、1、10 mg/mL）的樣品溶液，空白對(duì)照組加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組平行3孔，測(cè)定每組基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 ELISA方法檢測(cè)TNF-α及IL-6的表達(dá)

將藥物加入培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中共同孵育24 h后，取細(xì)胞上清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）；按照試劑盒說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品備用，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，酶標(biāo)包被反應(yīng)完成后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

2.7 豚鼠皮膚馬拉色菌感染動(dòng)物模型的建立

將馬拉色菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，第2次傳代培養(yǎng)于32℃恒溫孵育72 h后，用無菌接種環(huán)取適當(dāng)數(shù)量菌落于0.9%氯化鈉無菌玻璃試管中，反復(fù)吹吸，震蕩搖勻制成菌懸液，通過顯微鏡在血胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)將濃度調(diào)整為1 ×109CFU/mL。

用理發(fā)器將豚鼠背部毛發(fā)剃除約3 cm × 3 cm的區(qū)域，露出無毛區(qū)，用磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)清洗除去殘留脫毛膏，電吹風(fēng)機(jī)吹干豚鼠毛發(fā)，酒精消毒脫毛區(qū)域。使用粗砂紙?jiān)诿撁珔^(qū)反復(fù)均勻地摩擦至皮膚泛紅，然后取100 μL上述菌懸液均勻涂抹于脫毛區(qū)，每只豚鼠每日涂抹一次，連續(xù)抹菌7 d。

2.8 藥物外用于感染馬拉色菌的豚鼠皮膚

空白對(duì)照組：皮損處不用藥，觀察其自然轉(zhuǎn)歸情況；藥物治療組：皮損處外用中藥復(fù)方提取液；陽性對(duì)照組：皮損處外用酮康唑。造模成功后次日，每日涂藥2次，療程2周。

2.9 評(píng)價(jià)抑菌效果

于治療第0 d、7 d、14 d、21 d評(píng)估皮損積分（表1）［19］。以4%的水合氯醛作為麻醉劑，通過腹腔注射將實(shí)驗(yàn)各組豚鼠麻醉后，在背部感染區(qū)皮膚用75%酒精棉球消毒，每只豚鼠剪下直徑約1.5 cm圓形皮損1塊，剪碎，置于裝有2 mL 0.9%生理鹽水的玻璃勻漿器中，加入0.5%吐溫80，充分勻漿，使成混懸液，取300 μL混懸液均勻涂布于馬拉色菌固體培養(yǎng)基的圓形平皿上，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使其均勻分布于培養(yǎng)皿表面，在32℃條件下靜置培養(yǎng)3 d，觀察并記錄其菌落形成單位（CFU）。若每個(gè)培養(yǎng)皿中的CFU ＞ 1，則視其為陽性。真菌學(xué)轉(zhuǎn)陰率（%） = 每組培養(yǎng)陰性數(shù)/每組感染動(dòng)物總數(shù) × 100%。感染處皮膚經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（HE）染色后鏡下觀察并拍照記錄。豚鼠眼后靜脈叢中取血并分離血清。通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中干擾素γ（Interferon -γ，INF-γ）、白介素-4（Interleukin-4， IL-4）、白介素-2（Interleukin-2， IL-2）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）含量。

表1 豚鼠感染區(qū)皮損評(píng)分表Tab.1 Scoresheet of infected skin injury on guinea pigs

3 結(jié)果

3.1 徐長卿洗劑的體外抗菌活性

徐長卿洗劑的體外抗菌活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)馬拉色菌的MFC值為1.25 mg/mL。掃描電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)藥物處理后，馬拉色菌菌體破碎，無正常菌體形態(tài)，說明徐長卿洗劑具有明顯的抗菌效果（圖1）。

圖1 掃描電鏡觀察馬拉色菌形態(tài)Fig.1 The morphology of Malassezia observed by scanning electron microscope

3.2 徐長卿洗劑的體外抗炎作用

3.2.1 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)tnf-α及il-6的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)模型組LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子的變化情況，如圖2顯示，LPS處理后RAW264.7細(xì)胞中tnf-α及il-6表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（P＜ 0.001）。而相較于模型組，徐長卿洗劑能顯著降低tnf-α及il-6的表達(dá)量，并體現(xiàn)出劑量依賴性（P＜ 0.01），表明徐長卿洗劑具有抑制炎癥的作用。

圖2 徐長卿洗劑對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞tnf-α（A）及il-6（B）轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響Fig.2 The mRNA levels of tnf-α and il-6 in LPS-treated RAW264.7 cells detected by qRT-PCR after V.pycnostelma Lotion treatment

3.2.2 翻譯水平檢測(cè)TNF-α及IL-6 的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證TNF-α及IL-6的表達(dá)情況，通過ELISA方法檢測(cè)其含量。如圖3所示，LPS可以顯著提高RAW264.7細(xì)胞TNF-α及IL-6的表達(dá)，而徐長卿洗劑處理后可以顯著抑制模型組LPS引起的TNF-α、IL-6釋放，且抑制效果具有劑量依賴性，表明徐長卿洗劑具有明顯的抗炎作用，且ELISA在蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。

圖3 徐長卿洗劑對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α及IL-6翻譯水平表達(dá)的影響Fig.3 The protein levels of TNF-α and IL-6 in LPS-treated RAW264.7 cells detected by ELISA methods after V.pycnostelma Lotion treatment

3.3 徐長卿洗劑對(duì)豚鼠皮膚感染馬拉色菌的治療作用

3.3.1 徐長卿洗劑對(duì)豚鼠皮膚感染馬拉色菌的干預(yù)作用

根據(jù)表1方法，設(shè)立空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組以及給藥組，其中空白對(duì)照組不做處理，模型組為豚鼠皮膚感染馬拉色菌模型，陽性對(duì)照組以酮康唑進(jìn)行給藥，給藥組為10 mg/mL徐長卿洗劑進(jìn)行給藥，分別于用藥的第0、7、14、21 d對(duì)豚鼠模型皮損情況進(jìn)行評(píng)分。分別于用藥的第0、7、14、21 d對(duì)豚鼠模型皮損情況進(jìn)行評(píng)分。如圖4所示，連續(xù)觀察3周后發(fā)現(xiàn)，模型組皮損呈現(xiàn)較高水平且隨時(shí)間變化不明顯，而徐長卿洗劑組皮損評(píng)分顯著下降，與陽性對(duì)照組效果類似，表明徐長卿洗劑能明顯改善馬拉色菌感染的皮膚損傷。

圖4 馬拉色菌感染豚鼠皮損積分Fig.4 Scores of infected skin injury on guinea pigs

3.3.2 徐長卿洗劑對(duì)豚鼠皮膚馬拉色菌感染的抑菌效果

馬拉色菌感染豚鼠真菌學(xué)治愈率比較結(jié)果顯示（表2），徐長卿洗劑與陽性對(duì)照組轉(zhuǎn)陰率均為70%，模型組真菌學(xué)治愈率為0，二者與模型組之間具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05），兩種藥物之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。實(shí)驗(yàn)各組真菌培養(yǎng)菌落數(shù)分析結(jié)果（圖5）顯示，徐長卿洗劑組、陽性對(duì)照組與模型組菌落培養(yǎng)數(shù)具有顯著差異（P＜ 0.000 1），均值比較表現(xiàn)為：陽性對(duì)照組 ＜ 徐長卿洗劑組 ＜ 模型組。

圖5 馬拉色菌感染豚鼠真菌培養(yǎng)菌落數(shù)比較Fig.5 Comparasion of fungal CFU of Malassezia infected guinea pigs

表2 馬拉色菌感染豚鼠真菌學(xué)治愈率比較Tab.2 Comparasion of cure rates of Malassezia infected guinea pigs

3.3.3 HE染色觀察

如圖6所示，正常對(duì)照組皮膚完整、無損傷；而模型組表皮層被破壞，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤；陽性對(duì)照組及徐長卿洗劑治療組觀察到皮膚結(jié)構(gòu)完整、毛囊清晰，與正常組皮膚類似。

圖6 皮膚HE染色Fig.6 HE staining of skin

3.3.4 徐長卿洗劑對(duì)機(jī)體免疫的影響

Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其分泌的INF-γ能夠抵御細(xì)菌、真菌及病毒感染，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的另一種細(xì)胞因子IL-2具有刺激活化NK細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞的作用，在機(jī)體抗感染中具有重要地位［20］。Th2細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，其分泌的IL-4、IL-10等細(xì)胞因子能夠下調(diào)Th1細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞活性［21］。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體的Th1/Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被打破，機(jī)體則存在免疫失衡的風(fēng)險(xiǎn)［19］。

豚鼠血清IL-2、INF-γ研究結(jié)果表明（圖7 AB），模型組的IL-2和INF-γ表達(dá)水平較正常組顯著降低（P＜ 0.001）。與模型組相比，徐長卿洗劑組與陽性對(duì)照組中IL-2和INF-γ的表達(dá)水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。徐長卿洗劑組與陽性對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。圖7 C-D結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組豚鼠血清中IL-4及IL-10表達(dá)較正常組、徐長卿洗劑組、陽性對(duì)照組顯著升高（P＜ 0.05），徐長卿洗劑組與陽性對(duì)照組相較于模型組能顯著降低血清中IL-4及IL-10含量，表明兩種藥物均能有效干預(yù)豚鼠血清中Th2細(xì)胞主要效應(yīng)因子，改善免疫失衡狀態(tài)，兩組藥物之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖7 馬拉色菌感染豚鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量Fig.7 Contents of IL-2， IFN-γ， IL-4 and IL-10 in serum of Malassezia infected guinea pig

4 討論

馬拉色菌是人體和其它動(dòng)物皮膚表面的常見菌群，與脂溢性皮炎等皮膚疾病密切相關(guān)，病程的進(jìn)展給人們生活帶來了極大的困擾［22］。徐長卿洗劑出自《中醫(yī)皮膚病學(xué)簡編》，由徐長卿、黃連、蔓荊子及五倍子組成，主治牛皮癬及帶狀皰疹等皮膚疾病，可進(jìn)行內(nèi)服或外洗?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，徐長卿具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒及神經(jīng)保護(hù)等作用［23］；黃連、蔓荊子及五倍子亦具有廣泛的抗炎、抗菌等藥理作用［24-26］。以上研究為徐長卿洗劑治療馬拉色菌感染的脂溢性皮炎提供了依據(jù)。

徐長卿洗劑體外抗菌、抗炎和豚鼠皮膚感染馬拉色菌的治療試驗(yàn)結(jié)果表明，其具有顯著抑制馬拉色菌的效果，MFC為1.25 mg/mL，同時(shí)掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)徐長卿洗劑可以明顯破壞馬拉色菌菌體，進(jìn)一步證明了其抗菌效果。體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞抗炎實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，徐長卿洗劑處理組可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)升高的TNF-α、IL-6水平。豚鼠皮膚感染馬拉色菌模型的治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，徐長卿洗劑可以明顯恢復(fù)馬拉色菌誘導(dǎo)的皮膚損傷。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)徐長卿洗劑治療組可以觀察到完整的皮膚結(jié)構(gòu)，且毛囊清晰，與正常組皮膚類似。此外，研究結(jié)果表明，徐長卿洗劑可以恢復(fù)Th1細(xì)胞中介導(dǎo)細(xì)胞免疫的IL-2、INF-γ表達(dá)，表明其具有明顯的抵御細(xì)菌、真菌及病毒感染以及刺激活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞并促進(jìn)其增殖及分泌細(xì)胞因子的作用，增強(qiáng)了機(jī)體抗病毒及微生物感染的能力。同時(shí)，徐長卿洗劑能夠恢復(fù)Th2細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)體體液免疫中IL-4、IL-10表達(dá)，表明其具有明顯的促進(jìn)T細(xì)胞增殖、B細(xì)胞活化和抗炎作用，使Th1/Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)Th1/Th2漂移起到調(diào)節(jié)作用，這可能是徐長卿洗劑抑制炎癥及脫屑癥狀、清除真菌的潛在機(jī)制。本研究表明，徐長卿洗劑在去屑止癢功效方面具有極大的應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)臨床應(yīng)用指明了方向。