陳浩，李艷露，韓佳宏，宋佳琪，韓梅，蔡恩博，楊利民

（吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118）

防風為傘形科植物防風［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用［1-2］。產地主要分布在內蒙古、吉林、黑龍江、遼寧等省。

色原酮類化合物被認為是防風中最重要的活性成分［3］。研究表明，色原酮苷元的活性顯著優(yōu)于其原生苷，如升麻素的藥理活性強于升麻素苷［4-5］。但苷元類成分在防風中含量較低［6］，限制了該類成分與防風藥材的發(fā)展。過往研究的重點在于防風總色原酮的提取，本研究在其基礎上，加入并考察了酶解過程。以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為指標［7］，優(yōu)化防風總色原酮苷元提取工藝，并初步考察其抗炎活性，為防風研究提供參考。

1 實驗材料、儀器與試劑

1.1 實驗材料

防風采自吉林農業(yè)大學藥植園，經(jīng)吉林農業(yè)大學中藥材學院韓梅教授鑒定為3年生傘形科植物防風［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根。

小鼠單核巨噬細胞（RAW 264.7）購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 儀器

Agilent Model 631高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司），SC-3610型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），微量移液器（賽多利斯科學儀器有限公司），BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司），THZ-92A-A氣浴恒溫振蕩器（青島明博環(huán)保科技有限公司），RE-52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試劑

纖維二糖酶（寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司），升麻素標準品、升麻素苷標準品、5-O-甲基維斯阿米醇苷標準品及5-O-甲基維斯阿米醇標準品（上海源葉生物科技有限公司）；一氧化氮試劑盒（普洛麥格試劑有限公司），色譜級甲醇（中國上海費雪科技有限公司），分析級無水乙醇（北京化工廠）；二甲基亞砜、高糖培養(yǎng)基（索萊寶生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 HPLC測定防風色原酮苷元含量

2.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、5-O-甲基維斯阿米醇對照品適量，甲醇定容，配置成2 mg/mL儲備液，于4℃保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

將干燥的防風粉碎，過60目篩。恒重后，精確稱取樣品粉末約0.500 g，置于150 mL三角瓶中，加入一定量的纖維二糖酶，精密量取并加入30 mL水，稱重，一定溫度下恒溫氣浴震蕩反應一定時間，冷至室溫，補足重量，再精確量取并加入30 mL無水乙醇，稱重，靜置過夜，35℃超聲1 h，冷至室溫，補足重量，離心后取上清液備用。

2.1.3 參比供試品溶液的制備

按照“2.1.2”項下條件，不加入纖維二糖酶，制備參比供試品溶液。

2.1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇（B）-水（A），梯度洗脫程序為0 ～ 5 min，40% ～ 45% B；5 ～ 10 min，45% ～ 60% B；10 ～ 15 min，60% ～ 80% B；15 ～ 20 min，80% ～ 95% B；20 ～30 min，95% ～ 40% B；流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL［8］。

2.1.5 線性關系考察

分別精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液適量，置于1 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合對照品溶液A ～ G，濃度分別為：升麻素苷（25 ～0.390 6 μg/mL）、升麻素（25 ～ 0.390 6 μg/mL）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（50 ～ 0.781 3 μg/mL）、5-O-甲基維斯阿米醇（25 ～ 0.390 6 μg/mL）。分別進樣10 μL，按“2.1.4”項下中色譜條件進行HPLC分析，以進樣質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，并計算線性關系方程。

2.1.6 精密度實驗

精密吸取“2.1.5”項下混合對照品溶液B，按“2.1.4”項下色譜條件進樣檢測，連續(xù)進樣6次。計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD。

2.1.7 重復性實驗

取同一批供試品粉末，平行6份。按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件依次進樣檢測。計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的提取率及RSD。

2.1.8 穩(wěn)定性實驗

取同一批供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件在0、4、8、12、16、20、24 h分別進樣測定。計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD。

2.1.9 加樣回收率實驗

取已測定的防風樣品6份，每份0.250 g，精密稱定，分別精密加對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進行測定，分別計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的平均加樣回收率及RSD。

2.2 單因素試驗設計

按“2.1.2”項下條件，考察加酶量（質量分數(shù)：5%、10%、20%、50%、80%、100%）、酶解反應時間（10、20、30、60、90、120 min）、酶解反應溫度（20、30、40、50、60、70℃）對防風總色原酮苷元提取率的影響。以升麻素與5-O-甲基維斯阿米醇總提取量代表防風中總色原酮苷元含量，按下列公式計算提取率：

苷元提取率 = 供試品苷元濃度 × 定容體積 ×稀釋倍數(shù)/供試品取樣量

2.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以加酶量（X1）、反應時間（X2）、反應溫度（X3）為響應因子，以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為響應值（Y），通過Design Expert V 12.0軟件安排試驗。

2.4 最佳提取工藝的確定與驗證

為了驗證模型預測的準確性，修正最佳提取參數(shù)：加酶量90%、反應時間60 min、反應溫度56℃，應用最佳提取工藝進行提取，重復實驗3次，并計算得率。

2.5 防風總色原酮體外抗炎活性評價

2.5.1 細胞活力測定

按最佳提取參數(shù)，提取防風總色原酮苷元（升麻素含量：2.497 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇含量：1.991 mg/g）。參考文獻方法［9］，濃縮提取液，加水分散，通過D101型大孔樹脂柱，依次用水、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫流份，回收溶劑，冷凍干燥，即得防風色原酮苷元部位（樣品1）。

不加酶提取防風總色原酮苷元（升麻素含量：1.349 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇含量： 0.031 mg/g）。按上述方法，即得參比防風色原酮部位（樣品2）。

分別精密稱取上述樣品粉末適量，用DMSO溶解，加入完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基 ∶ 胎牛血清 ∶ 青霉素-鏈霉素 = 10 ∶ 1 ∶ 0.1）稀釋配制成0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的終濃度不超過0.1%［9］。取對數(shù)生長期的小鼠巨噬細胞RAW 264.7接種到96孔板上，每孔1.5 × 104個細胞，設置6個復孔，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，替換為含不同濃度樣品的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)CCK-8制造商的方案，進行細胞活力測定［10-11］。

2.5.2 一氧化氮含量測定（NO）

分別精密稱取樣品粉末適量，用DMSO溶解，加入完全培養(yǎng)基稀釋配制成5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的終濃度不超過0.1%。取對數(shù)生長期的小鼠巨噬細胞RAW 264.7接種到96孔板上，每孔1.5 × 104個細胞，培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細胞狀態(tài)正常；設置空白組、LPS組、給藥組，每組6個復孔，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，給藥組每孔加入不同濃度受試藥物，同時加入1 μg LPS。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，離心取上清，分組處理，Griess法檢測，根據(jù)說明書制得的標曲計算得到不同組中產生NO的量［12］。并計算二者NO抑制率IC5（0Half maximal inhibitory concentration）。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26統(tǒng)計學軟件分析，GraphPad Prism 9.0 作圖，數(shù)據(jù)資料采用均值±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 HPLC方法學考察

3.1.1 線性關系考察結果

按“2.1.4”項下中色譜條件進行HPLC分析，以進樣質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，并計算線性關系方程，見表1；混合對照品溶液（A）、參比供試品溶液（B：未加酶提取樣品）及供試品溶液（C：最佳工藝下提取樣品）中升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的高效液相色譜圖，見圖1。

圖1 標準品和樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference and sample

表1 回歸方程和相關系數(shù)Tab.1 Regression equation and correlation coefficient

3.1.2 精密度實驗結果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為0.83%、1.56%、1.34%、1.66%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復性實驗結果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇提取率的RSD分別為1.86%、1.91%、1.97%、1.92%，表明方法重復性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性實驗結果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.44%、1.93%、0.99%、1.48%，表明方法穩(wěn)定性良好。

3.1.5 加樣回收率實驗結果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的平均加樣回收率分別為100.04%、100.19%、102.26%、98.70%，RSD分別為2.51%、2.50%、1.65%、2.26%。

3.2 單因素試驗結果

由圖2可知，加酶量從0 ～ 50%時，提取率顯著增加，加酶量從50% ～ 80%時，提取率增長速率逐漸緩慢，加酶量80%時提取率最大，為4.504 mg/g，繼續(xù)增加酶用量提取率逐漸降低，但變化不大。因此，最適加酶量在50% ～ 100%范圍內。由圖3可知，酶解反應時間從0 ～ 60 min時，提取率顯著升高，在60 min時達到最大，為4.393 mg/g，60 min后提取率變化不大，時間過長不適合工業(yè)化生產。因此，最適反應時間在30 ～ 90 min。由圖4可知，酶解反應溫度在0 ～ 50℃時，提取率顯著升高，反應溫度在50℃時，提取率達到最大，為4.532 mg/g，50℃之后，提取率隨溫度變化不大。因此，最適酶解反應溫度在40 ～ 60℃。

圖2 不同加酶量對總色原酮苷元提取率的影響Fig.2 Effects of different enzyme dosage on extraction rate of total chromogen aglycones

圖3 不同反應時間對總色原酮苷元提取率的影響Fig.3 Effects of different reaction times on extraction rate of total chromogen aglycones

圖4 不同反應溫度對總色原酮苷元提取率的影響Fig.4 Effects of different reaction temperatures on extraction rate of total chromogen aglycones

3.3 響應面試驗結果

3.3.1 Central-Composite試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以加酶量（X1）、反應時間（X2）、反應溫度（X3）為響應因子，以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為響應值（Y），通過Design Expert V 12.0軟件進行設計，各個因素的水平據(jù)單因素的結果而定，根據(jù)星點設計的原則，每個因素設5組水平，通過不同物理參數(shù)來篩選各因素最優(yōu)組合條件。試驗因素與水平見表2。響應面實驗結果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 Central Composite響應面試驗設計與結果Tab.3 Central Composite response surface test design and results

3.3.2 模型建立與方差分析

將表3所得數(shù)據(jù)通過Design Expert 12.0軟件進行多元擬合，以防風總色原酮苷元提取率Y為響應值、以加酶量X1、反應溫度X2、反應時間X3為自變量，建立多元二次方程：

由表4展示的方差結果進行進一步分析，實驗過程中的各個因素與響應目標值之間存在著復雜的交互影響關系，可以看出一次項因子X1，X2、X3影響顯著，X22、X3

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

2影響顯著，交互項中X2X3交互影響顯著，而其它項不顯著。通過P值比較發(fā)現(xiàn)單因素對模型的影響順序為反應溫度=反應時間＞加酶量。根據(jù)模型的確定系數(shù)R2= 0.9658可知，模型的可靠性較好。由該模型的確定系數(shù)P= 0.423可以看出，該模型的失擬檢驗是極其不顯著的，實驗結果說明了與之相對應的多項式進行擬合推測出來的理論數(shù)值之間有極強的相關性。該模型預測在參數(shù)允許的范圍內是可靠和可重復的。從實驗數(shù)據(jù)來看，該模型適用于防風總色原酮苷元的提取結果的分析和預測。

3.3.3 響應面分析

以加酶量、酶解反應時間和反應溫度為自變量，構建響應面圖，考察它們對防風總色原酮苷元提取率的綜合影響，得出最佳提取條件。在二項式擬合模型的基礎上，采用Design Expert V12.0軟件做出相應的曲面圖，結果見圖5。根據(jù)已建立的數(shù)學模型和響應曲面形狀，分析加酶量、反應時間、反應溫度對防風中總色原酮苷元提取率的影響，從圖中可以直觀的看出各因素對響應值的影響，反應溫度（X3） = 反應時間（X2） ＞ 加酶量（X1）。通過對擬合的線性方程進行更深層次的分析，最終通過軟件分析給出最佳提取參數(shù)，即加酶量89.87%，反應時間59.97 min，反應溫度55.95℃，在最佳提取條件下，理論應得到升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的總提取率為4.58 mg/g。

圖5 各因素交互作用對防風總色原酮苷元提取率的效應面圖Fig.5 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on total chromone aglycone from Saposhnikoviae Radix

3.3.4 試驗驗證

為了驗證模型預測的準確性，修正最佳提取參數(shù)：加酶量90%、反應時間60 min、反應溫度56℃，應用最佳提取條件進行重復實驗3次，得到升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的平均總提取率為4.49 mg/g（RSD = 0.9%，n = 3），與理論值相差2%，未加酶的平均提取率為1.38 mg/g，提高了3倍以上。實驗的結果與軟件提供的預測值基本上是相同的，說明實驗所用的模型對防風總色原酮苷元的提取是適用的，高效的。

3.4 體外抗炎活性評價

3.4.1 細胞活力

如圖6所示，RAW 264.7細胞給藥處理24 h后，存活率均未受到抑制，說明防風總色原酮苷及苷元（0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L）對RAW 264.7細胞都不具有毒性。

圖6 樣品1（a）， 2（b）對細胞存活率的影響Fig.6 Effects of sample 1 （a）， 2 （b） on cell viability

3.4.2 一氧化氮含量（NO）檢測

由圖7可知，與空白組比較，LPS組NO水平顯著增加（P＜ 0.001），提示造模成功；各給藥組與LPS組比較，NO含量水平均差異顯著（P＜ 0.001）；給藥組間，樣品1抑制NO分泌效果優(yōu)于樣品2， 25 mg/L劑量下樣品1即與100 mg/L樣品2效果相當。表明防風總色原酮苷元對LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放NO具有很好的抑制作用，并顯著優(yōu)于參比提取物。NO抑制率IC50分別為2.30 ± 0.34，3.32 ±0.47 mg/L。

圖7 樣品1（a）， 2（b）對RAW 264.7細胞上清中NO含量的影響Fig.7 Effects of sample 1（a）， 2（b） on NO content in supernatant of RAW 264.7 cells

5 討論與結論

本研究在酶解基礎上，采用超聲輔助乙醇法提取防風干燥根中的色原酮苷元，提取率有較大提高，苷元轉化徹底。在單因素實驗基礎上，運用響應面法對苷元提取條件進行優(yōu)化，確定防風總色原酮苷元的最佳提取工藝參數(shù)為：加酶量89.87%，酶解時間59.97 min，酶解溫度55.95℃。方差結果顯示，影響提取率的單因素依次為：反應溫度 = 反應時間 ＞ 加酶量。與傳統(tǒng)提取方法相比，該工藝操作容易，提取效率高，穩(wěn)定性好。纖維二糖酶安全環(huán)保，成本低廉。對總色原酮苷元提取物進行體外抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細胞炎癥模型中，工藝優(yōu)化前后提取物的濃度大于25 mg/L時，均對上清液中一氧化氮（NO）分泌具有顯著抑制作用，而最佳提取條件下總色原酮苷元提取物25 mg/L時與優(yōu)化前提取物100 mg/L時作用相近，NO含量接近正常水平，具有良好的抗炎活性。為防風創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供參考，為防風藥材的綜合開發(fā)利用提供了新的思路。