肖琪，馬媛，陳孝強*，童黃錦**

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028）

肝纖維化是由各種因素引起的可持續(xù)慢性肝損傷（如病毒性、自身免疫性、藥物誘導性、膽汁淤積性和代謝性疾病）［1］。其特征是細胞外基質（Extracellular matrix， ECM）蛋白的過度積累，導致纖維瘢痕組織的形成和肝臟結構的扭曲［2］。肝星狀細胞（Hepatic stellate cells， HSCs）的激活能調節(jié)ECM的產生和分泌，被認為是影響肝纖維化進程的關鍵因素［3］。隨著肝纖維化的進展，可能最終發(fā)展為肝硬化，其特征是肝實質被瘢痕組織取代，并增加了患肝癌的風險。肝纖維化和肝硬化預后不佳，死亡率高，全球每年有超過一百萬人死于這些疾病。幸運的是，適當?shù)母深A已顯示出逆轉肝纖維化的潛力［4］。然而，目前臨床上缺乏經證實有效的治療肝纖維化的藥物。因此，迫切需要探索更有效的靶點和藥物，以控制肝纖維化的進展并減輕其危害。

藥材梔子（Gardeniae Fructus）為茜草科（Rubiaceae）梔子屬（GardeniaJ. Ellis）植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實，于十月中下旬采收，曬干或烘干。梔子始載于《神農本草經》，主產于江西、浙江、湖南等地，是衛(wèi)生部發(fā)布的首批食藥同源中藥之一，具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒等功效。在梔子中已分離的化合物主要有環(huán)烯醚萜及其苷類、有機酸及其衍生物類、黃酮類、單萜類等?，F(xiàn)代藥理學研究證實，梔子具有顯著的抗炎［5］、抗氧化［6］、保肝［7］、降脂［8］等作用，常與茵陳、金銀花等配伍治療肝纖維化以及肝內膽汁淤積等癥。

目前梔子對肝纖維化治療的作用機制尚未見深入研究，本研究通過超高壓液相色譜-飛行時間質譜儀（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）對梔子藥材的化學成分進行辨識，利用網絡藥理學和分子對接技術預測梔子抗肝纖維化的效應物質及作用機制，為其臨床應用及開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-30A型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Triple TOF 5600串聯(lián)飛行時間質譜儀，配有電噴霧離子源ESI（美國AB SCIEX公司）；Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司）；ME204E型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BY-R20型醫(yī)用離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；MS-100恒溫混勻儀（MS-100恒溫混勻儀）；KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

標準品槲皮素（批號：100081-200907）、東莨菪內酯（批號：110768-200504）購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號：Y24J7K16726）購自上海源葉生物科技有限公司；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷（批號：J-075-160906）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（批號：S-060-160815）、棕櫚酸（批號：Z-032-170426）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；咖啡酸（批號：MUST-12042403）、京尼平（批號：MUST-11122811）、梔子苷（批號：MUST-17020401）、蘆丁（批號：MUST-11040302）、齊墩果酸（批號：MUST-11090502）購自成都曼斯特生物科技有限公司；京尼平苷酸（批號：CHB151101）、新綠原酸（批號：CHB160419）、西紅花苷（MUST-22092106）、亞油酸（批號：CHB160902）、硬脂酸（批號：CHB170216）購自成都克洛瑪生物科技有限公司。以上標準品純度均大于98%。

甲醇、乙腈（質譜級，湖北弗頓科學技術有限公司）；甲酸（色譜級，美國 ROE Scientific INC.）；實驗用水為超純水。

2 方法

2.1 梔子藥材的收集

梔子藥材（10批）來源于主產區(qū)江西、浙江等地，經江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院陳孝強副主任中藥師鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實。所有樣品經檢驗符合《中國藥典》2020版一部梔子項下規(guī)定。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

梔子藥材粉碎，過三號篩。精密稱取粉末0.1 g，精密加入10 mL甲醇，超聲提取30 min。提取液高速離心10 min（轉速12 000 r/min），取上清液，進樣分析前過0.22 μm微孔濾膜。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取16種標準品（槲皮素、東莨菪內酯、綠原酸、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、棕櫚酸、咖啡酸、京尼平、梔子苷、蘆丁、齊墩果酸、京尼平苷酸、新綠原酸、西紅花苷、亞油酸、硬脂酸）適量，用甲醇溶解，配制成含各標準品約2 μg/mL混合對照品溶液。

2.3 UPLC-Q/TOF-MS分析

2.3.1 色譜條件

儀器檢測條件參考已報道的文獻［9］。采用Agilent Extend C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm）。流動相A和B分別為0.05%甲酸水溶液和乙腈，流速0.3 mL/min，梯度洗脫設置為：0 ～ 10 min，5% ～20% B；10 ～ 20 min，20% ～ 50% B；20 ～ 25 min，50%～ 80% B；25 ～ 30 min，80% ～ 100% B；30 ～ 32 min，100% B。柱溫為35℃，進樣量為2 μL。

2.3.2 質譜條件

離子源為ESI，采集模式為正負離子模式。儀器參數(shù)設置如下：離子化電壓+5 500 V / -4 500 V，離子化溫度550℃，去簇電壓 ± 60 V，補償電壓 ± 10 V。一級和二級的掃描范圍分別為m/z100 ～ 1 500和50 ～ 1 000。質譜儀每3 h進行一次自動校準。

2.4 梔子中化學成分的鑒定與活性成分的篩選

利用MS-DIAL軟件對質譜原始數(shù)據(jù)進行分析，同時根據(jù)標準品提供的保留時間、二級碎片信息，將匹配度大于80%且保留時間一致的結果作為梔子藥材中鑒定得到的化合物。

根據(jù)TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）提供的藥物ADME參數(shù)對上述化合物作進一步篩選，這些參數(shù)包括口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）、藥物相似性（Drug-likeness， DL）和人高加索結腸腺癌滲透性（Human caucasian colon adenocarcinoma， Caco-2）。OB、DL和Caco-2的閾值分別設置為20%、0.1和-5.15［10］。此外，根據(jù)文獻報道將梔子中具有抗肝纖維化活性的化合物納入范圍。

2.5 梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的篩選

通過化合物數(shù)據(jù)庫Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取梔子中活性成分的結構與SMILES式，并將其導入藥物靶點數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和Drugbank（https：//www.drugbank.com/），搜索成分靶點，設置物種為“Homo sapiens”，置信度 ＞ 0，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）將靶點名稱校準為官方名稱，這些靶點經合并去重后作為梔子活性成分的靶點。

同時，通過人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https：//omim.org/）進行檢索，設置檢索詞“hepatic fibrosis”，設置物種為“Homo sapiens”，獲得與肝纖維化相關的疾病靶點。利用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對梔子中活性成分的靶點與肝纖維化的靶點取交集，得到梔子抗肝纖維化的潛在作用靶點。

2.6 梔子抗肝纖維化的“活性成分-潛在靶點”網絡構建與分析

為構建“活性成分-潛在靶點”網絡圖，將梔子抗肝纖維化的活性成分及其與潛在靶點的對應關系導入生物信息學分析軟件Cytoscape 3.8.2（https：//cytoscape.org/）。在這個網絡中，化合物和靶點分別由節(jié)點代表，并用邊表示它們之間的相互作用。采用Cyto NCA對網絡進行拓撲學分析，通過參考拓撲學參數(shù)對比化合物在網絡中的重要性計算節(jié)點的度值。

2.7 梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的蛋白相互作用網絡構建與分析

將梔子抗肝纖維化的潛在靶點上傳至STRING 12.0數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/），設定物種為“Homo sapiens”，置信度閾值為 ≥ 0.9。利用生成的PPI圖，以度值為依據(jù)篩選出核心靶點。

2.8 梔子抗肝纖維化的GO功能富集和KEGG通路富集分析

將梔子抗肝纖維化的潛在靶點導入生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫David（https：//david-d.ncifcrf.gov/）分別進行基因功能（Gene ontology， GO）富集分析和京都基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信號通路富集。物種選擇“Home sapiens”，設定閾值p＜ 0.05，按基因命中個數(shù)簡單排序。篩選出前10條與肝纖維相關的生物學條目和前20條信號通路，并通過OmicStudio云平臺（https：//www.omicstudio.cn/tool）進行可視化處理。

2.9 分子對接的驗證

利用ChemDraw 19.0（美國PerkinElmer公司）將梔子抗肝纖維化的核心成分轉化為3D結構，并從RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的相應3D結構。通過PyMOL 2.3.4軟件（美國Schro?dinger公司）對核心靶蛋白進行初步處理，包括去除溶劑分子等。隨后，使用AutoDock 4.2分子對接軟件（http：//autodock.scripps.edu/）對核心靶蛋白和活性化合物進行加氫處理和加電荷處理，并將它們保存為“pdbqt”格式的文件。最后，使用Vina插件完成核心成分和靶點的對接。

3 結果

3.1 梔子中活性成分的篩選

通過譜庫檢索、標準品和文獻信息［9］比對，共鑒定出梔子藥材中72個化合物。根據(jù)OB ≥ 20%、DL ≥ 0.1和Caco-2 ≥ -5.15的條件篩選出18個活性成分。此外，通過文獻調研發(fā)現(xiàn)梔子苷、蘆丁、西紅花苷等9個化合物雖未滿足篩選條件，但具有抗肝纖維化的活性，如梔子苷能通過減輕氧化應激和炎癥反應，抑制細胞凋亡，調節(jié)整體代謝，從而減輕肝纖維化［11］。蘆丁能通過抑制肝星狀細胞激活、促進其凋亡從而治療肝纖維化［12］。西紅花苷通過lnc-LFAR1/MTF-1/GDNF途徑抑制小鼠肝星狀細胞的激活［13］。最終得到27個活性成分，詳細信息見表1。

表1 梔子中活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active components in Gardeniae Fructus

3.2 梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的獲取

通過Swiss Target Prediction和DrugBank共篩選出445個活性成分靶點。經GeneCards和OMIM收集到6 454個肝纖維化相關靶點。取交集后獲得梔子抗肝纖維化的潛在靶點331個。

3.3 梔子抗肝纖維化的“活性成分-潛在靶點”網絡構建與分析

構建的“活性成分-潛在靶點”網絡見圖1。該網絡由355個節(jié)點（24個成分和331個靶點）、946條邊組成，度值大于兩倍中位數(shù)的成分有8個，這些成分為梔子抗肝纖維化的核心成分。其中槲皮素、亞油酸、γ-亞麻酸、艾黃素、9-反式棕櫚烯酸度值排名前5，分別為99、85、82、80、80。

圖1 梔子抗肝纖維化的“活性成分-潛在靶點”網絡Fig. 1 “Active ingredients potential targets” network of Gardeniae Fructus against hepatic fibrosis

3.4 梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的蛋白相互作用網絡構建與分析

經STRING獲取梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的相互作用關系，見圖2。該網絡包含331個節(jié)點，971條邊，節(jié)點平均度值為5.87，度值大于兩倍中位數(shù)的靶點有77個，這些靶點為梔子抗肝纖維化的核心靶點。其中酪氨酸蛋白激酶SRC（Tyrosine-protein kinase SRC， SRC）、絲裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3， MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、信號轉導與活化轉錄因子3（Signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（Heat shock protein 90 alpha family class A member 1， HSP90AA1）度值排名前5，分別為55、50、48、44、44。

圖2 梔子抗肝纖維化潛在靶點的PPI網絡Fig. 2 PPI network of potential targets of Gardeniae Fructus against hepatic fibrosis

3.5 梔子抗肝纖維化的GO功能富集和KEGG通路富集分析

GO富集得到生物過程（Biological process， BP）相關條目699條，主要涉及信號轉導、蛋白質磷酸化、細胞增殖的正調控等。細胞組分（Molecular function， MF）相關條目173條，主要涉及蛋白質結合、ATP結合、鋅離子結合等。分子功能（Cellular component， CC）相關條目95條，主要涉及質膜、胞漿、細胞質等。各個項目排名前10的條目見圖3。

圖3 GO功能富集分析（前10）Fig. 3 GO functional enrichment analysis （top 10）

KEGG富集結果顯示，梔子抗肝纖維化主要與以下通路相關：代謝通路、癌癥通路、神經活性配體受體相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路、脂質與動脈粥樣硬化等。排名前20的信號通路見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析（前20）Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis （top 20）

3.6 分子對接的驗證

梔子抗肝纖維化排名前5的核心成分與靶點對接結果見圖5A，結合能均小于0，說明這些成分與靶點能自發(fā)結合。槲皮素、艾黃素與大多數(shù)靶點結合能較低，結合活性較強，該結果與網絡藥理學篩選的結果一致，進一步驗證了網絡藥理學預測靶點的可靠性。分子對接情況見圖5B。

圖5 化合物與靶點分子對接結果Fig. 5 Docking results of compound and target

4 討論

現(xiàn)代藥理學研究表明，梔子具有抗炎、抗氧化、保肝、利膽等藥理作用。梔子抗肝纖維化的功效物質及作用機制尚未見深入研究。本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技術檢測識別出梔子中化合物74個，基于網絡藥理學的方法篩選出梔子抗肝纖維化的活性成分27個，潛在作用靶點331個，其中核心成分8個，核心靶點77個，涉及生物功能967條和信號通路164條，表明梔子抗肝纖維化具有多成分、多靶點的的特點。

梔子抗肝纖維化的“活性成分-潛在靶點”網絡分析結果顯示，在27個活性成分中，槲皮素、亞油酸、γ-亞麻酸、艾黃素、9-反式棕櫚烯酸、甘草次酸、鄰苯二甲酸二丁酯、齊墩果酸的度值大于兩倍中位數(shù)，對整個網絡具有重要的貢獻意義［14］，推測這8個成分是梔子抗肝纖維化的主要功效物質。實驗研究顯示，槲皮素具有較強的抗炎和抗氧化能力［15］，對四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠有抑制和肝保護作用。它能通過上調白細胞介素-10（Interleukin-10， IL-10）和血紅素氧化酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）的表達從而抑制NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體激活和炎癥因子分泌，進而發(fā)揮對急性酒精性肝損傷的保護作用［16］。亞油酸具有很強的抗炎活性［17］，且能通過腸道菌群抑制肝星狀細胞中的TGF-β信號傳導改善肝纖維化［18］。γ-亞麻酸雖不能直接干預肝纖維化，但其可通過減少脂肪沉積而改善非酒精性脂肪肝，這一作用可能是通過調控LKB1-AMPK-mTOR通路發(fā)揮的［19］。艾黃素是一種天然黃酮，具有具有抗氧化、抗炎活性，動物實驗表明其對四氯化碳誘導的肝纖維化有保護作用［20］。甘草次酸可通過靶向活化HSC中的PRDX1/2從而引起ROS介導的細胞凋亡以改善肝纖維化［21］。另外，肝細胞鐵死亡會誘發(fā)肝纖維化，有報道發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能通過調節(jié)ROS/鐵過載抑制氯化汞誘導的肝鐵死亡［22］。關于梔子中其他成分抗肝纖維化的研究報道較少，限制了對其功效物質的進一步驗證。

通過分析梔子抗肝纖維化潛在作用靶點的蛋白相互作用發(fā)現(xiàn)，度值排名前5位的靶點有SRC、MAPK3、MAPK1、STAT3、HSP90AA1。研究結果顯示，在硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化模型和肝硬化患者中，SRC表達上調。抑制SRC可以降低原代肝星狀上皮細胞α-平滑肌肌動蛋白的表達，并且還能抑制轉化生長因子β（Transforming growth factor β， TGF β）誘導的肝細胞結締組織生長因子的表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，SRC在肝臟纖維化中起著重要的作用，抑制SRC過度表達可在一定程度上阻止肝纖維化進程［23］。MAPK1和MAPK3是MAPK信號通路的成員。在肝組織受損時，MAPK信號通路會被激活。外來調節(jié)激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）通路在干預肝纖維化中可能發(fā)揮作用，其中p-Erk1/2的下調可能與抑制HSC增殖以及相關基因表達有關［24］。與此同時，激活JNK和p38信號通路會促進HSC的增殖［25］。綜上所述，MAPK在肝纖維化進程中發(fā)揮重要作用。STAT3通過參與肝星狀細胞的增殖和活化，進而參與肝纖維化的發(fā)展。在肝細胞中，適度表達的STAT3有助于促進肝細胞再生和肝臟修復。然而，過度表達的STAT3會導致肝星狀細胞的活化和過度增殖，從而引發(fā)肝纖維化乃至肝臟癌變的可能［26］。作為HSP90的一個亞型，HSP90AA1的主要功能是促進目標蛋白的成熟和結構維護。它參與ATP酶活性有關的功能循環(huán)，以維持蛋白的正常功能發(fā)揮。此外，HSP90AA1還能通過調節(jié)細胞周期促進細胞增殖，并促進細胞遷移［27］。由此可見，上述關鍵靶點均與肝纖維化相關。

GO功能富集結果表明，梔子主要調節(jié)與肝纖維化發(fā)病機制密切相關的信號轉導、蛋白質磷酸化、細胞增殖正調控、細胞凋亡過程負調控、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、炎癥反應等過程。KEGG富集結果表明，梔子通過多種途徑在肝纖維化的治療中發(fā)揮作用。值得關注的是，單個成分可能調控多個途徑發(fā)揮作用，如核心成分中的槲皮素可能作用于代謝通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路等。而同一途徑可能受到多個成分調控，如PI3K-Akt信號通路受到8個核心成分共同調控。已有報道證明，PI3K-Akt信號通路［28］、脂質和動脈粥樣硬化［29］、Rap1信號通路［30］、MAPK信號通路［31］、鈣信號通路［32］、Ras信號通路［33］與肝纖維化治療密切相關，進一步驗證了網絡預測的準確性。

分子對接結果顯示，排名前5的核心成分與靶點對接情況較好，能自由結合。從成分角度分析，槲皮素、艾黃素與大部分結合能較低；從靶點角度分析，MAPK3、MAPK1與大多數(shù)成分對接有較低的結合能。該結果提示梔子可能通過槲皮素、艾黃素等化合物作用于MAPK3等靶點發(fā)揮抗肝纖維化的功效。

5 結論

本研究利用UPLC-Q/TOF-MS、網絡藥理學和分子對接技術，初步闡明了梔子多成分、多靶點、多通路協(xié)同抗肝纖維化的作用機制。梔子可能通過槲皮素、亞油酸等活性成分作用于靶點，如MAPK3和MAPK1參與調控PI3K-Akt信號通路、脂質和動脈粥樣硬化以及MAPK信號通路等通路。這種調控產生了抗炎效應、抑制肝星狀細胞活化并促進其凋亡等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。這項研究為開發(fā)梔子治療肝纖維化的新藥提供了參考依據(jù)。此外，因為該研究依靠數(shù)據(jù)庫分析較多，存在一定的局限性，在后續(xù)的研究中將結合體內外實驗進行進一步的驗證。