梁思琪，祁小艷，肖強(qiáng)

（湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000）

潤楠［Machilus nanmu（Oliv.） Hemsley］為樟科（Lauraceae）潤楠屬植物，廣泛分布于亞洲東南部和東部的熱帶、亞熱帶地區(qū)，資源十分豐富。潤楠植物中富含多種活性代謝產(chǎn)物［1-2］，在皮膚炎癥、足腫、腹瀉等醫(yī)療方面頗有效果。湖北民族大學(xué)植物園內(nèi)種植許多潤楠，潤楠的管理過程中有大量的葉片缺乏利用，應(yīng)對其進(jìn)行開發(fā)，提高其綜合效益。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，潤楠葉片中多糖含量較高，而植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)［3-4］、抗腫瘤［5-6］、抗衰老［7-9］、降血糖［10］以及抗凝血［11］等功效。目前關(guān)于潤楠葉片多糖的研究還未見報(bào)道，其結(jié)構(gòu)如何、在抗氧化、抗腫瘤活性方面是否同其它植物多糖一樣發(fā)揮作用？為此，本研究以潤楠葉片為材料，采用超聲輔助復(fù)合酶法提取多糖，以得率為指標(biāo)，探究pH、超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間對多糖提取率的影響；并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［12］確定最佳工藝參數(shù)。進(jìn)一步，利用紅外光譜法分析其官能團(tuán)，掃描電鏡觀察其表觀形貌，液相色譜法測定其單糖組成［13-15］；最后采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考查潤楠葉片多糖的生物活性［16-17］。通過以上研究，探究潤楠葉片多糖的功能并為其綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

潤楠葉片，采摘于湖北民族大學(xué)植物園，經(jīng)湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定；健康、無病蟲害的葉片用清水沖洗干凈，50℃熱泵式烘箱中烘干、粉碎后過40目篩，得潤楠葉片粉末。

果膠酶（酶活力 ≥ 500 000 U/g，福州飛凈生物科技有限公司）；纖維素酶（酶活力 ≥ 400 000 U/g，福州飛凈生物科技有限公司）；無水乙醇（武漢市中天化工有限責(zé)任公司）；D-無水葡萄糖（生工生物工程股份有限公司）；苯酚（阿拉丁試劑有限公司）；濃硫酸（武漢市中天化工有限責(zé)任公司）；檸檬酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸氫二鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；溴化鉀（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮（PMP，阿拉?。灰译妫ㄉV純，DIKMA）；乙酸銨（阿拉丁）；D-葡萄糖，D-甘露糖，L-鼠李糖，D-半乳糖，D-阿拉伯糖，L-巖藻糖，D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸均為標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH（阿拉?。?；焦性沒食子酸（天津市博迪化工有限公司）；Tris-HCl（阿拉?。籐-抗壞血酸（Vc，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HCCLM（人肝癌細(xì)胞）；A549（人肺癌細(xì)胞）；胎牛血清（E510002-0100生工生物）；RPMI培養(yǎng)基（E600028-0500生工生物）；PBS（AG29714106 cytiva公司）；DMEM培養(yǎng)基（AG29714106 cytiva公司）；1640培養(yǎng)基（AG29714106 cytiva公司）；青霉素鏈霉素溶液（源葉生物）；CCK-8試劑盒（100T，大連美侖公司）。

1.2 儀器設(shè)備

流水式高速中藥粉碎機(jī)（LG-20，瑞安市百信制藥機(jī)械有限公司）；循環(huán)式水式多用真空泵（SHBIII，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；高速大容量冷凍離心機(jī)（H2050R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（950E，寧波新芝生物科技股份有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電子天平（ALB-124，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）； Nicolet iS50 FT-IR紅外光譜儀；JSM-6510LV掃描電鏡；HPLC高效液相色譜儀（Thermo公司）；潔凈工作臺（JJ-CJ-1FD，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（Olympus）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖的提取

稱取一定質(zhì)量潤楠葉片粉末于燒杯中，加入2%復(fù)合酶（纖維素酶 ∶ 果膠酶 = 1 ∶ 1），按照料液比1 ∶ 20（g/mL）添加不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，置于已設(shè)定好溫度、時(shí)間、功率的超聲細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行提取，超聲結(jié)束后，立刻抽濾，向收集的濾液中加入無水乙醇使其達(dá)80%濃度（v/v），于4℃冰箱中醇沉12 h，醇沉結(jié)束后于8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，除去上清液，向沉淀加入蒸餾水復(fù)溶，冷凍干燥后得潤楠葉片多糖粉末。取一定質(zhì)量的潤楠葉片多糖粉末，參照覃錢等［18］方法用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量。

多糖得率=C×V×N/m×10-6×100%

式中C為待測液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

2.2 單因素試驗(yàn)

以0.5 g潤楠葉片粉末為提取對象，對體系pH、超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，討論提取因素對潤楠葉片多糖得率的影響。體系pH為3、4、5*、6、7，超聲溫度為30、40*、50、60、70℃，超聲功率為100、150、200*、250、300 W，超聲時(shí)間為5、10*、15、20、25 min（*代表在做某一單因素實(shí)驗(yàn)中，其它因素的取值）。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以體系pH（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）和超聲時(shí)間（D）為自變量，以多糖得率（R）為因變量。確定潤楠葉片多糖提取的最佳參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor level table of orthogonal experiment

2.4 結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 紅外光譜

潤楠葉片多糖粉末與溴化鉀按照1 ∶ 100（mg）研磨混勻，利用傅里葉變換紅外光譜儀，在400 ～4 000 cm-1波長下進(jìn)行掃描分析。

2.4.2 掃描電鏡

取微量潤楠葉片多糖粉末黏在帶有導(dǎo)電膠帶的處理片上，經(jīng)噴金處理后，利用掃描電鏡掃描分析，觀察潤楠葉片多糖的微觀形貌。

2.4.3 單糖組成

樣品水解及樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的衍生參考林曉燕［19］方法。

色譜條件：色譜柱（Diamonsil Plus，5 μm，C18-B，250 mm × 4.6 mm）；流動相A：乙腈，流動相B：50 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序：0 ～ 60 min，85% ～ 75% A，15% ～ 25% B，在線脫氣，流速1.0 mL/min，柱箱溫度30℃，檢測波長250 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 DPPH自由基清除效果的測定

參照胡玲華等［20］方法略作修改：將潤楠葉片多糖粉末配制成不同濃度溶液，各取2 mL置于試管中，加入0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2 mL，搖勻，室溫條件下置于黑暗處放置30 min。在波長517 nm處分別測定吸光度Ai，另分別測定參比溶液吸光度Ab和空白溶液吸光度A0。以同濃度的Vc溶液做陽性對照，清除率計(jì)算公式為：

2.5.2 羥基自由基清除效果的測定

參照胡玲華等［20］方法略作修改：將潤楠葉片多糖粉末配制成不同濃度溶液，各取1 mL置于試管中，然后加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL，振蕩均勻，最后加入6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，搖勻，靜置37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。在波長510 nm處分別測定其吸光度Ai；另用蒸餾水代替過氧化氫溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測得參比吸光度Ab；另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測得空白吸光度A0。以同濃度的Vc溶液做陽性對照，清除率計(jì)算公式為：

2.6 抗腫瘤活性研究

2.6.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

將購買的HCCLM（人肝癌細(xì)胞）、A549（人肺癌細(xì)胞）進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇完成后分別將其轉(zhuǎn)移至裝有DEME、RPMI-1640培養(yǎng)基的T25瓶中，放入37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到密度為70% ～ 80%時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6.2 CCK-8法檢測潤楠葉片多糖細(xì)胞活力

參照程婷婷等［21］方法略作修改：在96孔培養(yǎng)板中，分別接種對數(shù)生長期的HCCLM、A549細(xì)胞，每孔0.1 mL（約1 × 104個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)24 h后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖溶液沖洗后，分別加入0.1 mL不同濃度的多糖提取溶液，每濃度平行6孔，培養(yǎng)24 h后，倒掉多糖提取液，加入0.1 mL的CCK-8，置于37℃，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h后，以450 nm為檢驗(yàn)波長，用MK3型酶標(biāo)儀測定吸光度。以細(xì)胞的存活率和藥物的不同濃度作圖，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均設(shè)3組平行，利用軟件SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2021進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

體系pH：當(dāng)pH為5時(shí)，潤楠葉片多糖得率最高，當(dāng)pH過高或過低時(shí)，使得纖維素酶和果膠酶處于不適pH下，影響活性基團(tuán)的解離，酶促反應(yīng)降低，導(dǎo)致得率下降；故選取最佳體系pH為5。

超聲溫度：隨著溫度的不斷提高，潤楠葉片多糖的得率逐漸增加，在60℃時(shí)達(dá)到最大值，60℃后，隨著溫度繼續(xù)增高，得率反而下降。這是因?yàn)橐环矫婕訜峥梢源龠M(jìn)酶活性，增大反應(yīng)速度；另一方面當(dāng)溫度過高，可能分解其有效成分，影響多糖得率；所以選擇60℃作為最佳超聲溫度。

提取功率：當(dāng)功率從100 W上升時(shí)，潤楠葉片多糖得率也在不斷增加，在250 W時(shí)達(dá)到最大，此后，隨著功率的增加，得率反而下降，這可能是由于一定程度的超聲波對植物細(xì)胞有破碎作用，有利于提取物的釋放，但隨著超聲波功率不斷增大，對細(xì)胞的破碎程度增大，溶解雜質(zhì)增多，有效成分溶解量減少，得率呈下降趨勢；所以選擇200 W作為最佳超聲功率。

超聲時(shí)間：當(dāng)超聲時(shí)間過短時(shí)，一方面超聲波的氣穴效應(yīng)和熱效應(yīng)沒有充分發(fā)揮，另一方面酶與底物反應(yīng)不充分，從而導(dǎo)致得率偏低；當(dāng)超聲時(shí)間大于15 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間延長，會導(dǎo)致多糖降解，使得潤楠葉片多糖得率下降；故選取最佳超聲時(shí)間為15 min。

圖1 各因素對潤楠葉片多糖提取率的影響Fig.1 Effects of various factors on polysaccharide yield from leaves of M.nanmu

3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)3.1中單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取潤楠葉片多糖的工藝條件。結(jié)果見表2。各因素影響多糖提取率順序?yàn)镈（超聲時(shí)間） ＞ B（超聲溫度） ＞ C（超聲功率） ＞ A（體系pH），由各因素水平結(jié)果分析可知，最佳提取參數(shù)組合為A2B1C2D3，即體系pH = 5、超聲溫度50℃、超聲功率250 W、超聲時(shí)間20 min。對多糖最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證：多糖優(yōu)化工藝的提取率平均值為7.23%，RSD小于3.57%，表明潤楠葉片多糖的優(yōu)化提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of orthogonal tests

3.3 潤楠葉片多糖的結(jié)構(gòu)表征

3.3.1 紅外光譜分析

潤楠葉片多糖在3 420 cm-1處的吸收譜帶寬而強(qiáng)，為O-H伸縮振動和N-H伸縮振動疊加，主要貢獻(xiàn)物為蛋白質(zhì)和核酸；在1 649 cm-1的特征峰COO-的非對稱伸縮振動；1 411 cm-1為C-H鍵的變角振動吸收峰；1 200 ～ 900 cm-1范圍多為多糖吸收區(qū)（圖2）。

圖2 潤楠葉片多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of polysaccharides from leaves of M.nanmu

3.3.2 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡對潤楠葉片多糖進(jìn)行形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察（見圖3）。在500倍鏡頭下可見潤楠葉片多糖呈不規(guī)則的塊狀形態(tài)，棱角分明且存在一些微小的空隙，隨著放大倍數(shù)的增大，在800和2 000倍的鏡頭下，可以看到其表面光滑、立體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)疏松，這可能與經(jīng)過酶解處理后引起潤楠葉片多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)。

圖3 潤楠葉片多糖的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy of polysaccharides from leaves of M.nanmu

3.3.3 單糖組成分析

通過對單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后HPLC圖譜（圖4）保留時(shí)間綜合分析可知：16.050 min為甘露糖，19.817 min為鼠李糖，22.353 min為葡萄糖醛酸，24.343 min為半乳糖醛酸，27.837 min為葡萄糖，30.200 min為半乳糖，31.647 min為阿拉伯糖，34.080 min為巖藻糖。

圖4 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Color spectrum of mixed monosaccharide standard

潤楠葉片多糖水解產(chǎn)物經(jīng)PMP衍生化的HPLC色譜圖見圖5，幾種單糖的分離效果好，經(jīng)過和標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間比對，可以知道潤楠多糖的單糖主要包括D-甘露糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖，和L-阿拉伯糖，其摩爾比為Man ∶ GalA ∶ Glc ∶ Ara =2.87 ∶ 0.45 ∶ 0.94 ∶ 3.09。

圖5 潤楠葉片多糖液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of polysaccharide from leaves of M.nanmu

3.4 潤楠葉片多糖抗氧化活性

3.4.1 DPPH自由基清除能力

當(dāng)多糖濃度在1 ～ 5 mg/mL時(shí)，潤楠葉片多糖各濃度對DPPH自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現(xiàn)出明顯的量效依賴線性關(guān)系，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，潤楠葉片多糖對DPPH自由基的最大清除率為68.34%，其清除率可達(dá)Vc的71.89%，表明潤楠葉片多糖對DPPH自由基有一定的清除作用（圖6）。

圖6 潤楠葉片多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on DPPH free radical

3.4.2 羥基自由基清除能力

不同濃度的潤楠葉片多糖對羥基自由基均具有較好的清除能力，在0.2、0.4、0.6 mg/mL時(shí)，潤楠葉片多糖對羥基自由基的清除率為70.47%、72.81%、78.51%，均高于Vc。顯示潤楠葉片多糖對羥基自由基具有清除作用（圖7）。

圖7 潤楠葉片多糖對羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on hydroxyl radical

3.5 潤楠葉片多糖抗腫瘤活性

當(dāng)多糖濃度在1.25 ～ 10 mg/mL時(shí)，潤楠葉片多糖對HCCLM、A549細(xì)胞沒有顯著抑制作用。在多糖濃度為20 mg/mL時(shí)，對HCCLM、A549細(xì)胞抑制作用效果顯著，幾乎無細(xì)胞存活；該結(jié)果表明高濃度的潤楠葉片多糖具有一定的抗腫瘤活性（圖8， 9）。

圖8 潤楠葉片多糖對HCCLM細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on cell viability

圖9 潤楠葉片多糖對A549細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on cell viability

4 討論與結(jié)論

目前多糖提取方式主要有熱水浸提法、超聲法、酶解法及超聲輔助酶法等［22］，其含量一般采用苯酚-硫酸法測定。對于富含果膠類粘性物質(zhì)的潤楠葉片，若仍采用熱水浸提法再通過苯酚-硫酸法測定其多糖含量，往往會使測定的多糖含量偏高。為此，該文采用纖維素酶和果膠酶復(fù)合對潤楠葉片多糖進(jìn)行超聲酶解，在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出潤楠葉片多糖的最佳提取工藝：體系pH = 5、超聲溫度50℃、超聲功率250 W、超聲時(shí)間20 min。在此工藝條件下，多糖得率為7.18%。豆佳媛等［23］通過正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取銀杏葉多糖，在最佳條件下，銀杏葉多糖提取率為4.60%，顯示了超聲法提取植物葉片多糖的的良好效率；該文通過超聲輔助復(fù)合酶方式，提高了潤楠葉片多糖得率。潤楠葉片多糖紅外光譜圖主要以蛋白質(zhì)、核酸和糖類等吸收帶組成，并顯示多糖的典型特征吸收峰。潤楠葉片多糖掃描電鏡圖呈現(xiàn)出分裂的塊狀結(jié)構(gòu)，可能是酶解引起多糖聚集體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分裂成不規(guī)則的塊狀或小顆粒碎片等［24］。機(jī)體代謝過程中會產(chǎn)生具有破壞性作用的自由基，清除機(jī)體內(nèi)過量自由基，有助于維持機(jī)體氧化應(yīng)激水平和代謝的平衡有序。潤楠葉片多糖在羥基自由基清除方面效果顯著，并且在0.2、0.4、0.6 mg/mL時(shí)，清除率均高于Vc，說明其具有良好的抗氧化活性，可為今后潤楠葉片多糖的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；潤楠葉片多糖在低濃度時(shí)對HCCLM、A549細(xì)胞抑制作用不顯著，在高濃度20 mg/mL時(shí)才表現(xiàn)出對HCCLM、A549細(xì)胞的顯著抑制效果，表明其具有一定的抗腫瘤活性。潤楠葉片多糖具有一定的生物活性，可能與酶解破壞葉片細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使得多糖充分溶出，有一定關(guān)系。魏晴等［25］采用超聲波輔助法提取大果木姜子多糖，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明其具有一定的抗氧化能力。也有文獻(xiàn)顯示多糖的生物活性與多糖的純度及其單糖組成和含量有關(guān)［26-27］。該文對潤楠葉片多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)表征和生物活性進(jìn)行了初步探究，可為進(jìn)一步開發(fā)潤楠葉片的利用價(jià)值提供理論參考和數(shù)據(jù)支撐。有關(guān)潤楠葉片多糖純化后結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變、生物活性是否提高有待于后續(xù)研究。