尹斌 冉玉平

馬拉色菌臨床鑒定研究進(jìn)展

尹斌 冉玉平

嗜脂性酵母馬拉色菌屬(Malassezia spp.)是人類和動物皮膚上的常駐菌群,由于生長依賴于脂質(zhì)(厚皮馬拉色菌除外),主要分布于皮脂豐富部位,如頭皮、面部、胸背部,約占健康人皮膚定植真菌總量的50%～80%[1-2]。作為條件致病菌,馬拉色菌與多種人及動物皮膚疾病相關(guān),包括直接感染皮膚組織所致的花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎;通過免疫機(jī)制參與某些疾病的發(fā)生發(fā)展,如,脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎、痤瘡、甲真菌病、銀屑病、包皮龜頭炎、外耳道炎、融合性網(wǎng)狀乳頭瘤病等?？拐婢幬锸侵委燅R拉色菌感染的主要手段,但不同種類馬拉色菌對他克莫司、唑類等藥物的敏感性不同[3-4],因而其分類鑒定的臨床重要性日益顯現(xiàn)。

一、馬拉色菌的分類

1853年Robin從花斑糠疹患者皮損處培養(yǎng)分離出馬拉色菌,但直到1889年Baillon才首次提出了馬拉色菌(genusMalassezia)的概念。在其后的約一百年間,馬拉色菌屬的命名和分類非?；靵y。1990年代,通過對各菌種形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)特性的研究,以及脈沖凝膠電泳(PFGE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)和核糖體RNA(rRNA)基因序列分析的應(yīng)用,定義和命名了7種馬拉色菌:糠秕馬拉色菌(M.furfur)、合軸馬拉色菌(M.sympodialis)、鈍形馬拉色菌(M.obtusa)、球形馬拉色菌(M.globosa)、限制馬拉色菌(M.restricta)、斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)和厚皮馬拉色菌(M.pachydermatis)。自2002年起通過rRNA基因序列分析和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)等方法陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了7種馬拉色菌新種:皮膚馬拉色菌(M.dermatis)、日本馬拉色菌(M.japonica)、大和馬拉色菌(M.yamatoensis)、納娜馬拉色菌(M.nana)、羊馬拉色菌(M.caprae)、馬馬拉色菌(M.equina)和兔馬拉色菌(M.cuniculi)[5]。目前,已發(fā)現(xiàn)上述14種馬拉色菌中有11種參與人體皮膚微生態(tài)構(gòu)成[6]。隨著馬拉色菌研究的不斷進(jìn)展,菌種分類體系的建立已深入至相關(guān)疾病與特定菌種之間關(guān)系的研究,其中重要一環(huán)是準(zhǔn)確鑒定在皮膚表面分布的馬拉色菌群(Malasseziamicrobiota)。

二、依賴于培養(yǎng)的馬拉色菌鑒定方法

1.傳統(tǒng)的形態(tài)生理生化鑒定:臨床對酵母菌的鑒定主要是基于其生化特征,API20C AuxTM和ID 32C APITM(bioMérieux)是最常用的酵母菌鑒定商用試劑盒,能在48 h內(nèi)分別鑒定47和69種酵母菌,但由于它們無法提供馬拉色菌生長需要的脂質(zhì)營養(yǎng)而不能用于馬拉色菌的鑒別[7]。根據(jù)馬拉色菌對脂源的同化、七葉苷分解、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)的不同,形成了一套形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定系統(tǒng)[7],包括:①沙堡弱培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar,SDA)生長試驗(yàn);②改良Dixon培養(yǎng)基溫度生長試驗(yàn);③吐溫20、40、60、80利用試驗(yàn);④七葉苷分解試驗(yàn)(Esculin solution test);⑤過氧化氫酶試驗(yàn)(Catalase test);⑥PGE-35蓖麻油試驗(yàn)(Castor oil test)。該系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用CHROMagarTM馬拉色菌培養(yǎng)基可進(jìn)一步提高鑒定準(zhǔn)確性。Kaneko等[8]分析9種370株馬拉色菌,有363株(98.1%)得以準(zhǔn)確鑒定。Ramadán等[9]對200株花斑糠疹皮損區(qū)臨床分離株進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示51%為合軸馬拉色菌,40%為球形馬拉色菌,隨后為糠秕馬拉色菌(7%)、鈍形馬拉色菌(1%)與斯洛菲馬拉色菌(1%)。

隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,傳統(tǒng)方法所固有的不足逐漸顯現(xiàn):馬拉色菌菌種之間除球形馬拉色菌外沒有太多形態(tài)學(xué)特征可供鑒別;培養(yǎng)過程常被其他酵母菌污染,鑒定前必須反復(fù)多次劃線純化以獲得單菌落;部分菌種生長緩慢(如球形、限制馬拉色菌),易被生長較快的菌種(如糠秕馬拉色菌)競爭性抑制;形態(tài)學(xué)和生化鑒定操作復(fù)雜,周期長,受培養(yǎng)方法及實(shí)驗(yàn)者主觀判斷影響較大,導(dǎo)致菌種分布情況在不同的研究報(bào)告中存在較大差異,尤其是在生化鑒定與分子生物學(xué)鑒定方法之間。

2.rRNA基因序列分析:真菌rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)、5.8S rRNA 基因、D1/D2 26S rRNA 基因和基因間間隔1區(qū)(intergenic spacer region 1，IGS 1)隨菌種不同而有所差異,而在種內(nèi)其長度通常恒定,其中ITS區(qū)和D1/D2 26S rRNA基因被廣泛用于真菌鑒定。對于馬拉色菌屬而言,同種間D1/D2 26S rRNA基因DNA相似性大于99%;而各馬拉色菌菌種間ITS區(qū)的長度從161～266 bp不等,而且球形與限制馬拉色菌還表現(xiàn)出種內(nèi)的序列多樣性[7]。很多種馬拉色菌只需要進(jìn)行D1/D2 26S rRNA基因測序即可鑒別,但合軸馬拉色菌以及進(jìn)化關(guān)系與其緊密相關(guān)的馬、羊、皮膚馬拉色菌除外。這4種馬拉色菌的D1/D2 26S rRNA基因序列相似性超過98%～99%,其ITS1區(qū)和ITS2區(qū)的基因序列相似性分別為82%～93%和88%～95%。因此當(dāng)菌株考慮為合軸以及與其緊密相關(guān)的馬拉色菌時,推薦D1/D2 26S rRNA基因測序和ITS區(qū)基因測序聯(lián)合進(jìn)行。IGS區(qū)測序可用于馬拉色菌,但適用于流行病學(xué)調(diào)查。根據(jù)IGS1區(qū)序列的變異,發(fā)現(xiàn)某些球形馬拉色菌菌株對特應(yīng)性皮炎可表現(xiàn)出一定程度的偏向性[10-11]。對限制馬拉色菌的研究[12]也發(fā)現(xiàn),來源于正常皮膚與來源于特應(yīng)性皮炎的菌株,IGS1區(qū)序列具有明顯的差異。

3.其他基于分子技術(shù)的鑒別方法:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA可用于特定馬拉色菌菌種的標(biāo)記和基因圖譜研究,有研究采用該方法對分離自花斑糠疹、脂溢性皮炎合并HIV的糠秕馬拉色菌進(jìn)行分型和相互比較[13]。應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析已成功鑒定出馬拉色菌菌種和糠秕馬拉色菌種內(nèi)差異性[14]。采用限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)對糠秕馬拉色菌ITS2區(qū)進(jìn)行分析,表明菌株具有明顯的地理差異性,如從歐洲東南部分離的糠秕馬拉色菌株,較自歐洲其他地方分離的菌株缺乏BanⅠ酶切位點(diǎn),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。對厚皮馬拉色菌的ITS1區(qū)及核糖體大亞基rRNA進(jìn)行測序和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析可將厚皮馬拉色菌分為3個主要的基因簇,其中兩個與皮損區(qū)皮膚和高磷脂酶活性有關(guān)[16],由此可分析馬拉色菌生理特性和不同菌株的來源。

三、不依賴于培養(yǎng)的鑒別方法

準(zhǔn)確地鑒定皮膚表面馬拉色菌群要求待測標(biāo)本中所有種類的馬拉色菌均能在培養(yǎng)基中生長復(fù)蘇,然而沒有任何一種培養(yǎng)基能滿足所有馬拉色菌的生長要求。盡管依賴于培養(yǎng)的方法可以產(chǎn)出相當(dāng)數(shù)量的活細(xì)胞,但各種馬拉色菌對營養(yǎng)條件的依賴性、生長活性的不同以及分離污染的干擾,依靠培養(yǎng)法所得出的鑒定結(jié)果不可避免地存在一定的誤差,無法取得準(zhǔn)確的分析結(jié)果。因此基于分子生物學(xué)技術(shù)、不依賴培養(yǎng)的馬拉色菌鑒定方法得以開發(fā)應(yīng)用。

1.臨床樣本直接提取馬拉色菌DNA:Tajima等[11]開發(fā)出一種從臨床標(biāo)本中直接提取馬拉色菌DNA并進(jìn)行菌種鑒定方法:可選用棉棒擦拭、手術(shù)刀刮取、醫(yī)用透明敷貼粘貼或適當(dāng)緩沖液沖洗皮屑(推薦敷貼粘貼,簡單、易操作且對皮膚無損傷)。敷貼粘貼取樣部位3次以獲得足夠量的真菌DNA[11],將敷貼置于DNA提取液加熱,然后加入Ethachimate催化沉淀進(jìn)行提取。Zhang等[17]則選取適宜濃度的Triton X-100,先對采集標(biāo)本的敷貼進(jìn)行充分洗滌后再行后續(xù)的提取和擴(kuò)增,以保證采集的菌量。DNA測序并分析馬拉色菌rRNA基因ITS區(qū)和D1/D2 26S rRNA基因是最可靠和準(zhǔn)確的鑒定提取是否成功的方法:采用引物ITS1和NL4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用引物ITS1和ITS4,或者NL1和NL4測序,所得序列上傳到 GenBank進(jìn)行 blast比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。若D1/D2 26S rRNA基因的相似性＞99%,則可鑒定為同一菌種[7]。

2.巢式PCR:由兩套PCR引物(巢式引物)進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)。首先在常規(guī)條件下用第1套跨越目的DNA片段的外引物擴(kuò)增,第2套內(nèi)引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,使得第2次PCR擴(kuò)增片段短于第1次擴(kuò)增。由于有2次PCR擴(kuò)增,巢式PCR法增加了檢測的敏感性;同時又有2套PCR引物與檢測模板配對,增加了檢測的可靠性。Morishita等[18]采用巢式PCR法對花斑糠疹患者所攜帶的9種親人性馬拉色菌進(jìn)行了定性分析,從93.9%患者皮損區(qū)分別檢測出球形馬拉色菌及限制馬拉色菌,而其他菌種低于35%。Kaga等[19]對56例成人特應(yīng)性皮炎患者進(jìn)行鑒定,并與32例健康個體比較,約60%的患者檢測出合軸馬拉色菌,其余菌種檢出率為10%～40%,健康個體與特應(yīng)性皮炎患者間無明顯差異;Zhang等[17]設(shè)計(jì)了10對巢式引物進(jìn)行特異擴(kuò)增,檢測中國146例脂溢性皮炎患者,分別從87.0%和81.5%患者皮損區(qū)分離出球形馬拉色菌及限制性馬拉色菌,同時隨機(jī)抽取60份標(biāo)本采用傳統(tǒng)培養(yǎng)生化方法進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果顯示,非培養(yǎng)直接DNA提取法在研究菌種構(gòu)成方面較傳統(tǒng)培養(yǎng)生化方法準(zhǔn)確且簡捷。

3.實(shí)時熒光定量PCR:采用特異性TaqMan探針和非特異性SYBR GreenⅠ熒光染料的兩種實(shí)時熒光定量PCR均已用于定量分析非培養(yǎng)樣本的馬拉色菌DNA。SYBR GreenⅠ熒光為一種雙鏈DNA結(jié)合熒光,可擴(kuò)增所有雙鏈DNA,檢測靈敏度高;不需要設(shè)計(jì)探針,降低了成本。但其對PCR反應(yīng)過程中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光,從而降低了特異性,必須使用熔解曲線或凝膠分析來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。TaqMan探針具有基因特異性序列,可與兩個PCR引物之間的靶點(diǎn)結(jié)合,檢測在PCR循環(huán)期間聚積的某種特異性PCR產(chǎn)物。與SYBR GreenⅠ熒光染料相比,TaqMan探針對目標(biāo)序列的特異性更高,其引物設(shè)計(jì)相對簡單,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,但探針設(shè)計(jì)要求較高,成本也更貴。Akaza等[20]以棉棒擦拭40例日本健康個體皮膚取樣,設(shè)計(jì)9對馬拉色菌種特異性引物,采用SYBR Green熒光染料+ROX進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測,分析季節(jié)、性別、部位與馬拉色菌菌種分布的關(guān)系。Sugita等[21]采用TaqMan探針實(shí)時熒光PCR對特應(yīng)性皮炎皮損處馬拉色菌菌群進(jìn)行定量定性研究。該方法設(shè)計(jì)3對特異性引物以及與之對應(yīng)的TaqMan熒光探針,分別擴(kuò)增馬拉色菌屬及2種主要的馬拉色菌(球形馬拉色菌、限制馬拉色菌)靶DNA,其中馬拉色菌屬特異性引物根據(jù)馬拉色菌屬26S rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì),后兩對種特異性引物則來源于rRNA的ITS2區(qū)。2012年,Zhang等[22]在此基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)了斯洛菲馬拉色菌種特異性引物及對應(yīng)的TaqMan熒光探針。由于采用絕對定量法,以馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株重組質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,該方法檢測馬拉色菌DNA的靈敏度達(dá)到10拷貝,將研究引入更深層次,已應(yīng)用到花斑糠疹、脂溢性皮炎等馬拉色菌相關(guān)疾病[11，23]及皮膚微生態(tài)研究中[22，24]。

四、花斑糠疹馬拉色菌臨床鑒定研究

花斑糠疹是由馬拉色菌所致皮膚角質(zhì)層淺表感染,在各種馬拉色菌相關(guān)疾病中,對花斑糠疹的微生態(tài)研究開展得較早也最多。既往采用依賴于培養(yǎng)的鑒定方法,可能由于取樣方法或取樣量不同,不同研究間通過培養(yǎng)得到的馬拉色菌生長效率差別很大,在多項(xiàng)研究中皮損部位主要檢測結(jié)果為球形、合軸和糠秕馬拉色菌,限制馬拉色菌的檢出率很低甚至檢測不到。

基于分子生物學(xué)技術(shù)、不依賴培養(yǎng)的馬拉色菌鑒定分析方法的引入,使菌種檢測靈敏度顯著提高,限制馬拉色菌的檢出率發(fā)生了顯著變化:傳統(tǒng)培養(yǎng)生化鑒定法僅為0～8.0%,非培養(yǎng)分子生物學(xué)鑒定法則為100%。采用非培養(yǎng)法進(jìn)行巢式PCR,Nakabayashi等[25]發(fā)現(xiàn),花斑糠疹皮損中球形馬拉色菌比例為97%,其次是限制馬拉色菌(79%)和合軸馬拉色菌(68%)。Morishita等[18]從93.9%的花斑糠疹患者皮損區(qū)分別檢測出球形馬拉色菌及限制馬拉色菌,而其他菌種的檢出率低于35%。Saad等[23]采用TaqMan探針實(shí)時熒光PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),馬拉色菌定植量花斑糠疹皮損區(qū)是非皮損區(qū)的2.7～6.0倍;球形馬拉色菌的定植量在花斑糠疹皮損部位最高,限制馬拉色菌在非皮損部位最高,而對于健康個體,球形馬拉色菌和限制馬拉色菌無顯著差異,二者總和占馬拉色菌總量的95%以上,均為優(yōu)勢菌種。Vuran等[26]從55例土耳其花斑糠疹患者皮損區(qū)刮取皮屑后直接提取馬拉色菌DNA,采用多重PCR方法檢測出其中50例為球形馬拉色菌。這些結(jié)果使球形馬拉色菌是花斑糠疹皮損的優(yōu)勢菌種這個結(jié)論得到共識。

五、展望

盡管馬拉色菌培養(yǎng)操作復(fù)雜,保存不易,球形和限制馬拉色菌的流行病學(xué)數(shù)據(jù)資料有限,馬拉色菌屬種間異型性仍不斷被研究,從臨床樣本中直接檢測馬拉色菌DNA的方法成為準(zhǔn)確鑒定馬拉色菌有力工具。菌種分類的日益完善和不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)鑒定方法使馬拉色菌與皮膚微生態(tài)研究不斷發(fā)展,相關(guān)疾病的研究也更加深入。目前,球形馬拉色菌和限制馬拉色菌的基因組已測序并被分析[27-28],數(shù)字化的PCR技術(shù)[29]和高通量測序技術(shù)[6]也已廣泛應(yīng)用于臨床科研。相信不久以后,通過非培養(yǎng)技術(shù)收集更多的mRNA基因數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組學(xué)蛋白組學(xué)研究,對致病菌株分離鑒定進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查,精確分析鑒定皮膚上共生的每一種馬拉色菌及其他微生物將成為現(xiàn)實(shí)。

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2014-03-24)

(本文編輯:顏艷)

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.025

610041成都,四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科[尹斌(現(xiàn)在成都市第二人民醫(yī)院皮膚科,610017)、冉玉平]

冉玉平,Email:ranyuping@gmail.com