王美惠 陳煥文 解丹 項嘉建 宇佳 遲德富

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

長林小蠹(HylurgusligniperdaFabricius),又名紅毛小蠹,隸屬于鞘翅目(Coleoptera)象鼻蟲科(Curculionidae)林小蠹屬(HylurgusLatreille),原產(chǎn)于歐洲南部及非洲北部的地中海沿岸[1],主要以松屬(Pinus)植物為食。長林小蠹成蟲體長4.0～5.7 mm,入侵能力強(qiáng)[2],很容易通過松樹木材的貿(mào)易活動進(jìn)行傳播,是全球各國在松樹進(jìn)口木材中截獲最多的昆蟲之一。近百年來,已先后入侵亞洲、大洋洲、南美洲、北美洲、非洲南部的多個國家[3],2019年在我國山東省泰安市首次誘集到長林小蠹,此后,在山東煙臺市也發(fā)現(xiàn)了該種的入侵[4]。目前,長林小蠹在我國主要危害黑松(Pinusthunbergia),也可能危害華山松(Pinusarmandii)、赤松(Pinusdensiflora)、油松(Pinustabuliformis)等,長林小蠹已明確在我國定殖并對松屬樹木造成極其嚴(yán)重的危害[1]。

腸道微生物在與宿主長期進(jìn)化的過程中,對宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)、解毒代謝等多方面都產(chǎn)生了至關(guān)重要的作用;宿主昆蟲則為腸道微生物提供食物以及生存環(huán)境,二者協(xié)同進(jìn)化、互惠互利。此外,腸道微生物在綠色防治害蟲方面也具有巨大潛力[5-6]。例如,通過基因改造等手段操縱昆蟲腸道內(nèi)的共生菌[7],或?qū)?yōu)勢菌株開發(fā)為害蟲引誘劑等。因此,對于長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌種類的鑒定及種群組成的研究,將有助于探明長林小蠹對寄主的適應(yīng)機(jī)制,為完善長林小蠹的防控體系以及生態(tài)控制技術(shù)的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。近年來,對昆蟲腸道微生物的研究日益深入,研究表明,昆蟲腸道內(nèi)存在多種多樣的微生物,多數(shù)昆蟲腸道的微生物中,細(xì)菌豐度最高,約占90%以上[8],是昆蟲腸道微生物的優(yōu)勢菌群。在細(xì)菌分類中,昆蟲腸道內(nèi)大部分細(xì)菌屬于變形菌門。在國外,對長林小蠹伴生真菌的研究居多[9-10],但到目前為止,對其耐受和降解植物防御物質(zhì)相關(guān)的腸道細(xì)菌群落了解甚少;在國內(nèi),由于長林小蠹定殖中國不久,對該種腸道細(xì)菌的研究報道較少,但對于目前我國分布的其他小蠹蟲腸道細(xì)菌的研究已有一些文獻(xiàn)報道。婁哲巧[11]采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了紅脂大小蠹(Dendroctonusvalens)成蟲和幼蟲腸道、蛹的體表及坑道蛀屑可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性,共同分離得到59種細(xì)菌,其中變形菌門的沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和Rahnella屬為優(yōu)勢均屬。胡霞[12]采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)及基因克隆轉(zhuǎn)化的方法研究了華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)成蟲、幼蟲和蛹的腸道細(xì)菌多樣性,發(fā)現(xiàn)10個細(xì)菌屬,其中變形菌門的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和泛菌屬(Pantoea)為優(yōu)勢均屬。本研究以采集自山東省煙臺市牟平區(qū)的長林小蠹為樣本,通過傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合形態(tài)學(xué)及16S rDNA測序?qū)﹂L林小蠹腸道優(yōu)勢可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了初步分離鑒定,為進(jìn)一步探討長林小蠹腸道微生物的功能及其生物防治方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試蟲源：采集時間為2022年5月,從位于山東省煙臺市牟平區(qū)的黑松林場內(nèi)采集長林小蠹的成蟲和幼蟲,采集方法為尋找有長林小蠹鉆蛀孔的黑松伐樁,將地面上方樹干的樹皮剝開,沿著坑道可以找到長林小蠹的成蟲和幼蟲,用鑷子小心夾出并放入已打孔且放有從野外收集的黑松韌皮碎屑的塑料盒中帶回實驗基地。長林小蠹在實驗基地內(nèi)的飼養(yǎng)條件為恒溫25 ℃,相對濕度70%,無光照。試驗時選擇大小一致、健康活躍的昆蟲供試。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,瓊脂粉15～20 g,無菌水1 000 mL,pH=7.0[13]。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂15～25 g,無菌水1 000 mL,pH=7.4～7.6[13]。

厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基：厭氧菌瓊脂(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)58.4 g,無菌水1 000 mL[14]。

1.1 長林小蠹腸道細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

隨機(jī)選取30頭健康的長林小蠹成蟲與30頭發(fā)育程度相同的幼蟲,饑餓處理24 h后,在無菌環(huán)境下進(jìn)行解剖。用無菌水沖洗成蟲和幼蟲的體表,再用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精對蟲體體表消毒2 min,最后用無菌水漂洗蟲體30 s。在放有5 mL PBS緩沖液的滅菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行解剖,將解剖出的成蟲和幼蟲腸道分別放在含有1 mL PBS緩沖液的1.5 mL離心管中,用研磨棒徹底研磨至勻漿,用無菌水迅速稀釋至研磨液體積分?jǐn)?shù)為10-1～10-44個梯度。采用LB、NA和厭氧菌瓊脂3種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。將10-2、10-3、10-43個體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行3種平板稀釋涂布,每個梯度涂3個平板,每塊平板涂20 μL的勻漿液,兼性厭氧菌的培養(yǎng)放于有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧罐中[15],培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)72 h后,挑選出菌落數(shù)在 30～300的培養(yǎng)基,用接種環(huán)挑取不同生長性狀的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),每個平板至少純化5次得到純菌株,純化后的菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,加入最終體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油于-80 ℃進(jìn)行保存?zhèn)溆?試驗重復(fù)3次。

1.2 長林小蠹腸道細(xì)菌的形態(tài)觀察

將分離純化后得到的細(xì)菌菌株采用平板劃線法接種于新的LB平板上,在25 ℃下培養(yǎng)24～36 h,待菌落長成后,對菌落進(jìn)行革蘭氏染色[13],并觀察菌株的形態(tài),依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法對其特征進(jìn)行描述和鑒定[16]。

1.3 細(xì)菌菌株的DNA提取及PCR擴(kuò)增

本研究采用凍融法提取各細(xì)菌基因組的DNA[17],具體操作如下：將純化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,25 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后至菌液渾濁,兼性厭氧菌單菌落接種于厭氧菌肉湯培養(yǎng)基(山東拓普生物工程有限公司)后置于有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧罐中,25 ℃靜置培養(yǎng)24 h后至菌液渾濁。每個菌株分別取1 mL菌液于1.5 mL離心管中,12 000 r/min 離心1 min,棄上清液,重復(fù)上述操作兩次,向離心管中加入500 μL的無菌雙蒸水,液氮冷凍10 min后,置于水浴鍋99 ℃ 20 min,取出后12 000 r/min離心2 min,以上清液作為模板。以細(xì)菌16S rDNA通用引物27 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’)和1492 R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、PCR Mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

取5.0 μL PCR產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,檢測后將PCR產(chǎn)物送至睿博興科(東北)測序部進(jìn)行測序。

1.4 腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對,一般認(rèn)為序列的相似率>99%為同種, 95%～99%為同屬, <95%為同科。選取并下載與菌株同源性最高的序列作為比對菌株的序列,與測序獲得的細(xì)菌序列一起,運用MEGA11.0軟件和國際通用的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,用Bootstrap法計算1 000次進(jìn)行檢測,以此判定其分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)特征

從長林小蠹腸道中共分離獲得20株形態(tài)、顏色和大小各異的細(xì)菌菌株。菌落形態(tài)多為圓形,僅有1株為不規(guī)則狀;從顏色看,有白色、乳白色、淺白色、乳白偏黃、淡黃色;從細(xì)菌形態(tài)看,有2株為球狀,18株為桿狀;革蘭氏染色結(jié)果表明,有3株菌呈陽性,17株菌呈陰性。詳細(xì)培養(yǎng)性狀見表1。

表1 長林小蠹腸道細(xì)菌的菌落形態(tài)及培養(yǎng)性狀

2.2 長林小蠹腸道細(xì)菌的16S rDNA序列分析結(jié)果

長林小蠹腸道細(xì)菌菌株測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,分離到的腸道細(xì)菌與相應(yīng)菌株的16S rDNA序列相似度均在98%～100%。從表2看,這20株細(xì)菌隸屬于2門4綱6目9科15屬18種,初步鑒定得到：解蛋白芽孢桿菌(Bacillusproteolyticus)1株,乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)1株,布魯氏菌(Brucellapseudintermedia)1株,熱帶副伯克霍爾德菌(Paraburkholderiatropica)1株,洋蔥伯克氏菌(Burkholderiastagnalis)1株,Pantoeacypripedii1株,成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)1株,野梧桐歐文氏菌(Erwiniamallotivora)1株,Erwiniaendophytica1株,黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)1株,蛋白原假單胞菌(Pseudomonasprotegens)2株,羅克西拉席爾瓦菌(Rouxiellasylvae)1株,科薩克尼亞嗜米腸桿菌(Kosakoniaoryziphila)1株,產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)1株,催產(chǎn)克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)1株,土生拉烏爾菌(Raoultellaterrigena)1株,Raoultellaelectrica1株,赫爾曼亞特蘭大桿菌(Atlantibacterhermannii)1株,耐冷哈夫尼菌(Hafniapsychrotoler)2株。

表2 長林小蠹腸道細(xì)菌的16S rDNA序列比對

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果

圖1顯示,長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分為2大枝18小枝,兩大枝分別為厚壁菌門和變形菌門,其中厚壁菌門芽孢桿菌屬的菌株A01與它的模式菌株Bacillusproteolyticus聚為一類,乳球菌屬的菌株A02與它的模式菌株Lactococcuslactis聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近;變形菌門布魯菌屬的A03與它的模式菌株Brucellapseudintermedia單獨聚為一類;變形菌門帕拉伯克霍爾德氏菌屬的菌株A04與它的模式菌株P(guān)araburkholderiatropica聚為一類,伯克霍爾德屬的菌株A05與它的模式菌株Burkholderiastagnalis聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這兩種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近;變形菌門假單胞菌屬的A19和A20與它的模式菌株P(guān)seudomonasprotegens單獨聚為一類;歐文氏菌屬的菌株A08與它的模式菌株Erwiniamallotivora聚為一類;泛菌屬的菌株A06與它的模式菌株P(guān)antoeacypripedii聚為一類,歐文氏菌屬的菌株A09與它的模式菌株Erwiniatypographi聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近;Atlantibacter屬的菌株A16與它的模式菌株Atlantibacterhermannii聚為一類;科薩克氏菌屬的A12與它的模式菌株Kosakoniaoryziphila聚為一類,這2小枝又聚在一起合成一大枝,表明這2種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近;泛菌屬的菌株A07與它的模式菌株P(guān)antoeaagglomerans聚為一類;拉烏爾菌屬的菌株A14與它的模式菌株Raoultellaterrigena聚為一類,菌株A15與它的模式菌株Raoultellaelectrica聚為一類,克雷伯氏菌屬的菌株A13與它的模式菌株Klebsiellaoxytoca聚為一類,這3小枝又聚在一起合成一大枝,表明這3種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近;沙雷氏菌屬的菌株A10與它的模式菌株Serratiamarcescens聚為一類,哈夫尼亞菌屬的A17和A18與它的模式菌株Hafniapsychrotolerans聚為一類,Rouxiella屬的菌株A11與它的模式菌株Rouxiellasilvae聚為類,這3小枝又聚在一起合成一大枝,表明這3種細(xì)菌的親緣關(guān)系較近。

圖1 16S rDNA 序列構(gòu)建的長林小蠹腸道細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)

2.4 長林小蠹成蟲和幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌屬種組成

從屬的水平上看,長林小蠹成蟲腸道中可培養(yǎng)的細(xì)菌有10個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、哈夫尼亞菌屬。其中,沙雷氏菌屬、Rouxiella屬和科薩克氏菌屬的細(xì)菌相對分離率為 32.3%、16.1%和13.9%,均是成蟲腸道分離菌株中的優(yōu)勢菌屬。幼蟲腸道中可培養(yǎng)的細(xì)菌有15個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、Atlantibacter屬、哈夫尼亞菌屬、假單胞菌屬。其中,歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬和Rouxiella屬的細(xì)菌相對分離率為17.6%、23.1%、13.2%和13.2% ,均是幼蟲腸道分離菌株中的優(yōu)勢菌屬(表3)。

表3 長林小蠹成蟲與幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在屬水平上的組成情況

從種水平上看,長林小蠹成蟲腸道中可培養(yǎng)的細(xì)菌有 10 種,分別為解蛋白芽孢桿菌、乳酸乳球菌、Pantoeacypripedii、野梧桐歐文氏菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌、科薩克尼亞嗜米腸桿菌、催產(chǎn)克雷伯菌、土生拉烏爾菌、耐冷哈夫尼菌。其中,黏質(zhì)沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌和科薩克尼亞嗜米腸桿菌的相對分離率為32.3%、16.1%和13.9%,是成蟲腸道分離菌株中的優(yōu)勢菌種。長林小蠹幼蟲腸道中可培養(yǎng)的細(xì)菌有 18 種,分別為解蛋白芽孢桿菌、乳酸乳球菌、假中間布魯氏菌、熱帶副伯克霍爾德菌、洋蔥伯克氏菌、Pantoeacypripedii、成團(tuán)泛菌、野梧桐歐文氏菌、Erwiniatypographi、黏質(zhì)沙雷氏菌、羅克西拉席爾瓦菌、科薩克尼亞嗜米腸桿菌、催產(chǎn)克雷伯菌、土生拉烏爾菌、Raoultellaelectrica、赫爾曼亞特蘭大桿菌、耐冷哈夫尼菌、蛋白原假單胞菌。其中,黏質(zhì)沙雷氏菌、野梧桐歐文氏菌、羅克西拉席爾瓦菌和催產(chǎn)克雷伯菌的相對分離率為23.1%、16.5%、13.2%和13.2%,是幼蟲腸道分離菌株中的優(yōu)勢菌種(表4)。

表4 長林小蠹成蟲與幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在種水平上的組成情況

3 結(jié)論與討論

昆蟲腸道內(nèi)棲息著大量的微生物,在長期協(xié)同進(jìn)化的過程中與寄主發(fā)展為密不可分的共生關(guān)系,協(xié)助寄主適應(yīng)各種生境[18]。本研究采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法結(jié)合形態(tài)學(xué)及16S rDNA測序技術(shù),對采自山東省煙臺市牟平區(qū)以黑松為寄主的長林小蠹成蟲及幼蟲的腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),共分離到2門4綱6目9科15屬18種。從門水平看,成蟲和幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌均以變形菌門為優(yōu)勢菌門,厚壁菌門少量存在,符合昆蟲腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌門的研究結(jié)果[19];從科水平看,γ-變形菌綱中的腸桿菌科和歐文氏菌科是優(yōu)勢菌科,與婁巧哲[11]對紅脂大小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌科一致;從屬水平上看,長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌一共有15個屬,分別為芽孢桿菌屬、乳球菌屬、布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、Rouxiella屬、科薩克氏菌屬、克雷伯氏菌屬、拉烏爾菌屬、Atlantibacter屬、哈夫尼亞菌屬、假單胞菌屬;其中,成蟲腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為沙雷氏菌屬、Rouxiella屬及科薩科氏菌屬,幼蟲腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬、Rouxiella屬及克雷伯氏菌屬,與婁巧哲對紅脂大小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌及胡霞對華松山大小蠹腸道細(xì)菌多樣性分析的研究報道具有一定的相似性[11-12]。與目前我國分布的其他小蠹蟲相比,布魯氏菌屬和Atlantibacter屬是長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌所特有的屬,假中間布魯氏菌(Brucellapseudintermedia)和赫爾曼亞特蘭大桿菌(Atlantibacterhermannii)是長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌所特有的種。

沙雷氏菌屬和Rouxiella屬作為長林小蠹腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬,在成蟲和幼蟲腸道內(nèi)均處于優(yōu)勢地位。據(jù)報道,沙雷氏菌屬的細(xì)菌通過在寄主腸道中形成免疫反應(yīng)等方式,如誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等解毒酶對萜烯化合物進(jìn)行降解[20-21],由此推測沙雷氏菌屬的細(xì)菌提高了長林小蠹對新環(huán)境的入侵和適應(yīng)能力;對于Rouxiella屬的細(xì)菌報道較少,有研究從樹液分泌物中分離出Rouxiella屬的細(xì)菌[22],推測可能通過長林小蠹的取食和蛀道等行為進(jìn)入腸道,其功能還需進(jìn)一步探討。歐文氏菌屬和克雷伯氏菌屬作為長林小蠹幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬,通過產(chǎn)生分解酶的方式降解纖維素[23],協(xié)助幼蟲的食物消化和營養(yǎng)利用。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),幼蟲與成蟲腸道細(xì)菌存在一定的差異,幼蟲腸道中存在的布魯菌屬、帕拉伯克霍爾德氏菌屬以及Atlantibacter屬等,猜測可能與幼蟲生長發(fā)育的特定需求有關(guān)[24],也可能參松屬植物防御物質(zhì)的解毒作用,如代謝萜類化合物及酚類化合物等[25-26]。以上細(xì)菌對于長林小蠹生理生化過程的影響,還有待進(jìn)一步挖掘。

長林小蠹是全球林業(yè)重要的害蟲,尤其是對松科植物的危害極其嚴(yán)重,對其腸道細(xì)菌進(jìn)行研究,不僅可以補充昆蟲腸道共生菌的資源庫,還可以據(jù)此進(jìn)一步分析腸道細(xì)菌對昆蟲生長發(fā)育、營養(yǎng)調(diào)控以及解毒代謝的影響,最終得到綠色防治長林小蠹的生物制劑,從而降低其危害。