王 正 馬曉乾 周勤政 鄭桂恒 夏吾加 張艷明 王成立 晉鵬非 呂 全 張星耀

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所 哈爾濱 150081； 3.青海省黃南州麥秀林場(chǎng) 黃南 811300； 4.紅石林業(yè)局國(guó)家林木良種基地 樺甸 132400； 5.吉林省長(zhǎng)白森林經(jīng)營(yíng)局 白山 134400； 6.日喀則市林業(yè)和草原局 日喀則 857000)

齒小蠹(Ips)隸屬于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)小蠹亞科(Scolytinae)，廣泛分布于北半球的針葉林中，主要以云杉屬(Picea)、松屬(Pinus)、落葉松屬(Larix)等松科(Pinaceae)植物的韌皮部為食(Woodetal., 1992)。目前全球已知37種，大多數(shù)為次期性害蟲，主要取食瀕死或已經(jīng)死亡的針葉樹，但其中許多物種在種群大流行時(shí)可以導(dǎo)致針葉林的大面積死亡，造成巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)損失(Cognato, 2015)。例如，云杉八齒小蠹(I.typographus)的周期性爆發(fā)導(dǎo)致歐洲數(shù)千公頃歐洲云杉(Piceaabies)的死亡(Stadelmannetal., 2013)，僅2019年在德國(guó)就造成了130萬(wàn)m3木材的損失，直接經(jīng)濟(jì)損失超過180億元，德國(guó)政府甚至出動(dòng)軍隊(duì)參與滅蟲(央視新聞, http:∥tv.cctv.com/2019/08/30/VIDEzPOPA8MktkIjcmWYBzxh190830.shtml)。在北美洲，加州十齒小蠹(I.confusus)也曾在美國(guó)造成數(shù)十萬(wàn)hm2松林的死亡(Anonymous, 2005)。由于缺乏有效的防控措施，齒小蠹的危害在我國(guó)也有逐年加重的趨勢(shì)，僅吉林省2007年云杉八齒小蠹的發(fā)生面積即達(dá)5.5萬(wàn)hm2，長(zhǎng)白山林區(qū)多處森林大面積枯死(王澤斌等, 2013)。2002—2008年，新疆阿爾泰山林區(qū)的云杉林受到云杉八齒小蠹危害，中重度受害面積超過6萬(wàn)hm2，造成巨大損失(岳朝陽(yáng)等, 2014)。光臀八齒小蠹(I.nitidus)在青海省黃南州危害超過4 000 hm2的云杉林，發(fā)生率達(dá)到27%，僅麥秀林區(qū)發(fā)生面積就超過1 400 hm2，發(fā)生率超過57%(薛永貴等, 2003)。

目前，我國(guó)齒小蠹屬昆蟲的種類記載不盡相同。殷蕙芬等(1984)記載了8種，包括六齒小蠹(I.acuminatus)、重齒小蠹(I.duplicatus)、天山重齒小蠹(I.hauseri)、落葉松八齒小蠹(I.subelongatus)、光臀八齒小蠹、十二齒小蠹(I.sexdentatus)、云杉八齒小蠹，以及后被劃分到瘤小蠹屬(Orthotomicus)的中重齒小蠹(I.mannsfeldi)。黃復(fù)生等(2015)在此基礎(chǔ)上增加了西藏重齒小蠹(I.stebbingi)(書中學(xué)名誤寫為I.ribbentropi)。Cognato(2015)對(duì)全球范圍內(nèi)齒小蠹的生物學(xué)、分類學(xué)與演化進(jìn)行了綜述，推測(cè)我國(guó)除了上述8種齒小蠹外，還有歐洲落葉松八齒小蠹(I.cembrae)、中華齒小蠹(I.chinensis)、喜馬拉雅長(zhǎng)葉松齒小蠹(I.longifolia)和香格里拉齒小蠹(I.shangrila)，共12種齒小蠹在我國(guó)分布。Cognato(2015)強(qiáng)調(diào)許多齒小蠹屬的種類僅通過形態(tài)特征很難加以區(qū)分，需要借助序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析的分子鑒定手段。然而目前對(duì)我國(guó)齒小蠹屬種類的分布報(bào)道及其分類研究大多仍停留在形態(tài)鑒定方面，缺乏DNA分子數(shù)據(jù)的支持，容易造成錯(cuò)誤鑒定，給蟲害的精準(zhǔn)防治帶來(lái)困難。

目前，基于mtDNA COⅠ基因序列比對(duì)的分子鑒定方法已經(jīng)在昆蟲分類中得到廣泛應(yīng)用。在齒小蠹屬種類的鑒定方面，Stauffer(1997)最早通過mtDNA COⅠ基因與tRNALEU基因間的DNA 片段對(duì)歐洲的7種齒小蠹進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。常虹等(2012)通過對(duì)從我國(guó)口岸截獲的齒小蠹的mtDNA COⅠ基因片段序列的分析，證明了此方法對(duì)齒小蠹屬昆蟲分類鑒定的可行性。基于Ips屬內(nèi)COⅠ核苷酸差異的平均值，Cognato等(2007)認(rèn)為盡管1.0%的堿基差異基本能確定種的界限，但不建議僅利用平均核苷酸差異來(lái)進(jìn)行分類單元的界定，提出將進(jìn)化譜系種(evolutionary lineage species)的概念引入到齒小蠹的鑒定，認(rèn)為序列堿基差異、良好節(jié)點(diǎn)支持率的系統(tǒng)發(fā)育單系群以及明確的形態(tài)鑒別特征是種類劃分的重要依據(jù)。而后，通過對(duì)全球范圍內(nèi)36種齒小蠹的mtDNA COⅠ基因、16S rDNA基因和Elongation Factor-1α基因進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)合形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)了齒小蠹屬1個(gè)新種——香格里拉齒小蠹(I.shangrila)。此外，Knizek等(2017)通過mtDNA COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和形態(tài)特征差異驗(yàn)證了中華齒小蠹的物種有效性。

齒小蠹屬內(nèi)的一些物種存在明顯的種下遺傳分化，表現(xiàn)為明確的地理種群。Lakatos等(2007)基于對(duì)mtDNA COⅠ基因的分析，發(fā)現(xiàn)歐洲和中國(guó)的重齒小蠹為2個(gè)不同的種群。陳大風(fēng)(2013)基于mtDNA COⅠ基因證據(jù)發(fā)現(xiàn)了我國(guó)東北地區(qū)落葉松八齒小蠹不同地理種群的27個(gè)單倍型。Knizek等(2017)提出不同地理來(lái)源的中華齒小蠹在形態(tài)特征上并無(wú)差異，但基于系統(tǒng)發(fā)育分析可以分為南方種群和北方種群。

目前已知的37種齒小蠹屬昆蟲中，除天山重齒小蠹外均有線粒體COⅠ基因序列數(shù)據(jù)，但其中僅包含我國(guó)的落葉松八齒小蠹、光臀八齒小蠹、香格里拉齒小蠹和中華齒小蠹的極少數(shù)樣本。本研究通過對(duì)我國(guó)東北、西北和西南地區(qū)主要針葉林分布區(qū)齒小蠹樣本的采集，基于成蟲形態(tài)特征、宿主植物種類與地理分布，同時(shí)利用與已有種mtDNA COⅠ基因數(shù)據(jù)的序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，對(duì)我國(guó)齒小蠹屬的種類進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定并且提供了DNA數(shù)據(jù)，為后續(xù)該類群的相關(guān)研究提供參考和鑒定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

齒小蠹樣本于2017—2020年間采自中國(guó)東北、西北和西南地區(qū)9個(gè)省份的36個(gè)采樣點(diǎn)，涉及大興安嶺、小興安嶺、長(zhǎng)白山、阿爾泰山、天山、橫斷山脈、喜馬拉雅山、祁連山等主要山脈(表1)。成蟲樣本采集后放入透氣的2.5 mL無(wú)菌離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室。上述采樣點(diǎn)共采集齒小蠹12 062頭，利用奧利巴斯體視顯微鏡(型號(hào): SZX16)觀察并記錄蟲體形態(tài)特征，進(jìn)行初步鑒定。根據(jù)種類初步鑒定結(jié)果、宿主植物種類、地理分布等挑選代表性樣本進(jìn)行詳細(xì)的顯微觀察和DNA提取及mtDNA COⅠ基因序列測(cè)定。利用奧利巴斯體視顯微鏡(型號(hào): SZX7)和佳能EOS 70 D單反相機(jī)組成的成像系統(tǒng)拍攝成蟲形態(tài)照片。

表1 代表性樣本信息Tab. 1 Representative sample information

1.2 基因組DNA提取

DNA提取試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司(型號(hào): EE141)。提取步驟為： 取單頭蟲體加入液氮充分研磨，置于無(wú)菌離心管中； 加入400 μL裂解液，震蕩混勻，使樣本完全懸?。?在上述裂解液中加入7.5 μL RNaseA，充分混勻； 55 ℃孵育15 min； 加入等體積酚-氯仿，震蕩混勻，12 000 r·min-1離心5 min； 小心吸取上層水相于無(wú)菌離心管中，加入等體積異丙醇，充分顛倒混勻； 12 000 r·min-1離心5 min，去上清； 加入500 μL70%乙醇，渦旋震蕩5 s，12 000 r·min-1離心5 min，去上清； 再次離心1～2 min，吸凈殘留液體，晾干DNA沉淀，加入50～200 μL TE溶解DNA； 將DNA溶液置于-20 ℃條件下保存待用。

1.3 目的基因擴(kuò)增與測(cè)序

引物C1-J-2183、C1-N-2611、C1-J-2410和TL2-N-3014(Simonetal., 1994)被用于擴(kuò)增mtDNA COⅠ基因。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，PCR 擴(kuò)增在ABI2720 PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司) 上進(jìn)行，反應(yīng)體系為： 2×PCRmix(杭州寶賽生物科技有限公司, 型號(hào): PM06)15 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，DNA模板1 μL，加入11 μL ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到30 μL的總體積。引物序列及擴(kuò)增條件見表2。擴(kuò)增完成后送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

續(xù)表1 Continued

表2 PCR引物與擴(kuò)增條件Tab. 2 PCR primers and cycling protocols

1.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序獲得的序列輸入BLAST，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的物種信息進(jìn)行序列比對(duì)。而后將測(cè)序獲得的序列與GenBank中下載的36種齒小蠹以及作為外群的2種瘤小蠹的COⅠ基因序列(Cognatoetal., 2007; Lakatosetal., 2007; Knizeketal., 2017)一同導(dǎo)入在線比對(duì)軟件MAFFT v.7 (Katohetal., 2013)中進(jìn)行序列比對(duì)(Alignment)。將比對(duì)后的FASTA文件導(dǎo)入MEGA 7.0 (Kumaretal., 2016)中進(jìn)行剪切使序列矩陣兩端對(duì)齊后，采用最大似然法(maximum likelihood, ML)、最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony, MP)和貝葉斯方法(Bayesian inference, BI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。利用軟件RAxML-HPC v.8.2.3(Stamatakis, 2014)構(gòu)建ML樹，重復(fù)自舉1 000次計(jì)算迭代支持率。利用軟件PAUP * version 4. 0b10(Swofford, 2003)構(gòu)建MP樹，采用啟發(fā)式隨機(jī)搜索，第五堿基方法處理堿基空位，分析條件為數(shù)二等分再連接(TBR)。利用軟件MrBayers3. 1. 2(Ronquistetal., 2003)構(gòu)建BI樹，運(yùn)行jModelTest v. 2.1.7(Darribaetal., 2012)軟件進(jìn)行模型篩選，采用MCMC算法運(yùn)行10 000 000代，使后驗(yàn)概率值小于0.01。利用軟件FigTree v. 1.4.3(http:∥tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)和Adobe Illustrator CS6對(duì)構(gòu)建完成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行編輯、美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征比較

根據(jù)蟲體形態(tài)特征、宿主植物種類、地理分布等挑選出52個(gè)代表性樣本(詳細(xì)信息見表1)，成蟲形態(tài)特征見圖1。

除中華齒小蠹翅盤兩側(cè)各有3齒、十二齒小蠹翅盤兩側(cè)各有6齒之外，其余8種齒小蠹的翅盤兩側(cè)都各有4齒。

中華齒小蠹體型較小，雌雄異型(圖1: A1-A3、B1-B3)。區(qū)分雌雄的最明顯鑒別特征為： 雌蟲第二、三齒形狀相同(圖1: A1、A2)，雄蟲第二齒呈錐形，第三齒上下同寬呈樁型(圖1: B1、B2)。

重齒小蠹、天山重齒小蠹、東喜馬拉雅云杉齒小蠹、香格里拉齒小蠹和西藏重齒小蠹的第二齒和第三齒著生于同一基部(圖1: C1、C2、D1、D2、E1、E2、G1、G2、I1、I2、J1、J2)。其中，天山重齒小蠹雌雄異型，雌蟲第二、三齒的端頭距離較遠(yuǎn)，與一、四齒的端頭等距排列(圖1: E1、E2)。雄蟲第二齒基闊頂尖，第三齒基部狹窄，頂部膨大，形如標(biāo)槍端頭、在四齒中最大(圖1: D1、D2)。西藏重齒小蠹頭部額面中線中部?jī)蓚?cè)有一對(duì)顯著而對(duì)峙的顆瘤(圖1: J3)。

光臀八齒小蠹、落葉松八齒小蠹和云杉八齒小蠹的形態(tài)特征極為相似。落葉松八齒小蠹可由額下部中央無(wú)額瘤(圖1: K3)與光臀八齒小蠹(圖1: F3)和云杉八齒小蠹(圖1: L3)加以區(qū)分。云杉八齒小蠹翅盤底面呈蠟?zāi)?圖1: L2)，而光臀八齒小蠹翅盤底面正常光亮(圖1: F2)。

圖1 中國(guó)齒小蠹成蟲形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characters of adult Ips species from ChinaA： 中華齒小蠹Ips chinensis(雌)； B: 中華齒小蠹I. chinensis(雄)； C: 重齒小蠹I. duplicatus； D: 天山重齒小蠹I. hauseri(雄)； E: 天山重齒小蠹I. hauseri(雌)； F: 光臀八齒小蠹I. nitidus； G: 東喜馬拉雅云杉齒小蠹I. schmutzenhoferi； H: 十二齒小蠹I. sexdentatus； I: 香格里拉齒小蠹I. shangrila； J: 西藏重齒小蠹I. stebbingi； K: 落葉松八齒小蠹I. subelongatus； L: 云杉八齒小蠹I. typographus。1： 側(cè)視圖； 2： 翅盤； 3： 頭部額面。A: I. Ips chinensis (female); B: I. chinensis (male); C: I. duplicatus; D: I. hauseri (male); E: I. hauseri (female); F: I. nitidus; G: I. schmutzenhoferi; H: I. sexdentatus; I: I. shangrila; J: I. stebbingi; K: I. subelongatus; L: I. typographus. 1: Side view; 2: Elytral disk; 3: Facies frontalis.

種檢索表

1(2)翅盤兩側(cè)各有三齒

中華齒小蠹(I.chinensisKurenzov & Kononov)

2(1)翅盤兩側(cè)各有四齒或六齒

3(18)翅盤兩側(cè)各有四齒

4(13)第二齒與第三齒著生于同一基部

5(6)第二齒與第三齒相距很近，位于第一齒、第四齒正中間位置

香格里拉齒小蠹(I.shangrilaCognato & Sun)

6(5)第二齒與第三齒相距較遠(yuǎn)

7(8)第二、三齒與第一齒相距較遠(yuǎn)，與第四齒相距較近

重齒小蠹(I.duplicatusSahlberg)

8(7)四齒等距排列

9(10)頭部額面中心偏下有一較大顆瘤，突出在額面點(diǎn)粒之中

天山重齒小蠹(I.hauseriReitter)

10(9)頭部額面中線中部?jī)蓚?cè)有一對(duì)明顯的對(duì)峙顆瘤

11(12)頭部額面點(diǎn)粒密集

東喜馬拉雅云杉齒小蠹(I.schmutzenhoferiHolzschuh)

12(11)頭部額面點(diǎn)粒不密集

西藏重齒小蠹(I.stebbingiStrohmeyer)

13(4)第二齒與第三齒不著生于同一基部，各自獨(dú)立

14(17)額下部中央有一個(gè)大顆瘤

15(16)翅盤底面光亮，似涂有一層蠟?zāi)?/p>

云杉八齒小蠹(I.typographusLinnaeus)

16(15)翅盤底面光亮

光臀八齒小蠹(I.nitidusEggers)

17(14)額面無(wú)大顆瘤

落葉松八齒小蠹(I.subelongatusMotschulsky)

18(3)翅盤兩側(cè)各有六齒

十二齒小蠹(I.sexdentatusBoerner)

2.2 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

序列比對(duì)結(jié)果顯示，除天山重齒小蠹外(NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)此物種序列)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，與本研究獲得的各條序列堿基相似度最高的序列所對(duì)應(yīng)的物種，都與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，3種系統(tǒng)發(fā)育分析方法(ML、MP、BI)生成了具有一致拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育樹，但系統(tǒng)發(fā)育樹中各個(gè)分支節(jié)點(diǎn)支持率并不完全相同。因此，分別將3種方法產(chǎn)生的節(jié)點(diǎn)支持率標(biāo)注在系統(tǒng)發(fā)育樹的相應(yīng)分支節(jié)點(diǎn)上。系統(tǒng)發(fā)育分析中包含的37種齒小蠹以及作為外群的2種瘤小蠹均有各自獨(dú)立的分支，且有很高的節(jié)點(diǎn)支持率(圖2)。整體上，系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及種間親緣關(guān)系都與前人研究結(jié)果(Cognatoetal.， 2007; Cognato, 2015)一致。本研究測(cè)序的52個(gè)樣本在系統(tǒng)發(fā)育樹上表現(xiàn)為10個(gè)分類單元(Taxa)，分別對(duì)應(yīng)10種齒小蠹(圖2)。

圖2 齒小蠹mtDNA COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the Ips species based on mtDNA COⅠ gene本研究的樣本以粗體顯示； 粗體分支表示BI的后驗(yàn)概率值≥0.9； ≥70%的節(jié)點(diǎn)支持率以ML/MP的形式標(biāo)記在對(duì)應(yīng)分支節(jié)點(diǎn)之前(*為<70%)； 標(biāo)尺： 分支長(zhǎng)度。Sequences generated are printed in bold type. Bold branches indicate posterior probability values ≥ 0.9. Bootstrap values of ML/MP ≥ 70% are recorded at nodes(*means<70%). Scale bars: branch length.

采集自黑龍江省(編號(hào)為HSZH1和HSZH2)的樣本與中華齒小蠹的樣本聚為1個(gè)大的分支，在該分支內(nèi)，來(lái)自河北、青海、四川樣本所代表的中華齒小蠹北方種群，來(lái)自云南樣本所代表的南方種群(Knizeketal.， 2017)，以及與本研究采集的黑龍江樣本各自聚為3個(gè)獨(dú)立的亞支。

采集自西藏自治區(qū)吉隆縣(編號(hào)為JL1、JL2、JL3)的樣本和采集自西藏自治區(qū)亞東縣(編號(hào)為YD1、YD2、YD3)的樣本分別與巴基斯坦和尼泊爾的西藏重齒小蠹樣本以及不丹的東喜馬拉雅云杉齒小蠹樣本聚為一支。

采集自青海(編號(hào)為MXXG)、甘肅(編號(hào)為HZXG1、HZXG2)和西藏(編號(hào)為CCL1、CCL2、DRXG)的樣本與云南和四川的香格里拉齒小蠹樣本聚為一個(gè)分支，其中，西藏樣本獨(dú)自聚為一個(gè)亞支且具有很高的節(jié)點(diǎn)支持率。

云杉八齒小蠹、光臀八齒小蠹、落葉松八齒小蠹和歐洲落葉松八齒小蠹是系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為接近的4個(gè)物種，其中云杉八齒小蠹和光臀八齒小蠹互為姊妹種，落葉松八齒小蠹和歐洲落葉松八齒小蠹互為姊妹種。采集自新疆(編號(hào)為QH、TRY、MYT、LY、ALT、NR、FY)的樣本與歐洲的樣本聚為一個(gè)分支內(nèi)的2個(gè)亞支。采集自我國(guó)東北地區(qū)(編號(hào)為HS、JGL、FHS、DX、BH、SSDG)的樣本與俄羅斯伯力(遠(yuǎn)東地區(qū))的樣本聚為一支。采集自西藏(編號(hào)為L(zhǎng)WQ1、LWQ2、LWQ3)的樣本與云南樣本構(gòu)成的亞支與青海-甘肅亞支(編號(hào)為HZGT、MXGT、QLGT)、林芝亞支(LZGT1、LZGT2)和四川樣本一起構(gòu)成了光臀八齒小蠹分支。采集自新疆(編號(hào)為ABLK、KBLK、LG、TRL)和我國(guó)東北地區(qū)(編號(hào)為HG、MJG、ZH、DGJ)的樣本與先前報(bào)道的我國(guó)東北地區(qū)的2個(gè)落葉松八齒小蠹樣本聚為一個(gè)分支，沒有表現(xiàn)出地域分化。

采集自內(nèi)蒙古(編號(hào)為BY1、BY2)的樣本與先前報(bào)道的重齒小蠹中國(guó)種群的樣本聚為一個(gè)分支，與重齒小蠹?xì)W洲種群分支共同代表重齒小蠹分支。采集自新疆天山沿線(編號(hào)為YN、TS、XTS、XY)的樣本聚為一個(gè)獨(dú)立的分支，與重齒小蠹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最接近。采集自吉林(編號(hào)為MY1、MY2)和四川(編號(hào)為SC)的樣本聚為一個(gè)亞支，與歐洲的十二齒小蠹樣本亞支共同組成十二齒小蠹分支，2個(gè)亞支均有很高的節(jié)點(diǎn)支持率。

3 討論

齒小蠹屬目前共有37個(gè)種，23個(gè)種分布于中北美洲、14個(gè)種分布于歐亞大陸(Cognato, 2015)。本研究對(duì)我國(guó)東北、西北和西南地區(qū)針葉林中的齒小蠹屬昆蟲進(jìn)行了調(diào)查和采集，通過成蟲形態(tài)特征鑒定，結(jié)合基于mtDNA COⅠ基因的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，準(zhǔn)確鑒定出10種齒小蠹在我國(guó)大陸境內(nèi)的分布，占到全球物種的27%、歐亞大陸物種的71.4%，包括： 中華齒小蠹、重齒小蠹、天山重齒小蠹、光臀八齒小蠹、東喜馬拉雅云杉齒小蠹、十二齒小蠹、香格里拉齒小蠹、西藏重齒小蠹、落葉松八齒小蠹和云杉八齒小蠹。

除了mtDNA COⅠ基因之外，核糖體28S也常被用于小蠹亞科昆蟲的分子鑒定，但較少用于齒小蠹的鑒定。截至目前，僅Cognato(2013)報(bào)道了16種齒小蠹的16條28S序列，但該文是為了解決小蠹亞科中的Premnobiini族內(nèi)的分類問題，而非對(duì)齒小蠹屬的種類進(jìn)行鑒定，而且僅選擇了全球37種齒小蠹中一部分(僅16種)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。這16種齒小蠹中在我國(guó)分布的僅3種。因此，由于缺少其他齒小蠹種類的28 序列作為參比序列而無(wú)法進(jìn)行整個(gè)齒小蠹屬的基于28S序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。此外，基于mtDNA COⅠ基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析已被國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)證明可以對(duì)齒小蠹種類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定(Stauffer, 1997; Staufferetal., 2001; Cognatoetal., 2007; 常虹等, 2012; 陳大風(fēng), 2013; Cognato, 2015; Knizeketal., 2017)，本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明，mtDNA COⅠ基因片段不僅可以準(zhǔn)確鑒定不同齒小蠹種類，還能在一定程度上區(qū)分一些種類的種下遺傳分化(Lakatosetal., 2007; Knizeketal., 2017)。與前人研究相比，本研究加入了更多不同地域齒小蠹個(gè)體的mtDNA COⅠ基因片段序列進(jìn)行分析，在系統(tǒng)發(fā)育分支與種類界定一致的基礎(chǔ)上，也發(fā)現(xiàn)了7種齒小蠹的種下遺傳分化。這些結(jié)果包括系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、種下遺傳分化特征都與前人文獻(xiàn)已有報(bào)道高度一致。

盡管云杉八齒小蠹、落葉松八齒小蠹和光臀八齒小蠹3個(gè)種的形態(tài)特征極為相似，但根據(jù)額瘤的有無(wú)和翅盤底面正常光亮/蠟?zāi)钅軌驅(qū)⑺鼈儏^(qū)分開(圖1)。序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析也進(jìn)一步支持了形態(tài)鑒定的結(jié)果，同時(shí)表明3個(gè)種的親緣關(guān)系也最為接近。其中，云杉八齒小蠹是歐亞大陸云杉林中危害最為嚴(yán)重的森林害蟲之一，在歐洲、我國(guó)東北和新疆阿爾泰山地區(qū)、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)和日本北海道地區(qū)均造成過嚴(yán)重危害(Furuta, 1989; Grégoireetal., 2004; 王澤斌等, 2013; 岳朝陽(yáng)等, 2014)。在日本分布的云杉八齒小蠹被認(rèn)為是區(qū)別于歐洲種群的獨(dú)立變型I.typographusf.japonicus(Staufferetal., 2000)。本研究系統(tǒng)發(fā)育分析表明我國(guó)東北地區(qū)的樣本與俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的樣本聚為一支，新疆地區(qū)的樣本與歐洲的樣本聚為一支并且自身也是獨(dú)立的亞支，分析結(jié)果支持我國(guó)東北地區(qū)和新疆地區(qū)的云杉八齒小蠹為2個(gè)已產(chǎn)生遺傳分化的不同地理種群。日本在地理位置上同我國(guó)東北和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)十分接近，但是限于缺少日本樣本的DNA數(shù)據(jù)，所以目前暫無(wú)法確定分布于日本的云杉八齒小蠹是否與分布于我國(guó)東北和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的云杉八齒小蠹為同一種群。

落葉松八齒小蠹一度被國(guó)外研究者認(rèn)為是歐洲落葉松八齒小蠹的同物異名(Woodetal., 1992; Pfeffer, 1995)，但我國(guó)學(xué)者歷來(lái)認(rèn)為是2個(gè)不同的物種(殷惠芬等, 1984; 黃復(fù)生等, 2015)。Stauffer等(2001)認(rèn)為基于線粒體DNA序列和各自伴生真菌的不同應(yīng)分別屬于2個(gè)不同的物種。落葉松八齒小蠹主要分布于歐亞大陸東北部，包括俄羅斯、蒙古、日本、朝鮮、韓國(guó)，以及我國(guó)東北、西北等地(殷蕙芬等, 1984; Staufferetal., 2001; 陳大風(fēng), 2013; Cognato, 2015; 黃復(fù)生等, 2015)。本研究支持亞洲落葉松八齒小蠹與歐洲落葉松八齒小蠹為2個(gè)不同物種的觀點(diǎn)。另外，盡管落葉松八齒小蠹在我國(guó)廣泛分布于新疆和東北地區(qū)，而且宿主也為不同種類的落葉松，但并未出現(xiàn)明顯的遺傳分化現(xiàn)象，在系統(tǒng)發(fā)育樹上仍聚為一個(gè)分支(圖2)，和云杉八齒小蠹表現(xiàn)出了不同的演化規(guī)律。據(jù)Cognato(2015)記載，歐洲落葉松八齒小蠹廣泛分布于歐亞大陸的落葉松林中，在我國(guó)分布于黑龍江、吉林，但并沒有直接的分子證據(jù)。陳大風(fēng)(2013)在我國(guó)東北和華北五省落葉松林中的8個(gè)采樣點(diǎn)，以及本研究在位于我國(guó)東北的13個(gè)采樣點(diǎn)收集的大量樣本，經(jīng)形態(tài)特征比較和分子鑒定均沒有發(fā)現(xiàn)歐洲落葉松八齒小蠹。

光臀八齒小蠹為我國(guó)的特有物種，主要分布于青藏高原以及祁連山等高海拔地區(qū)的云杉林中。本研究中的西藏類烏齊縣采樣點(diǎn)海拔超過3 800 m，是目前已知海拔最高的齒小蠹分布地?；趍tDNA COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出收集自西藏林芝的樣本聚為獨(dú)立的一支，與其他光臀八齒小蠹樣本表現(xiàn)出明顯的種下遺傳分化。

重齒小蠹、天山重齒小蠹、香格里拉齒小蠹、西藏重齒小蠹和東喜馬拉雅云杉齒小蠹的一個(gè)明顯的形態(tài)特征是翅盤兩側(cè)各有四齒，其中第二和第三齒都著生于一個(gè)共同基部(圖1)。重齒小蠹也是一個(gè)歐亞大陸云杉林中廣泛分布的物種，Lakatos等(2007)基于對(duì)mtDNA COⅠ基因的分析，認(rèn)為歐洲和中國(guó)的重齒小蠹為2個(gè)不同種群，本研究也印證了這個(gè)結(jié)果。

天山重齒小蠹在我國(guó)主要分布在新疆天山山脈。本研究自西向東沿伊犁河谷至烏魯木齊天山東段選取了4個(gè)采集點(diǎn)的樣本，系統(tǒng)發(fā)育分析表明天山重齒小蠹沒有發(fā)生明顯的種群分化現(xiàn)象。本研究首次提供了天山重齒小蠹的DNA數(shù)據(jù)。

香格里拉齒小蠹也是我國(guó)的一個(gè)特有物種，最早在2007年由Cognato等(2007)命名。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，青海、四川、甘肅樣本聚為一個(gè)亞支，西藏樣本聚為一個(gè)亞支，云南樣本位于該分支的最外圍，預(yù)示該種內(nèi)可能存在著地域上的種群分化。調(diào)查過程中我們發(fā)現(xiàn)香格里拉齒小蠹與光臀八齒小蠹的分布區(qū)域高度重合，而且二者多共同危害同一棵宿主云杉，光臀八齒小蠹主要入侵宿主植物的主干，香格里拉齒小蠹主要取食宿主植物的側(cè)枝。

西藏重齒小蠹與近緣物種最明顯的形態(tài)區(qū)別為頭部額面中線中部有一對(duì)顯著而對(duì)峙的顆瘤，在中線兩側(cè)，屬內(nèi)只有本種具有2顆額瘤的特征。本研究在西藏自治區(qū)喜馬拉雅山南麓采集到的樣本與此形態(tài)特征吻合(圖1: J3)，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與巴基斯坦和尼泊爾的樣本親緣關(guān)系最為接近，但自己為一個(gè)獨(dú)立種群(圖2)。此外，西藏重齒小蠹最早被Stebbing定名為Tomicusribbentropi和T.blandfordi，Strohmeyer在1908年將其改為現(xiàn)在的拉丁名Ipsstebbingi并沿用至今(Cognato, 2015)。西藏重齒小蠹在我國(guó)的文獻(xiàn)中僅出現(xiàn)過一次(黃復(fù)生等, 2015)，作者將其拉丁名寫為Ipsribbentropi，這一拉丁名在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中從未出現(xiàn)過，系誤用。因此我們建議使用國(guó)際上公認(rèn)的拉丁名Ipsstebbingi(Cognato, 2015)。

東喜馬拉雅云杉齒小蠹是本研究發(fā)現(xiàn)的中國(guó)新紀(jì)錄種，此前被認(rèn)為僅在不丹分布，20世紀(jì)80年代的大暴發(fā)曾經(jīng)毀滅了不丹大面積的云杉林與松林(Schmutzenhofer, 1988)。本研究采集的樣本來(lái)自與不丹接壤的西藏亞東縣，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示所有樣本與不丹樣本聚為一支。東喜馬拉雅云杉齒小蠹與西藏重齒小蠹的地理分布、寄主范圍以及形態(tài)特征較為一致，建議通過DNA分子數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

中華齒小蠹最早于1966年在我國(guó)南方被Kurentzov和Kononov鑒定并描述，由于其與六齒小蠹在形態(tài)學(xué)上極為相似，二者一度被認(rèn)為是同物異名。Knizek等(2017)對(duì)捷克、挪威、俄羅斯的六齒小蠹以及泰國(guó)、老撾和中國(guó)河北、四川、青海、云南四省的中華齒小蠹共24個(gè)樣本的mtDNA COⅠ基因進(jìn)行分析，證明了中華齒小蠹分類學(xué)上的有效性，并且指出文中我國(guó)的中華齒小蠹樣本是20世紀(jì)初在中國(guó)考察過程中采集到的類似于六齒小蠹的樣本。另外他們發(fā)現(xiàn)中華齒小蠹的序列高度變異，系統(tǒng)發(fā)育上表現(xiàn)為南、北2個(gè)種群，但形態(tài)學(xué)上并無(wú)明顯差異。本研究使用的樣本采集自我國(guó)東北黑龍江省的小興安嶺，較前人研究使已知中華齒小蠹的分布范圍大幅擴(kuò)大，用于分析的DNA數(shù)據(jù)已經(jīng)囊括了東北、華北、西北、西南共5個(gè)省份的標(biāo)本，具有較好的代表性。此外，我國(guó)東北地區(qū)的樣本在系統(tǒng)發(fā)育上也表現(xiàn)為區(qū)別于南、北種群的第3個(gè)分支(圖2)。截至目前，中華齒小蠹在我國(guó)東北、華北、西北和西南均有發(fā)現(xiàn)，與殷蕙芬等(1984)記載的六齒小蠹在我國(guó)的分布范圍高度重疊。國(guó)內(nèi)外齒小蠹分類學(xué)研究和公共數(shù)據(jù)庫(kù)中未報(bào)道或記錄過采集自我國(guó)的六齒小蠹標(biāo)本的DNA序列。Knizek等(2017)明確描述了中華齒小蠹與六齒小蠹在形態(tài)上的鑒定特征： 六齒小蠹的第2、3齒基部不相連，而中華齒小蠹的第2、3齒基部相連。然而，殷蕙芬等(1984)有對(duì)我國(guó)六齒小蠹“第2與第3齒連接”的形態(tài)特征描述。因此，殷蕙芬等(1984)描述的六齒小蠹從形態(tài)特征上來(lái)看應(yīng)為中華齒小蠹。綜合已有報(bào)道和本研究結(jié)果，我們推測(cè)我國(guó)可能并無(wú)六齒小蠹分布，之前報(bào)道的六齒小蠹可能均為中華齒小蠹。

十二齒小蠹同樣在歐亞大陸針葉林中廣泛分布，主要危害松屬植物，是目前已知我國(guó)體型最大的齒小蠹，形態(tài)特征為翅盤兩側(cè)各有6齒。本研究的樣本采集自吉林省長(zhǎng)白山和四川省四姑娘山，系統(tǒng)發(fā)育上聚為單獨(dú)的一支，與十二齒小蠹?xì)W洲種群的樣本親緣關(guān)系最近。我國(guó)黑龍江和四川的十二齒小蠹樣本與歐洲的樣本地理距離遙遠(yuǎn)，宿主植物種類也不同。分布于黑龍江的十二齒小蠹主要以紅松(Pinuskoraiensis)為食，分布于四川的十二齒小蠹主要以華山松(P.armandii)為食，分布于歐洲的十二齒小蠹則主要以歐洲赤松(P.sylvestris)為食。地理與宿主植物種類的不同可能共同導(dǎo)致了它們系統(tǒng)發(fā)育上的差異。

齒小蠹傾向于寄生特定屬或種的針葉樹(Cognato, 2015)。本次調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)分布的齒小蠹具有明顯的寄主偏好性。例如，云杉八齒小蠹和落葉松八齒小蠹在我國(guó)的分布地幾乎相同，存在很多同時(shí)發(fā)生于云杉和落葉松混交林的情況。例如，在新疆青河縣采集的落葉松八齒小蠹和云杉八齒小蠹分別來(lái)自2棵緊鄰的西伯利亞落葉松和西伯利亞云杉，二者并沒有出現(xiàn)交叉選擇寄主的現(xiàn)象。本研究涉及的10種齒小蠹中，主要危害云杉屬植物的有5種： 云杉八齒小蠹、光臀八齒小蠹、香格里拉齒小蠹、重齒小蠹和天山重齒小蠹；危害松屬植物的有4種： 西藏重齒小蠹、東喜馬拉雅云杉齒小蠹、中華齒小蠹和十二齒小蠹； 危害落葉松屬植物的1種： 落葉松八齒小蠹。

地理隔離也是齒小蠹分化的重要驅(qū)動(dòng)因素之一。西藏重齒小蠹、東喜馬拉雅云杉齒小蠹和長(zhǎng)葉松齒小蠹在系統(tǒng)發(fā)育上為親緣關(guān)系最為接近的姊妹種，形態(tài)特征也極為相似。上述3種齒小蠹均分布在不丹、尼泊爾、巴基斯坦、印度和我國(guó)西藏自治區(qū)吉隆縣、亞東縣等喜馬拉雅山南坡沿線。喜馬拉雅山南坡峽谷縱橫，獨(dú)特的高山峽谷地貌特征造成了不同峽谷之間生物的地理阻隔(Favreetal., 2015)。這種地理阻隔很可能促進(jìn)了上述3種齒小蠹的分化。與之形成鮮明對(duì)比的是，采集自我國(guó)新疆和東北地區(qū)的落葉松八齒小蠹并沒有發(fā)生明顯的種群分化，很可能是由于我國(guó)東北、東西伯利亞與新疆阿爾泰山之間有大面積針葉林連接，并無(wú)明顯的地理阻隔。

鑒于齒小蠹近緣物種之間的形態(tài)特征十分相近，且分類特征往往是齒的大小、齒間距的大小等不易準(zhǔn)確把握的特征。因此，建議在對(duì)我國(guó)齒小蠹進(jìn)行初步形態(tài)特征鑒定后，可參考寄主以及地理分布等特點(diǎn)，結(jié)合基于mtDNA COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)齒小蠹物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。本研究雖然進(jìn)行了大范圍的樣本采集，提供了我國(guó)目前已知10種齒小蠹的mtDNA COⅠ基因數(shù)據(jù)，但調(diào)查仍未做到對(duì)我國(guó)齒小蠹分布地的全覆蓋。此外，雖然文獻(xiàn)很少記載云貴高原、秦嶺以及我國(guó)東南沿海等地有齒小蠹分布，但是上述地區(qū)分布有大量針葉林，采集與鑒定工作仍需開展。

目前，齒小蠹屬的分類與系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)有了一個(gè)基礎(chǔ)框架，但屬內(nèi)各亞屬以及物種之間的關(guān)系并沒有得到很好地解決(Cognato, 2015)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量的遺傳變異位點(diǎn)被檢測(cè)并且用于小蠹蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究。例如，Godefroid等(2019)利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(RAD: Restriction-site Associated DNA)重建了大小蠹屬(Dendroctonus)(Coleoptera: Scolytinae)的系統(tǒng)發(fā)育、起源時(shí)間和生物地理歷史，以及關(guān)鍵生態(tài)特征的演化。截至目前，齒小蠹屬中已公布了云杉八齒小蠹的全基因組數(shù)據(jù)(Powelletal., 2020)，越來(lái)越多的基因組數(shù)據(jù)的公布將為齒小蠹屬的分類與系統(tǒng)發(fā)育重建提供強(qiáng)力的數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

基于形態(tài)特征結(jié)合mtDNA COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育分析方法可以對(duì)我國(guó)種類豐富、分布廣泛的齒小蠹屬昆蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。本研究共鑒定出10種齒小蠹，包括中華齒小蠹、重齒小蠹、天山重齒小蠹、光臀八齒小蠹、東喜馬拉雅云杉齒小蠹、十二齒小蠹、香格里拉齒小蠹、西藏重齒小蠹、落葉松八齒小蠹和云杉八齒小蠹，提供了種檢索表與每個(gè)種的DNA數(shù)據(jù)。其中，東喜馬拉雅云杉齒小蠹是我國(guó)的新紀(jì)錄種，中華齒小蠹、重齒小蠹、光臀八齒小蠹、十二齒小蠹、香格里拉齒小蠹、西藏重齒小蠹和云杉八齒小蠹7種存在明顯的種下遺傳分化特征。此外，更正了中華齒小蠹的鑒定。本研究為后續(xù)該類群的相關(guān)研究提供了參考和鑒定依據(jù)。