丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

沙雷氏菌PFMP-5發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

利用生防菌防治溫室大棚根結線蟲已逐漸成為當前保護地栽培蔬菜病害防控治理的一種新方法。試驗主要對山西農業(yè)大學植物病理學重點實驗室分離得到的對根結線蟲有明顯防效的生防細菌菌株PFMP-5的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，最適合菌株的發(fā)酵時間為30 h，最佳pH值為7，最佳發(fā)酵溫度為28℃，最佳接種量為5%，最佳裝液量為150 mL，最佳轉速為180 r/min，最佳NaCl濃度為6%。

根結線蟲；沙雷氏菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；PFMP-5

黏性沙雷氏菌（Serratia marcescens），又稱靈桿菌（Bacilus prodigiosus），革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬腸道菌科沙雷氏菌屬，菌體較小，周生鞭毛或極生鞭毛，能運動[1-3]。菌株呈球形，有莢膜，菌落較整齊，在28℃下培養(yǎng)有紅色色素產生，菌落有黏性，呈中心顆粒狀且有惡臭氣味，廣泛存在于水、土壤和食品中[4-5]。

從1990開始逐漸有研究人員發(fā)現，黏質沙雷氏菌可使煙草、黃瓜等植物產生抗病性和抵抗多種病原物[6]。PRESS等[7]研究發(fā)現，黏質沙雷氏菌可誘導煙草、黃瓜等植物產生抗性和抵抗多種病原物的侵襲。黏質沙雷氏菌次生代謝物靈菌紅素可破壞TMV病毒粒體，使其失去侵染能力[8]。齊放軍等[9]和楊瓊等[10-11]分別報道了從罹病甜菜夜蛾蟲體上分離到黏質沙雷氏菌致病菌株QL01，QL09和B30，對甜菜夜蛾幼蟲有致死作用。鄧彩萍等[12-13]從光肩星天牛（Anoplophora glabripennis（Motschulsky））刻槽中分離的黏質沙雷氏菌BH-1對光肩星天牛低齡幼蟲（濃度為7.8×1010cfu/mL）的致死率可達80.6%。金虹等[14]報道了黏質沙雷氏菌對寬須蟻蝗（Myrmeleotettix palpalis（Zubovsky））若蟲的毒殺作用。黏質沙雷氏菌菌株SRM和EML-SE1分別對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera Hübner） 和小菜蛾（Plutella xylostella L.）幼蟲有較高的致病力[15-16]。黏質沙雷氏菌PS-1是首次從罹病黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata（Fabricius））幼蟲體分離篩選的、對黃曲條跳甲有很高致病性的菌株[17]。

郭堅華等[18]研究表明，在溫室和田間小區(qū)試驗中，沙雷氏菌對辣椒青枯病都有一定的防治效果。陶科等[19]研究證明，沙雷氏菌HR-3是蝗蟲的致病菌。山西農業(yè)大學植物病理學根結線蟲課題組前期研究發(fā)現，一株生防細菌PFMP-5對根結線蟲有很好的毒殺作用。

本研究主要對PFMP-5菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為該菌后期的大規(guī)模生產提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基的制備

蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，蔗糖10 g，水1 000 mL，將制成的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝入三角瓶中（150 mL/瓶），然后將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋115℃滅菌30 min。

1.2 單一因素試驗

發(fā)酵條件的優(yōu)化主要采用單一因素試驗分析，主要優(yōu)化指標及其設計包括：碳源（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖及淀粉），氮源（硝酸鉀、硫酸銨、谷氨酸、蛋白胨、硝酸銨），pH值（4，5，6，7，8，9），溫度（26，28，30，32，34℃），接種量（1%，3%，5%，7%，9%），培養(yǎng)時間（6，12，24，30，36，48 h），裝液量（90，110，130，150，170 mL），轉速（0，60，120，180，240 r/min），NaCl濃度（4%，6%，8%，10%，12%），在30℃的條件下恒溫培養(yǎng)24 h，定期用分光光度法測定其OD600吸光值，每處理重復3次，以確定各個因素的最佳值。

1.3 數據分析

采用SPSS軟件進行數據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

從圖1可以看出，沙雷氏菌PFMP-5對5種碳源均有不同程度的利用，其中對乳糖的利用率最低，OD600值僅為0.74。對麥芽糖、葡萄糖的利用率相差略微，對蔗糖的利用率最高，其OD600值達到了1.35。因此，最佳碳源為蔗糖。

2.2 不同氮源對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

從圖2可以看出，對沙雷氏菌PFMP-5的生長抑制性最強的是硝酸銨，其OD600值僅有0.91。硝酸鉀、硫酸銨和谷氨酸對菌株的生長影響較小，OD600值分別為2.40，2.04和3.06，蛋白胨對沙雷氏菌PFMP-5的生長最有益，經檢測其OD600值為3.54。因此，最佳氮源為蛋白胨。

2.3 不同發(fā)酵時間對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

從圖3可以看出，沙雷氏菌PFMP-5在培養(yǎng)6～12 h時處于其生長的調整期，12～30 h屬于生長繁殖的對數期，菌量增長速度很快。培養(yǎng)30 h后，沙雷氏菌PFMP-5開始生長緩慢。表明最適合菌種的發(fā)酵時間為30 h。

2.4 不同pH值對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

由圖4可知，pH值的變化對沙雷氏菌PFMP-5的生長影響非常明顯，以pH值7為最高點，兩邊呈下降趨勢，強酸和強堿的環(huán)境都會抑制沙雷氏菌PFMP-5的發(fā)酵。當pH值為7時，OD600值最高，可達3.93。因此，該菌株培養(yǎng)的最佳pH值為7。

2.5 不同發(fā)酵溫度對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

從圖5可以看出，培養(yǎng)溫度對沙雷氏菌PFMP-5的生長繁殖有明顯的影響。28℃作為一個最高點，之后隨著溫度的升高，OD600值在下降，當溫度達到34℃時，OD600值最低，僅為0.22。同樣，溫度低于28℃也不利于該菌的生長。在28℃時該菌生長最快，OD600值為0.50。因此，該菌株的最佳發(fā)酵溫度為28℃。

2.6 不同接種量對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

由圖6可知，接種量對PFMP-5的生長狀況影響較大。其中，接種量1%，3%，5%，7%，9%的OD600值依次為1.15，1.68，2.30，1.66，1.53，因此，5%為最佳接種量。

2.7 不同裝液量對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

由圖7可知，裝液量的多少對沙雷氏菌PFMP-5的生長狀況影響不大。OD600值在150 mL時最高，裝液量增加至170 mL時，OD600值降低，為2.35，裝液量下降至130，110，90 mL時，OD600值也隨之降低，分別為2.38，2.22，1.08，因此，發(fā)酵最佳裝液量為150 mL。

2.8 不同轉速對沙雷氏菌PFMP-5生長的影響

由圖8可知，轉速對沙雷氏菌PFMP-5的生長有明顯影響，當轉速為0，60 r/min時，該菌數量處于低水平，其OD600值分別為0.63和0.72。逐漸增加轉速值至120，180 r/min時，沙雷氏菌PFMP-5增長加快，其OD600值分別為1.36和2.21，而轉速值增至240 r/min時，沙雷氏菌PFMP-5數量開始下降，OD600值為1.68，因此，發(fā)酵培養(yǎng)的最佳轉速為180 r/min。

2.9 不同NaCl濃度對沙雷氏PFMP-5生長的影響

由圖9可知，NaCl濃度對沙雷氏菌PFMP-5的生長影響明顯。當NaCl濃度為6%時，OD600值最高，達到2.08。調低NaCl濃度至4%時，OD600值降至1.45。而當NaCl濃度高于6%時，OD600值降至1.0左右。所以，最適NaCl濃度為6%，此時對沙雷氏菌PFMP-5的生長繁殖最有利。

3 結論與討論

本研究通過沙雷氏菌PFMP-5菌株的發(fā)酵時間、接種量、裝液量、NaCl濃度、pH值、發(fā)酵溫度、轉速、碳源及氮源等發(fā)酵條件篩選試驗，篩選出該菌的最優(yōu)發(fā)酵條件為：最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是蛋白胨，最適合菌株的發(fā)酵時間為30 h，最佳pH值是7，最佳發(fā)酵溫度為28℃，最佳接種量為5%，最佳裝液量為150 mL，最佳轉速為180 r/min，最佳NaCl濃度為6%。

此外，沙雷氏菌在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護、紡織染料方面具有廣闊的應用前景和巨大研發(fā)價值，尤其是沙雷氏菌的次生代謝產物靈菌紅素，已發(fā)現具有多種生物活性作用，能抗癌、抗微生物、抗瘧疾、抗霉、免疫抑制的作用[20-21]。尤其在抗癌方面，因其具有癌組織的高針對性和對正常細胞則表現的低毒害作用，是一種非常有潛力的抗癌物質[22]。但是有關沙雷氏菌防治植物病害的報道仍然較少，本研究將沙雷氏菌初步應用于根結線蟲的室內防治中，但是要將其應用到根結線蟲的生產防治中還需要進一步的探索和實踐。

［1］曹毅.受根結線蟲侵染的煙草根際細菌群落特征及南方根結線蟲伴生細菌多樣性研究[D].昆明：云南大學，2015.

［2］劉郵洲，羅楚平，劉永鋒，等.黏質沙雷氏菌C8-8幾丁質酶基因的克隆與表達[J].江蘇農業(yè)學報，2012，28（3）：487-491.

［3］鄧丹丹.靈桿菌非特異性核酸酶的固定化及酶學特性研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2013.

［4］黃文芳.黏質沙雷氏菌（Serrtia marcescens）的研究I：黏質沙雷氏菌9-2菌株分離、分類鑒定和形態(tài)特征[J].華南師范大學學報（自然科學版），2003（3）：108-111.

［5］黃文芳，諸瑜.黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）研究：營養(yǎng)基質和不同色光對黏質沙雷氏菌生長的影響[J].華南師范大學學報（自然科學版），2005（1）：86-89.

［6］易圖永，謝丙炎，張寶璽，等.辣椒疫病的發(fā)生、危害及其防治研究進展[J].中國辣椒，2002（2）：10-13.

［7］PRESS C M，WILSON M，TUZUN S，et al.Salicylic acid produced by Serratia marcescens 902166 is not the primary determinant of induced systemic resistance in cucumber or tobacco[J].Mol Plant Microbe Interact，1997，10：761-768.

［8］畢建華，楊金廣，歐陽明安，等.黏質沙雷氏菌次生代謝物對TMV的抑制機理[J].中國農業(yè)科學，2014（5）：912-922.

［9］齊放軍，劉纓，季志英.一種新的甜菜夜蛾致病菌的分離和鑒定[J].植物保護學報，2004，31（2）：223-224.

［10］楊瓊，周宇，韓光杰，等.兩種甜菜夜蛾致病菌的分離、鑒定及殺蟲成分初步分析[J].江蘇農業(yè)學報，2012，28（6）：1267-1271.

［11］BULLA L A，JR RHODES R A，JULIAN G S.Bacteria as insect pathogens[J].Annual ReviewofMicrobiology，1975，29：163-190.

［12］鄧彩萍，閏喜中，劉紅霞，等.光肩星天?？滩壑幸环N細菌及其對天牛幼蟲的致病性[J].中國生物防治，2008，24（3）：244-248.

［13］鄧彩萍，劉紅霞，閏喜中，等.罹病光肩星天牛幼蟲分離菌株16S r DNA系統(tǒng)發(fā)育分析 [J].安徽農業(yè)科學，2008，36（18）：7672-7673，7682.

［14］金虹，葛紹榮，陶勇，等.一株蝗蟲病原茵的鑒定及其毒力和病理研究[J].微生物學報，2005，45（2）：172-176.

［15］JEONGH U，MUN H Y，KEUN OH H，et al.Evaluation of insecticidal activity of a bacterial strain，Serratia sp.EML-SE1 against diamondback moth[J].The Journal of Microbiology，2010，48（4）：541-545.

［16］MOHANM，SELVAKUMAR G，SUSHIL S N.Entomopathogenicity of endophytic Serratia marcescens strain SRM against larvae of Helicoverpa armigera（Noctuidae:Lepidoptera）[J].World Journal ofMicrobiology and Biotechnology，2011，27：2545-2551.

［17］楊建云，紀春艷，凌冰，等.黃曲條跳甲幼蟲致病菌的鑒定及其對黃曲條跳甲的殺蟲活性研究 [J].中國生物防治學報，2014，30（3）：434-440.

［18］郭堅華，郭亞輝，張立新，等.辣椒青枯病拮抗菌株的篩選及田間防效測定[J].中國生物防治，2001，17（3）：101-106.

［19］陳秀為，范寰，陳融，等.黏質沙雷氏菌對棉鈴蟲、菜青蟲致病力及田間控制的研究初報 [J].天津農學院學報，2001，8（3）：28-30.

［20］WILLIAMSON N R，FINERAN P C，GRISTWOOD T，et al.Anticancer and immunosuppressive properties of bacterial prodiginines [J].Future Microbiology，2007，2（6）：605-618.

［21］FENDER J E，BENDER C M.Serratia marcescens quinoprotein glucose dehydrogenase activity mediates medium acidification and inhibition of prodigiosin production by glucose[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（17）：6225-6235.

［22］李洪波，杜巍，趙凱，等.靈菌紅素研究進展[J].生物技術通訊，2011，22（1）：139-142.

Optimization of Ferment Conditions of Serratia marcescens PFMP-5

DINGLei，XUYumei，WANGJianming

（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Biocontrol of root-knot nematodes（Meloidogyne）by bacteria has become a new method of vegetable disease management in greenhouse.A bacterial strain PFMP-5 isolated with high preventive and therapeutic effect to root-knot nematodes.In this paper,the optimum composition ofculture medium and cultivation parameters of strain PFMP-5 was studied.The result showed that the optimum condition were as following:the optimal carbon source was sucrose,the optimal nitrogen source was peptone,the optimal ferment time was 30 hours,the best pH was 7,the optimal ferment temperature was 28℃,the proportion of inoculum was 5%,the ideal volume was 150 mL,the rotation speed was 180 r/min and the best NaCl concentration was 6%.

root-knot nematodes;Serratia marcescens;optimization offerment conditions;PFMP-5

Q93-335；S476

A

1002-2481（2017）03-0386-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.16

2016-10-26

山西省科技攻關項目（20120311019-3）；山西省應用基礎研究計劃項目（201601D202072）

丁 磊（1991-），男，山西隰縣人，在讀碩士，研究方向：線蟲分類及綜合治理。王建明為通信作者。