宋釘町 馬博 曹博威 來比江·吾斯曼 張文斌

胃癌（gastric cancer，GC）是胃腸道一種常見的惡性疾病，相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，胃癌已成為全球第五大癌癥，是繼肺癌、結(jié)直腸癌和肝癌的第四大死亡原因[1]。在我國(guó)，盡管胃癌的發(fā)病率和死亡率都在下降，但仍處于世界較高水平，且存在性別和年齡差異，疾病負(fù)擔(dān)集中在高齡人群，而我國(guó)的人口老齡化逐漸加重，了解其可能的發(fā)病機(jī)制，并實(shí)施精準(zhǔn)性防控策略刻不容緩[2-3]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，microRNA（miRNA）在胃癌的早期診斷、疾病干預(yù)和預(yù)后評(píng)價(jià)中發(fā)揮了越來越重要的作用。miRNA 是單鏈、高度保守的小分子非編碼RNA，含有20～24 個(gè)寡核苷酸，以組織特異性的方式表達(dá)。miRNA 主要是通過與目標(biāo)mRNA 3'非編碼區(qū)的堿基配對(duì)進(jìn)行交互作用，利用mRNA 的降解或翻譯抑制，對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，到現(xiàn)在為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多達(dá)30%的人類基因的表達(dá)都受到它的調(diào)控，并對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞增殖、凋亡，以及新陳代謝等重要的生理過程產(chǎn)生影響[4-5]。胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多因素調(diào)控的持續(xù)而復(fù)雜的生物學(xué)過程，在此過程中miRNA 發(fā)揮著重要的作用[6]，但其機(jī)制尚不明確。因此，我們將以人胃癌細(xì)胞SGC-7901 為切入點(diǎn)，從細(xì)胞和分子兩個(gè)層面，深入探討miR-25 在人胃癌細(xì)胞SGC-7901 增殖、侵襲、遷移、凋亡等方面的作用及其可能的作用機(jī)制，為闡明miR-25在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞SGC-7901 購(gòu)自普諾賽（貨號(hào)：CL-0206），采用上海生工生物工程股份有限公司制備的miR-25 及內(nèi)參U6 引物，使用從杭州朗基科技儀器有限公司采購(gòu)的熒光PCR 定量分析（型號(hào)：Q2000B），使用Elabscience 公司生產(chǎn)的Annexin V-APC/7-AAD 雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E-CK-A218），從合肥白鯊生物科技有限公司購(gòu)入總RNA 提取試劑（貨號(hào)：BS259A），自北京凱奧科技發(fā)展有限公司購(gòu)入酶標(biāo)儀及超微量分光光度計(jì)（型號(hào)：K5800），CCK-8（貨號(hào)：BA00208）、beta-Actin（貨號(hào)：bs-0061R）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）抗體（貨號(hào)：bs-0086R）均購(gòu)于中國(guó)Bioss 公司，從Solarbio 公司購(gòu)入BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：PC0020），細(xì)胞流式儀（型號(hào)：LSRII）購(gòu)自BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的人胃癌細(xì)胞SGC-7901從液氮罐中取出，37 ℃水浴鍋中解凍復(fù)蘇，室溫下每分鐘1 000 r，離心5 min，棄去上清液，轉(zhuǎn)入60 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的生長(zhǎng)密度，達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)皿面積的90%左右時(shí)，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 6 孔板一個(gè)孔接種（1～4）×105個(gè)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，第二天觀察細(xì)胞密度在40%～60%時(shí)，進(jìn)行慢病毒感染。根據(jù)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的MOI=10，分別往細(xì)胞中加入滴度為1×108TU/mL 的空載慢病毒和干擾慢病毒200 μL，分別設(shè)置正常組、miR-25 干擾慢病毒組和miR-25 干擾慢病毒空載組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-25的轉(zhuǎn)染效率 收集3 組人胃癌細(xì)胞SGC-7901，提取總RNA 并檢測(cè)純度及濃度。遵逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列設(shè)計(jì)miR-25 的qRT-PCR 引物（F-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA） 及U6 的qRTPCR 引物（F-AGCACATATACTAAAATTGGAACGAT），PCR 擴(kuò)增以cDNA 為模板進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為10 μL。將提取的RNA 吸取2 μL 用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（cell counting kit-8，CCK-8）慢病毒感染成功后，在96 孔平板中接種細(xì)胞[（1～2）×104細(xì)胞]并培養(yǎng)24 h，在每個(gè)孔中添加10 μL 的CCK-8 溶液，并持續(xù)在培養(yǎng)箱中溫育1～4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 Matrigel 膠按1∶8的比例用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋，將Transwell 小室底部膜覆蓋在上室表面，在37 ℃下放置4 h，讓Matrigel 聚合為凝膠，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2～3 min 的消化，然后停止消化，離心，將培養(yǎng)基取出，用PBS 沖洗2 次，再用無血清的培養(yǎng)基重新懸浮。將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到每毫升1.0×105。在Transwell 小室內(nèi)添加100 μL 的細(xì)胞懸液。在24 孔平板下腔中添加750 μL 含血清的培養(yǎng)基，將小腔置于平板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（cell scratch assay） 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，用marker 筆在6 孔板背后，每隔1 cm均勻的劃一條橫穿過孔的基準(zhǔn)線，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化重懸為細(xì)胞懸液，約5×105個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種至6 孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。使用同一20 μL 槍頭以直尺輔助垂直基準(zhǔn)線劃痕，使不同孔之間的劃痕寬度盡量一致，使用PBS 清洗3 次，去除游離細(xì)胞，觀察劃痕處清晰筆直且無細(xì)胞殘留，以基準(zhǔn)線輔助拍攝0、24 h 照片。計(jì)算公式：傷口愈合百分比=[初始面積（0 h）-24 h 的面積]/初始面積×100%。

1.2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的不同組分的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用Annexin V-APC/7-AAD染色，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting） 完成細(xì)胞蛋白抽提后，嚴(yán)格按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，以目標(biāo)蛋白的分子量為依據(jù)，選用10%配膠試劑盒配膠，待檢測(cè)蛋白樣品上樣量為20 μg/孔，待膠凝固之后，將膠連同玻璃板從架子上拿下，裝進(jìn)電泳內(nèi)槽中，加樣面向內(nèi)，將內(nèi)槽放進(jìn)電泳外槽中，在內(nèi)槽中加滿電泳液（要注意內(nèi)槽安裝的密封性，避免漏液），在外槽中加入電泳液到內(nèi)槽高度約1/3 處。接上電源，用50～85 V的低壓讓試樣穿過濃縮膠，30 min 后，等蛋白質(zhì)分子達(dá)到分離膠時(shí)，再把電壓提高到100～130 V，直至溴酚藍(lán)達(dá)到膠體的最底面（大約1.5 h），切斷電源，停止電泳，封閉，轉(zhuǎn)模，溫育，然后把試樣放到膠體成像儀上進(jìn)行圖像處理，并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均以SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-25 的表達(dá)水平

與正常組miR-25 表達(dá)水平[（1.003±0.098）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（0.287±0.122）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.160，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組miR-25 表達(dá)水平[（0.803±0.151）%]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.026，P＞0.05）。見圖1。

2.2 抑制miR-25 表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 增殖的影響

與正常組增殖率[（100±0）%]相比，miR-25干擾慢病毒組[（64.81±8.67）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.260，P＜0.05）；正常組與miR-25干擾慢病毒空載組增殖率[（93.17±9.49）%]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.039，P＞0.05）。

2.3 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲性結(jié)果

將Transwell 小室放入顯微鏡下，隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，計(jì)算通過基底膜的細(xì)胞數(shù)目。與對(duì)照組[（287.7±11.5）個(gè)]相比，miR-25 干擾慢病毒組侵襲能力[（190.7±10.02）個(gè)]明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.201，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的侵襲能力[（304±10.58）個(gè)]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.039，P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞侵襲結(jié)果

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力結(jié)果

完成實(shí)驗(yàn)后，從0、24 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察細(xì)胞遷移的面積（200×），進(jìn)而計(jì)算遷移率。與對(duì)照組遷移率[（69.53±7.34）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（46.56±9.251）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.251，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的遷移率[（61.845±9.759）%]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.477，P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞劃痕結(jié)果

2.5 人胃癌細(xì)胞SGC-7901 凋亡結(jié)果

與正常組細(xì)胞凋亡率[（15.13±3.36）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（22.17±3.15）%]更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.591，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組細(xì)胞凋亡率遷移率[（15.360±0.821）%] 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.004，P＞0.05）。流式圖Q1 表示這一部分的細(xì)胞是壞死的，但也可能存在少量的后期凋亡的細(xì)胞或是被機(jī)械破壞的細(xì)胞。Q2 代表此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。Q3 代表此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。Q4 代表此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。見圖4。

圖4 各組SGC-7901細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.6 人胃癌細(xì)胞SGC-7901 中TGF-β 蛋白表達(dá)情況

與正常組TGF-β 蛋白表達(dá)量[（0.610±0.03）mg/mL]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（0.751±0.03）mg/mL]顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.501，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的TGF-β 蛋白表達(dá)量[（0.751±0.030）mg/mL]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.485，P＞0.05）。各組樣本中TGF-β 蛋白表達(dá)量條帶見圖5。

圖5 各組樣本中TGF-β蛋白表達(dá)量條帶圖

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA 的表達(dá)異常與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[7-11]。miR-25 定位在人7q22.1 染色體上的miRNA-7 上[12]，Guo 等[7]的研究表明miR-25 通過直接抑制B 細(xì)胞易位基因2（BTG2）的表達(dá)促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展，miR-25 的敲除有助于抑制食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者血漿外泌體中的miR-25 表達(dá)水平明顯高于健康人群，且與食管癌組織中的表達(dá)量呈正相關(guān)，提示外泌體miR-25 可作為食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物[13]。Hesari 等[14]對(duì)乳腺癌患者的研究表明，miR-25 的表達(dá)降低與其臨床分期、轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間顯著相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-25 在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)水平與外周浸潤(rùn)、病理分級(jí)、腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特點(diǎn)有很強(qiáng)的相關(guān)性，它還會(huì)對(duì)患者的5 年生存率產(chǎn)生影響，可以作為評(píng)價(jià)患者預(yù)后的一種重要的腫瘤標(biāo)志物。我國(guó)學(xué)者對(duì)結(jié)腸癌的一項(xiàng)研究顯示，miR-25-3p 在結(jié)腸癌患者中明顯增高，且與患者的臨床病理指標(biāo)呈正相關(guān)，是結(jié)腸癌診斷及判斷患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物[15]。miR-25是一個(gè)在胃癌組織中高表達(dá)的微小RNA，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)miR-25 可顯著抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)其凋亡。本項(xiàng)目擬深入研究miR-25 對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并在分子水平上闡明其可能的作用機(jī)制。

TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)在包括癌癥在內(nèi)的炎癥性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。TGF-β 通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和刺激細(xì)胞凋亡來維持哺乳動(dòng)物組織的穩(wěn)態(tài)。癌細(xì)胞過度產(chǎn)生TGF-β 導(dǎo)致局部纖維化和免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并與癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性行為相關(guān)[16]。人體內(nèi)大多數(shù)有核細(xì)胞都有分泌TGF-β 的能力，在癌癥發(fā)生時(shí)，TGF-β 主要由腫瘤浸潤(rùn)區(qū)的腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌[17]，主要是通過上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]，在此信號(hào)途徑被活化之后，可以使上皮細(xì)胞更具有侵襲性，從而增加上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和遷移能力[19]。同時(shí)，TGF-β通過刺激B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞凋亡，引發(fā)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，阻止腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的激活，讓腫瘤逃脫宿主免疫的監(jiān)視[20-21]。有研究表明，阻斷TGF-β 信號(hào)通路可有效阻止癌細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生EMT[22]。一項(xiàng)關(guān)于胰腺癌（PC）的研究表明，在PC 早期，TGF-β 是一種具有抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活自噬，通過基質(zhì)成纖維細(xì)胞抑制生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)，抑制炎癥，抑制血管生成，從而保持正常組織動(dòng)態(tài)平衡的重要的腫瘤抑制因子，而在PC 晚期，通過誘導(dǎo)EMT 逃避細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，促進(jìn)晚期腫瘤的進(jìn)展[23-24]。但TGF-β 對(duì)早期腫瘤的抑制作用如何被癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性反應(yīng)所取代的機(jī)制尚不明確[25]。由于TGF-β 的表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，且其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同于細(xì)胞因子，因此TGF-β 及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為靶向治療提供了新思路，目前研究最廣泛的化合物是TβRⅠ抑制劑Galunisertib，也被稱為L(zhǎng)Y2157299，已被證明具有在體外抑制肺癌和乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[26]。

為進(jìn)一步證實(shí)并探討miR-25 對(duì)TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，本研究通過降低胃癌細(xì)胞miR-25 表達(dá)并對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 進(jìn)行了TGF-β 蛋白的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在miR-25 干擾慢病毒組中，TGF-β 蛋白表達(dá)量顯著增加。進(jìn)一步驗(yàn)證，miR-25 通過TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)胃癌增殖和轉(zhuǎn)移。但本研究未展開探討miR-25 調(diào)控TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制及其是否對(duì)除早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白2（EGR2）[27]、富含半胱氨酸蛋白（RECK）[28]、磷酸酶與張力蛋白同源物基因（PTEN）[29]、BTG2[30]等已知的基因以外的某些基因具有靶向調(diào)控作用從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，這將是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

綜上所述，miR-25 表達(dá)下調(diào)可顯著抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的增殖、遷移和侵襲能力，并可促進(jìn)其凋亡，從分子水平進(jìn)一步闡明胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，本研究將有助于深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)理，并可能為胃癌的防治提供新的思路。