吳呈霖 王梅芳 雷懷定

近50年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加，已經超過其他腫瘤，成為威脅人類健康的“殺手之一”[1]。據人群統(tǒng)計學大數據顯示，在男性人群中，肺癌的發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤的第一位；在女性人群中，肺癌占據第二位[2]。目前肺癌的治療以手術為主，但術后復發(fā)率高，效果不佳[3]。因此，尋找更好的基因治療靶點，為臨床上肺癌患者提供新的治療思路，仍然具有十分重要的意義。

RNA干擾(shRNA)技術可以有效沉默基因表達，該過程主要通過雙鏈RNA(dsRNA)使目標基因相應的mRNA選擇性失活得以實現的[4]。shRNA干擾技術是通過短反義核酸鎖定細胞mRNA，從而實現其隨后的降解。其反過來又阻斷了該蛋白的進一步表達/聚集，導致其水平下降，抑制基因表達[5]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。有研究發(fā)現Survivin基因在鼻型NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)病發(fā)展過程中具有高表達的特性，并且與p53、bcl-2蛋白的表達具有相關性[6]。本文旨在探討shRNA干擾 Survivin質粒對腫瘤細胞的增殖，凋亡和遷移的影響。

資料與方法

一、實驗材料

1. 肺腺癌細胞系A549的培養(yǎng): 本實驗以人肺腺癌細胞系A549為實驗材料。所有細胞購自中科院上海細胞研究院。細胞經離心收集后，以2×104/cm2的密度將其種植于25×25 cm2的培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)，而后將細胞進行后續(xù)實驗。

2. 構建shRNA干擾 Survivin慢病毒載體: sh RNA Survivin質粒由上海吉凱公司合成，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質粒的克隆載體。shRNA干擾 Survivin載體病毒載體的克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為ENST00000003424。經過基因測序，從而證明序列的正確性。

三、實驗方法

1. 實驗分組: 將A549細胞分成3組，即空白對照組，空白病毒載體對照組和shRNA干擾 Survivin慢病毒載體組?？瞻讓φ战M為未做任何處理的細胞組，空白病毒載體對照組是經空白載體的慢病毒轉染的細胞組，shRNA干擾 Survivin組是由shRNA干擾 Survivin慢病毒的干擾載體構建的慢病毒轉染細胞組。以ZsGreen為慢病毒熒光探針，用熒光顯微鏡觀察細胞慢病毒的轉染效率。

2. 實時熒光定量PCR檢測: 3組細胞在融合率達80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化后放入15 ml離心管中，加入1 ml的Trizol RNAiso，裂解細胞，提取RNA后根據Takara逆轉錄試劑盒(DRR820A,Takara，日本)的說明書進行實驗，將逆轉錄的cDNA保存在4 ℃冰箱中備用。根據Takara熒光定量PCR試劑盒的說明書的要求，采用20 μl的反應體系，加入各樣品，進行熒光定量PCR的檢測。采用FS2000系統(tǒng)對PCR進行分析，反應條件預設為預變性95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)。溶解曲線：95 ℃ 5 s； 60 ℃ 1 min。降溫： 50 ℃ 30 s，1個循環(huán)。內參基因GAPDH和表皮成纖維細胞的標志物小鼠抗波形蛋白(Vimentin)引物由上海生工公司生產，見表1。采用2-△△Ct的方法計算目的基因的相對表達量。

表1 目的基因的引物序列

3. Western-blot檢測: 3組細胞處理后，加入1 ml RIPA細胞裂解液，各組細胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的離心管中，在預冷4 ℃的離心機中離心，預設：以離心半徑8 cm，5 000 r/min，離心5 min后提取上清，經95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后電泳分離，轉PVDF膜后孵育一抗，在4 ℃冰箱避光孵育過夜(>12 h)。Survivin一抗(ab76424, Abcom公司，中國)經一抗稀釋液1︰10 000稀釋后加入樣本離子膜。第2天用PBST稀釋液洗膜，重復3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗(P-2771MP, ThermoFisher,中國)經二抗稀釋液1︰1 000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復3次，而后用DAB顯影液處理樣本。Image J軟件分析蛋白條帶。

4. Transwell小室實驗檢測細胞的遷移: 將空白對照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照試劑盒(康寧Transwell小室3402，Costar)的說明書，將基底膜的基質原液放在冷藏冰箱(4 ℃)過夜融化，然后與預冷的無血清的RPMI-1640按照1︰3的比例配置侵襲上室凝膠液體，以每孔55 μl的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成膠。然后上室每孔接種200 μl不含血清的細胞培養(yǎng)液，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μl。然后將Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)24 h后用結晶紫染色。然后將Transwell板用倒置光學顯微鏡，拍照，并且進行細胞計數。所有實驗均重復3次。

5. CCK-8實驗檢測細胞的增殖: 將空白對照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照CCK-8試劑盒(CA1210,索萊寶，中國)的說明書，將3組轉染后的細胞接種在96孔板中，轉染細胞以每孔5 000個/100 μl的接種量接種，72 h后每孔加入10 μl的CCK-8的試劑，放到37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)2 h。然后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，每組設置3個復孔。

6. AV-PI雙染檢測細胞的凋亡: 將空白對照組，空白病毒載體組，shRNA干擾 Survivin載體病毒組等細胞經胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI的試劑盒的說明書(4830-01-1，深圳紐邦，中國)檢測3組細胞的凋亡率。流式細胞儀分析各組樣本，計算各組的凋亡率,凋亡率的計算=(早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數)/細胞總數。Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡和壞死細胞，Annexin V-/PI-為具有正常活性的細胞。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、shRNA干擾 Survivin病毒載體的構建和轉染

慢病毒轉染效率，見圖1。慢病毒滴度的檢測結果：shRNA干擾 Survivin病毒組的慢病毒的滴度為1×108TU/ml，這說明慢病毒轉染細胞具有較高的轉染效率。

圖1 shRNA干擾 Survivin載體病毒載體的轉染；注：用0.11 μl和0.033 μl慢病毒轉染肺癌細胞系A549細胞，慢病毒滴度的檢測結果：shRNA干擾 Survivin載體病毒組慢病毒的滴度為1×108 TU/ml

二、Transwell實驗檢測細胞的遷移

Transwell實驗結果顯示，空白對照組中透過分子篩的細胞數為(131.32±18.39，n=3)，空白載體病毒對照組中透過分子篩的細胞數為(142.11±14.02，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組中透過分子篩的細胞數為(52.11±4.09，n=3)。三組之間比較具有明顯的統(tǒng)計學差異(F=31.982，P<0.05)。其中shRNA干擾 Survivin載體病毒組和空白載體病毒組相比，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)說明shRNA干擾 Survivin載體病毒組細胞的遷移比空白載體病毒組細胞數少，見圖2。

圖2 Transwell實驗檢測細胞的遷移檢測結果；注：A：空白對照組；B：空白載體病毒對照組；C：shRNA Survivin慢病毒載體組

三、CCK-8檢測細胞的增殖

CCK-8檢測結果顯示，空白對照組細胞的增殖率(%)為(60.34±1.24，n=3)，空白載體病毒對照組的增殖率(%)為(51.12±2.47，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組的增殖率(%)為(24.27±3.11，n=3)，三組比較有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒對照組比較具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)提示shRNA干擾 Survivin載體病毒組細胞的增殖率比空白載體病毒對照組低，見圖3。

圖3 CCK-8檢測細胞的增殖(×100)

四、AV-PI檢測細胞的凋亡

AV-PI檢測結果顯示，空白對照組細胞的凋亡率(%)為(4.21±1.24，n=3)，空白載體病毒對照組的凋亡率(%)為(3.09±1.13，n=3)，shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡率(%)為(35.21±13.31，n=3)，三組比較具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒對照組比較具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。說明shRNA干擾 Survivin載體病毒組細胞的凋亡率比空白載體病毒對照組要高，見圖4。

五、RT-qPCR和Western-Blot檢測各組的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表達

shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計學差異(t=2.097，P=0.0219<0.05)。從mRNA水平上說明shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-3與空白載體病毒組相比，表達量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表達，從而可以抑制凋亡。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-9與空白載體病毒組相比，前者表達量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表達，從而可以抑制凋亡。Western-Blot檢測結果顯示，shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-3與空白載體病毒組相比，表達量降低，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表達，從而可以抑制凋亡。shRNA干擾 Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，shRNA干擾 Survivin載體病毒組中Caspase-9表達量降低(P<0.05)，表明shRNA干擾 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表達，從而可以抑制凋亡，見圖5。

討 論

shRNA技術相較于siRNA技術具有明顯的優(yōu)勢，具體優(yōu)勢在于shRNA技術可以穩(wěn)定的表達于細胞體系中，并且不會隨著細胞的不斷傳代，表達效價隨之降低[7]。shRNA技術可以更好的針對基因進行沉默，可以使基因獲得更加穩(wěn)定。鑒于以上優(yōu)點。shRNA技術越來越引起大家的注意，為臨床上進行基因治療提供了新的研究方法。唐益庭等[8]用shRNA下調泛素表達，探究shRNA對肺癌細胞的作用，發(fā)現shRNA可以抑制人肺癌H1299細胞生長并促進其凋亡。本研究采用shRNA技術，構建shRNA干擾 Survivin病毒載體，從基因水平將Survivin基因沉默，抑制Survivin基因的表達，觀察了Survivin基因沉默后的腫瘤細胞的凋亡，遷移和增殖的水平。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織[9-10]?！畨魸傻萚11]采用survivin基因表達對腫瘤細胞A549和Hela S3細胞的影響進行探討，發(fā)現siRNA能有效沉默survivin基因在多種腫瘤細胞中的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本研究探討shRNA-Survivin基因對肺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響，旨在尋求新的基因治療方法，為臨床上肺癌的治療提供新的思路。

圖4 AV-PI檢測細胞的凋亡；注：A：空白對照組的凋亡檢測；B：空白載體病毒組的凋亡檢測；C：shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡檢測；D： 三組凋亡的檢測結果分析

圖5 RT-qPCR和Western-Blot檢測空白對照組，空白載體病毒組和shRNA干擾 Survivin載體病毒組的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表達水平；注：A：Caspase-3基因的mRNA表達水平；B：Caspase-9基因的mRNA表達水平；C：Western-Blot檢測結果；D：Western-Blot檢測結果的蛋白相對表達量的結果分析

Caspase家族是近年來細胞凋亡領域中分子生物學研究的重要發(fā)現之一，在凋亡的最后階段是通過Caspase家族的激活和表達而實現的。其中Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中與凋亡密切相關的蛋白酶[12-13]。郭曉東等[14]的研究表明Caspase-9蛋白酶與肝癌細胞的凋亡有密切聯(lián)系。本研究將Caspase-3和Caspase-9作為肺癌細胞凋亡的標志蛋白，研究在shRNA作用下，其對肺癌細胞凋亡的影響。通過RT-qPCR方法檢測shRNA-Survivin對肺癌細胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平表達的影響。結果顯示，shRNA-Survivin載體病毒組與空白載體病毒組相比，前者可以明顯提高肺癌細胞的凋亡率，由此可見shRNA-Survivin在肺癌細胞的凋亡中具有明顯的作用。另外通過蛋白水平Western-Blot檢查結果也表明了此種趨勢，進一步證實了shRNA干擾 Survivin載體在肺癌細胞的凋亡中具有明顯促進作用。

王俊鋼等[15-18]研究證實了非小細胞肺癌的遷移與小RNA有關，本研究進一步利用Transwell的實驗方法檢測shRNA干擾 Survivin對肺癌細胞的遷移的作用。發(fā)現shRNA干擾 Survivin對肺癌細胞的遷移具有明顯的抑制作用。另外，本研究還利用CCK-8實驗方法檢測了肺癌腫瘤細胞的增殖，發(fā)現shRNA干擾 Survivin對肺癌細胞的增殖具有明顯抑制作用。本研究利用AV-PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡，結果表明shRNA干擾 Survivin對肺癌細胞的過度凋亡也具有明顯增強作用。

然而本文結果，只是初步探討了shRNA干擾Survivin對肺癌細胞的作用，發(fā)現其可以有效的抑制肺癌細胞的遷移和增殖，并且提高其凋亡率，但是對其具體起作用的分子生物學機制并不完全明了，尚需進一步的研究。shRNA干擾 Survivin可以有效的抑制肺癌細胞的遷移和增殖，并且提高其凋亡率，為臨床上肺癌的預防與治療提供了新的思路與方法。