陳一仁 張燕 劉俊寧 牛素生 杜夢(mèng)凡 陳燦 胡斌涵 黃茂暢趙宇

隨著工業(yè)和交通等行業(yè)的發(fā)展，骨折伴周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率明顯增加。周圍神經(jīng)對(duì)于維持骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨折愈合至關(guān)重要[1-2]，骨折端失神經(jīng)支配后，因神經(jīng)肽類物質(zhì)缺少，導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性降低，破骨細(xì)胞活性增加，肌肉萎縮等情況，骨折將發(fā)生延遲愈合甚至不愈合[3-4]，成為臨床治療的難點(diǎn)。雖然目前臨床神經(jīng)損傷修復(fù)技術(shù)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但由于神經(jīng)再生速度緩慢，約為1 mm/d[5]，使得即使做了神經(jīng)修復(fù)，骨折端仍有很長(zhǎng)時(shí)間處于無神經(jīng)支配狀態(tài)，使骨折愈合受到嚴(yán)重影響[6]，因此改善此段時(shí)間內(nèi)骨折端骨痂質(zhì)量，對(duì)提高失神經(jīng)骨折的臨床治療效果具有非常重要的意義。

理氣補(bǔ)血湯是福建省名中醫(yī)王和鳴教授整理的南少林骨傷經(jīng)驗(yàn)方，具有理氣活血、益氣補(bǔ)血、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效，臨床主要用于治療骨折延遲愈合[7]。有研究發(fā)現(xiàn)理氣補(bǔ)血湯可顯著延緩失神經(jīng)骨骼萎縮[8-9]。本研究采用切斷SD 大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)加右側(cè)脛骨骨折克氏針內(nèi)固定的方法建立失神經(jīng)骨折模型，探討理氣補(bǔ)血湯對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后脛骨骨折愈合的影響，為臨床治療伴周圍神經(jīng)損傷的骨折提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥物制備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2022 年8 月—2023 年8 月選擇SPF 級(jí)3 月齡雄性SD 大鼠27 只，體重160～180 g，由北京華阜康生物科技股份公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2019-008。按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C 三組，每組9 只。A 組：?jiǎn)渭兠劰枪钦蹆?nèi)固定+生理鹽水，B 組：坐骨神經(jīng)切斷+骨折內(nèi)固定+生理鹽水，C 組：坐骨神經(jīng)切斷+骨折內(nèi)固定+理氣補(bǔ)血湯。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，倫理號(hào)：2022134。

1.1.2 主要儀器與試劑 中藥旋蒸儀（上海亞榮生化儀器廠，RE2000 mA）、石蠟包埋機(jī)（湖北錦源醫(yī)療科技有限公司，JY-BMC）、病理切片機(jī)（美國(guó)Thermo 公司，HM-325）、生物顯微鏡（德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司，DM2700P）、小動(dòng)物X 光機(jī)（美國(guó)KUBTEC 公司，XRAY-Imaging）、烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，MFCD00007966）、伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，G1080）、蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司，G1100）、馬松三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，G1340）、大鼠Ⅰ型膠原C 端肽（CTX-Ⅰ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢華美，CSB-E12776r）、大鼠Ⅰ型前膠原N 端前肽（PⅠNP）ELISA 試劑盒（武漢華美，CSB-E12774r）、大鼠骨堿性磷酸酶（BALP）ELISA 試劑盒（武漢華美，CSBE11865r）、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）ELISA 試劑盒（武漢華美，CSB-E08491r）

1.1.3 藥物制備 理氣補(bǔ)血湯（黃芪、太子參、制首烏、當(dāng)歸、白芍、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)各9 g，川芎6 g，炙甘草3 g），由福建中醫(yī)藥大學(xué)耗材平臺(tái)提供，按常規(guī)方法煎煮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮為2 g/mL 理氣補(bǔ)血湯水煎液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，使用烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠。

A 組造模方法：麻醉成功后大鼠取仰臥位，剃除右膝及小腿毛發(fā)，消毒，鋪無菌洞巾。稍屈曲膝關(guān)節(jié)，脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)緊貼髕韌帶，以20 mL 注射器針頭開口，沿脛骨長(zhǎng)軸方向?qū)⒅睆?.8 mm 的克氏針穿入脛骨骨髓腔，于脛骨內(nèi)側(cè)中上1/3 處縱向切口約1 cm，暴露脛骨。將插入骨髓腔的克氏針緩慢退出約2/3，用直徑為2 cm 的電動(dòng)鋸片（厚度為0.1 mm）沿脛骨上1/3 處垂直縱軸切割（5 000 r/min，切割時(shí)為防止骨骼灼傷，用生理鹽水不停滴切割處），當(dāng)脛骨橫斷2/3 時(shí)，組織鉗掰斷脛骨剩余處，然后將克氏針經(jīng)過骨折處，重新插入骨髓腔內(nèi)。確認(rèn)斷端位置良好后，牢固固定。生理鹽水沖洗傷口，縫合肌肉和皮膚。

B 組、C 組造模方法：麻醉后剃除右臀區(qū)、股后區(qū)及脛骨處毛發(fā)，先取俯臥位，消毒，鋪無菌巾，取股后外側(cè)切口，依次切開皮膚和筋膜，自臀淺肌與股二頭肌之間的肌間隙分離，暴露坐骨神經(jīng)，于股骨中上1/3 交界處切除1 cm 坐骨神經(jīng)，將坐骨神經(jīng)近端其反折縫于肌肉處，逐層縫合傷口。大鼠改仰臥位，進(jìn)行脛骨骨折克氏針內(nèi)固定，具體操作方法同A 組

1.2.2 干預(yù)方法 A 組、B 組予以0.9%生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，C 組予以理氣補(bǔ)血湯灌胃。灌胃劑量根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算。術(shù)后第1 天予以灌胃，根據(jù)動(dòng)物體重，每周調(diào)整灌胃劑量。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 X 線檢查 干預(yù)28 d 后麻醉大鼠，取俯臥位，右下肢髖、膝關(guān)節(jié)屈曲90°，腳尖沖外，拍攝右側(cè)脛骨側(cè)位片，由2 名讀片經(jīng)驗(yàn)豐富的觀察者按照Lane-Sandhu 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評(píng)分。Lane-Sandhu評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Lane-Sandhu X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 ELISA 檢測(cè) 拍攝X 線片后，采用腹主動(dòng)脈取血方式取動(dòng)脈血，室溫下靜置2 h，離心機(jī)以3 000 r/min，離心15 min 后，抽取上清液，-80 ℃保存，ELISA 檢測(cè)血清BALP、PⅠNP、CTX-Ⅰ、TRACP-5b。1.3.3 蘇木素伊紅（HE）及馬松染色 取血后，離斷右膝及右踝關(guān)節(jié)，剝離脛骨周圍附著的肌肉，保留骨膜和骨痂完整，取出克氏針，多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣，脫鈣后保留骨折線上下5 mm，HE 染色觀察骨折端骨痂生成情況；馬松染色觀察膠原分布排列情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，所有計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組X 線檢查結(jié)果

干預(yù)28 d 后，脛骨側(cè)位片顯示骨折線均位于右脛骨中上1/3 左右處，骨折對(duì)線、對(duì)位良好，均獲得解剖復(fù)位。A 組骨折處骨痂基本大部分已吸收，骨折線模糊，骨痂基本塑形完畢，見圖1A；B 組骨折處骨折線部分模糊，骨痂呈梭形膨大，有連續(xù)性骨痂通過骨折線，骨痂重塑未完成，見圖1B；C 組骨折處骨折線模糊，少量骨痂存留，見圖1C。Lane-Sandhu 評(píng)分結(jié)果：A 組為（8.33±0.88）分，B 組為（5.00±0.76）分，C 組為（8.17±0.73）分，B 組明顯低于A 組、C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C 組評(píng)分雖較A 組低，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 三組大鼠脛骨側(cè)位X線檢查結(jié)果

2.2 三組HE 染色結(jié)果

干預(yù)28 d 后，A 組骨痂成熟明顯高于B 組、C 組，C 組較B 組成熟度好。A 組骨痂HE 染色可見軟骨細(xì)胞數(shù)量較少，已轉(zhuǎn)化為編織骨，骨髓腔部分貫通，呈有序排列，骨小梁體積較大，沿應(yīng)力方向排列，見圖2A；B 組中可觀察到大量軟骨細(xì)胞，骨化重建不夠，骨小梁排列紊亂，可見骨吸收產(chǎn)生的較大空腔，見圖2B；C 組仍可見少量軟骨細(xì)胞，大部分已轉(zhuǎn)化為編織骨，骨髓腔部分貫通，見圖2C。

圖2 三組大鼠脛骨骨痂HE染色結(jié)果（100×）

2.3 三組馬松染色結(jié)果

干預(yù)28 d 后，馬松染色A 組可觀察到大量鈣化骨痂，鈣化骨痂與周圍骨骼相融，膠原纖維基本已被吸收，少量膠原纖維散在分布于鈣化骨痂周圍，見圖3A；B 組可見骨痂外部有大量軟骨細(xì)胞，膠原纖維部分被吸收，分布于軟骨細(xì)胞周圍，見圖3B；C 組觀察到軟骨細(xì)胞數(shù)量較B 組數(shù)量少，膠原纖維未被完成吸收，骨痂外部的骨痂基本已經(jīng)鈣化，見圖3C。

圖3 三組大鼠脛骨骨痂Masson染色圖結(jié)果（100×）

2.4 三組ELISA 檢測(cè)結(jié)果

干預(yù)28 d 后A 組血清中BALP、PⅠNP 均高于B 組、C 組，C 組BALP、PⅠNP 均高于B 組；A 組CTX-Ⅰ、TRACP-5b 均低于B 組、C 組， 而C 組CTX-Ⅰ、TRACP-5b 均低于B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組ELISA檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 三組ELISA檢測(cè)結(jié)果（±s）

*與A 組比較，P＜0.05；#與B 組比較，P＜0.05。

組別BALP（U/L）PⅠNP（pg/mL）CTX-Ⅰ（pg/mL）TRACP-5b（mIU/mL）A 組（n=9）45.70±0.94487.97±10.0152.85±1.613.18±0.61 B 組（n=9） 29.92±0.29* 343.00±14.03* 73.56±0.93* 5.39±0.13*C 組（n=9） 36.67±0.22*# 418.32±22.64*# 63.62±3.61*# 4.62±0.11*#F 值183.7819.4819.53113.72 P 值0.000.000.000.00

3 討論

周圍神經(jīng)對(duì)于維持骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨折愈合至關(guān)重要[11]，其通過分泌神經(jīng)肽類物質(zhì)如降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、神經(jīng)肽（SP）、血管活性肽（VIP）等，調(diào)控成骨細(xì)胞活性、破骨細(xì)胞數(shù)量，影響骨骼穩(wěn)態(tài)和骨折愈合[12]；通過調(diào)節(jié)肌容量及肌肉收縮對(duì)骨折端產(chǎn)生力學(xué)刺激等[13-14]，促進(jìn)骨折愈合。當(dāng)骨折端失神經(jīng)支配后，在愈合過程中因神經(jīng)肽類物質(zhì)缺少，成骨細(xì)胞活性下降，破骨細(xì)胞活性增加，肌肉萎縮缺乏力學(xué)刺激等因素，導(dǎo)致骨折延遲愈合甚至不愈合。

夏群等[15]證實(shí)，失神經(jīng)支配脛骨破骨細(xì)胞指數(shù)及破骨細(xì)胞吸收表面遠(yuǎn)大于正常神經(jīng)支配組，在形成大量骨痂的同時(shí)，骨吸收較多，骨痂排列雜亂。馬昕等[16]發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)切斷后股骨骨折大鼠術(shù)后4 周X 線顯示其骨痂較單純股骨干骨折組多，組織學(xué)顯示周圍神經(jīng)切斷組骨痂量雖然多，但其中類骨質(zhì)較多，骨鈣的沉積相對(duì)較少，而且骨痂缺乏血管和正常的骨小梁結(jié)構(gòu)，骨重建不夠理想。

針對(duì)失神經(jīng)骨折的治療，需要考慮神經(jīng)修復(fù)和骨折修復(fù)兩個(gè)方面。雖然隨著顯微外科技術(shù)的進(jìn)步，神經(jīng)損傷修復(fù)技術(shù)包括神經(jīng)吻合術(shù)、自體神經(jīng)移植、神經(jīng)移植物等多種方法能較好地恢復(fù)受損神經(jīng)的連續(xù)性[17-19]，但由于神經(jīng)的再生速度緩慢，骨折端仍有很長(zhǎng)時(shí)間處于無神經(jīng)支配狀態(tài)，嚴(yán)重影響了骨折愈合質(zhì)量。因此改善此段時(shí)間內(nèi)骨折端骨痂質(zhì)量，延緩肌肉萎縮，為神經(jīng)的再支配爭(zhēng)取寶貴的治療時(shí)間，這將對(duì)提高失神經(jīng)骨折的臨床治療效果具有非常重要的意義。

理氣補(bǔ)血湯由黃芪、太子參、當(dāng)歸、白芍、制首烏、川芎、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、炙甘草組成，具有理氣活血、益氣補(bǔ)血、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效。在張安楨等[7]研究中以理氣補(bǔ)血湯治療骨折延遲愈合43 例，43 例全部獲得臨床愈合，除3 例股骨頸骨折畸形愈合，其余功能恢復(fù)均較滿意。前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)理氣補(bǔ)血湯能顯著減緩肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白表達(dá)的下降[8]，顯著抑制失神經(jīng)支配骨骼肌膠原纖維的形成[20-21]，從而延緩了肌肉萎縮，還能促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)[22]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了理氣補(bǔ)血湯對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后脛骨骨折愈合的影響。

本研究通過橫斷大鼠脛骨，克氏針內(nèi)固定骨折斷端形成了大鼠脛骨骨折模型。克氏針不能完全控制骨折端的旋轉(zhuǎn)移位，因此該骨折模型的愈合屬于二期愈合，更符合臨床常見骨折愈合過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干預(yù)28 d 后，坐骨神經(jīng)切斷加脛骨骨折組（B 組）的骨折線部分模糊，骨痂呈梭形膨大，而坐骨神經(jīng)完整僅脛骨骨折組（A 組）的骨痂塑形基本完畢，其結(jié)果與丁云等[23]研究結(jié)果一致，說明坐骨神經(jīng)損傷明顯影響了骨折愈合過程。理氣補(bǔ)血湯干預(yù)后的C 組，雖還有少量骨痂存留，但骨折線基本模糊，Lane-Sandhu 評(píng)分明顯高于B 組，與A 組評(píng)分無明顯差異；HE 染色、馬松染色顯示理氣補(bǔ)血湯干預(yù)后可使坐骨神經(jīng)損傷后的脛骨骨折處的軟骨向骨痂轉(zhuǎn)化、骨痂成熟度得到提升，說明理氣補(bǔ)血湯可明顯改善坐骨神經(jīng)損傷后的脛骨骨折愈合質(zhì)量。

PⅠNP 反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力，用于監(jiān)測(cè)成骨細(xì)胞活力，可作為預(yù)測(cè)骨折愈合的影響因子之一[24]；BALP 由成骨細(xì)胞分泌，是反映成骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物，在礦化過程中可水解無機(jī)磷酸鹽，有益于類骨質(zhì)的礦化，類骨質(zhì)在成骨細(xì)胞的作用下礦化形成骨質(zhì)，則骨痂進(jìn)一步成熟，力學(xué)強(qiáng)度提升[25-26]；TRACP-5b 主要來源于破骨細(xì)胞，參與降解骨基質(zhì)中鈣磷礦化物，是破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)的臨床標(biāo)志物[27]；CTX-Ⅰ也是反映骨吸收的標(biāo)志，主要反映Ⅰ型膠原的降解，Ⅰ型膠原是類骨質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[28]，其占比對(duì)骨折的修復(fù)和力學(xué)強(qiáng)度影響較大。

本研究結(jié)果顯示單純脛骨骨折的A 組BALP和PⅠNP 均明顯高于合并坐骨神經(jīng)損傷的B 組（P＜0.05），主要與周圍神經(jīng)損傷后CGRP 和SP 分泌下降，成骨作用減弱有關(guān)[29-30]。而理氣補(bǔ)血湯干預(yù)后的C 組血清中BALP 和PⅠNP 含量均明顯高于B 組（P＜0.05），說明理氣補(bǔ)血湯干預(yù)后骨折端的成骨反應(yīng)增強(qiáng)。同時(shí)坐骨神經(jīng)損傷后B 組的CTX-Ⅰ和TRACP-5b 的表達(dá)均明顯高于無坐骨神經(jīng)損傷單純脛骨骨折的A 組（P＜0.05），印證了失神經(jīng)后破骨細(xì)胞活性增加，骨吸收增多，這與張貴春[31]的結(jié)論一致，而理氣補(bǔ)血湯干預(yù)的C 組其CTX-Ⅰ和TRACP-5b 的含量均明顯低于B 組（P＜0.05），說明理氣補(bǔ)血湯干預(yù)后骨痂質(zhì)量的改善與抑制破骨細(xì)胞活性和骨質(zhì)過度吸收有關(guān)。

綜上所述，理氣補(bǔ)血湯可改善坐骨神經(jīng)損傷后脛骨骨折愈合質(zhì)量，其機(jī)制可能與調(diào)控破骨和成骨過程，促進(jìn)骨痂成熟，調(diào)節(jié)骨痂重塑有關(guān)，但其具體作用機(jī)制及其對(duì)骨痂力學(xué)性能的影響，需進(jìn)一步研究明確。