張香港，趙澄，陳純靜，胡玨，盧芳國

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

流感相關(guān)性腦炎/腦病（influenza-associated encephalitis/encephalopathy）是急性流感過程中伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一種臨床綜合征。流行病學(xué)調(diào)查表明，老人、兒童、孕婦以及免疫缺陷人群由于體質(zhì)特殊，感染流感之后出現(xiàn)的癥狀也有其特殊性，患中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高［1］。流感相關(guān)性腦病模型的建立是其防治研究的基礎(chǔ)。環(huán)磷酰胺是一種活性烷基化劑，具有免疫抑制作用，可抑制體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致機(jī)體整體免疫功能障礙，常用于建立免疫抑制動(dòng)物模型［2］。有研究表明小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺腹腔注射后，細(xì)胞免疫受抑制，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)病毒的易感性增加［3］?；谝陨媳尘埃狙芯坑^察免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠流感相關(guān)性腦病的影響，旨在為流感相關(guān)性腦病模型建立提供參考，以期為流感相關(guān)性腦病防治研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)BLAB/c小鼠80只，體質(zhì)量（18±2）g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK（湘）2019-0009。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠的處理措施已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 病毒株A型流感病毒（A/PR/8/34）小鼠肺適應(yīng)株由湖南師范大學(xué)病毒研究室提供，-80℃保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)10 d齡雞胚尿囊腔培養(yǎng)傳代，用于本實(shí)驗(yàn)血凝效價(jià)為1∶640。

1.3 主要試劑注射用環(huán)磷酰胺（百特國際有限公司）；白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）抗體（R&D）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（ABclonal）；閉鎖小帶蛋白1（zonula occluden-1，ZO-1）抗體（Abcam）；山羊抗兔Ⅱ抗（Proteintech）；IL-6 ELISA試劑盒和TNF-αELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）。

2 主要方法

2.1 動(dòng)物模型制備小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、病毒組、環(huán)磷酰胺+病毒組，每組20只。環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠按照75 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，其余各組小鼠同步注射相同體積0.9%生理鹽水；末次注射后24 h，病毒組、環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠經(jīng)鼻腔接種稀釋度為1∶100的流感病毒液0.05 mL建立流感病毒感染模型，其余各組小鼠同步鼻腔接種0.9%生理鹽水0.05 mL。觀察并記錄小鼠每日體質(zhì)量。分別在小鼠感染流感病毒后的第3、7天每組隨機(jī)選取10只小鼠（雌雄各半），采集標(biāo)本。

2.2 肺、腦指數(shù)測量常規(guī)稱量記錄小鼠體質(zhì)量及肺、腦重量，計(jì)算肺、腦指數(shù)。肺指數(shù)（%）=肺組織質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%，腦指數(shù)（%）=腦組織質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.3 HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變各組小鼠腦組織以4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水包埋、切片、脫蠟、染色、透明、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

2.4 各組小鼠肺組織、腦組織流感病毒載量水平檢測分別稱取小鼠肺、腦組織50 mg按試劑盒說明書提取總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，采用RT-qPCR進(jìn)行流感病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）產(chǎn)物擴(kuò)增和結(jié)果分析。NP上游引物序列為5"-CCTGTGTGTATGGACCTGCC-3"，下游引物序列為：5"-CTCTTGGGACCACCTTCGTC-3"；β-actin上游引物序列為5"-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3"，下游引物序列為5"-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3"。

2.5 ELISA法檢測腦組織勻漿中IL-6和TNF-α的含量稱取100 mg腦組織，加入900 uL的已加入PMSF（1∶100）的PBS研磨成勻漿，離心后取上清液，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，測得吸光度值后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

2.6 免疫組化法檢測腦組織中IL-6、TNF-α和ZO-1的表達(dá)腦組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、脫蠟后采用PV-9000通用二步法檢測其蛋白表達(dá)水平，光學(xué)顯微鏡下觀察陽性表達(dá)。每張樣本切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 5.0軟件計(jì)算視野的平均光密度值，作為該樣本的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0處理分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，正態(tài)分布資料多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗(yàn)（方差齊）或Games-Howell檢驗(yàn)（方差不齊）；非正態(tài)分布資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠肺、腦指數(shù)及肺、腦組織病毒載量水平比較

感染后第3、7天，與正常對(duì)照組比較，病毒組小鼠肺指數(shù)顯著增加（P＜0.05），環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠肺、腦指數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與病毒組比較，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠肺指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。感染后3天，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠腦指數(shù)較病毒組顯著增加（P＜0.01），見圖1A。

感染后第3、7天，病毒組、環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠肺組織中H1N1流感病毒NP基因相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組小鼠顯著增高（P＜0.01）。與病毒組比較，感染后7天的環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠肺組織中H1N1流感病毒NP基因相對(duì)表達(dá)量較病毒組顯著增高（P＜0.01）。各組小鼠腦組織中未檢出H1N1流感病毒NP基因表達(dá)，見圖1B。

Figure 1.Comparison of lung/brain index and viral load in lung/brain tissues of mice in each group.A：lung/brain index（n=8）；B：viral load in lung/brain tissues（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs virus group.圖1 各組小鼠肺、腦指數(shù)及肺、腦組織病毒載量比較

2 各組小鼠腦組織病理變化

正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組小鼠海馬和皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、排列正常；感染病毒后3 d，病毒組小鼠海馬細(xì)胞形態(tài)、排列正常，皮質(zhì)水腫；環(huán)磷酰胺+病毒組海馬大量神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死，皮質(zhì)水腫；感染病毒后7 d，病毒組小鼠皮質(zhì)水腫消失，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠仍見海馬大量神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死，皮質(zhì)水腫。見圖2。

3 各組小鼠腦組織勻漿中IL-6和TNF-α含量水平比較

感染后3 d，病毒組小鼠腦組織勻漿中IL-6含量水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠腦組織勻漿中IL-6含量水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），TNF-α含量水平較正常對(duì)照組及病毒組顯著升高（P＜0.01）。感染后7 d，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠腦組織勻漿中IL-6和TNF-α含量水平較正常對(duì)照組及病毒組顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腦組織勻漿中IL-6、TNF-α含量水平Table 1.Levels of IL-6 and TNF-αin brain tissue homogenates（ng/g.Mean±SD.n=3）

4 各組小鼠腦組織中IL-6、TNF-α和ZO-1蛋白表達(dá)水平的比較

4.1 各組小鼠腦組織中IL-6蛋白表達(dá)水平的比較感染后3 d，與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠海馬和皮質(zhì)中IL-6蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與環(huán)磷酰胺組比較，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠皮質(zhì)中IL-6蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。感染后7 d，病毒組小鼠海馬中IL-6蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組及環(huán)磷酰胺組顯著升高（P＜0.01）；環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠海馬和皮質(zhì)中IL-6蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組和病毒組均顯著升高（P＜0.01）。見圖3。

Figure 2.Pathological changes of brain tissue of mice in each group（HE staining，×200）.The red arrow in the figure indicates necrotic pyknosis nerve cells，and the blue arrow indicates edema.圖2 各組小鼠腦組織病理變化

4.2 各組小鼠腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)水平比較感染后3、7 d，環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠海馬和皮質(zhì)中TNF-α蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組及病毒組顯著升高（P＜0.05）。見圖4。

4.3 各組小鼠腦組織中ZO-1蛋白表達(dá)水平比較感染后3、7 d，病毒組、環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠海馬及皮質(zhì)中ZO-1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組及環(huán)磷酰胺組顯著降低（P＜0.05）。環(huán)磷酰胺+病毒組小鼠感染后3 d的海馬、感染后7 d的皮質(zhì)中ZO-1蛋白表達(dá)水平較病毒組顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

Figure 3.IL-6 protein expression in brain tissue of mice in each group（IHC，×400）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△△P＜0.01 vs cyclophosphamide group；##P＜0.01 vs cyclophosphamide+virus group.圖3 各組小鼠腦組織中IL-6蛋白表達(dá)

Figure 4.TNF-αprotein expression in brain tissue of mice in each group（IHC，×400）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△△P＜0.01 vs cyclophosphamide group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs cyclophosphamide+virus group.圖4 各組小鼠腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)

Figure 5.ZO-1 protein expression in brain tissue of mice in each group（IHC，×400）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs cyclophosphamide group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs cyclophosphamide+virus group.圖5 各組小鼠腦組織中ZO-1蛋白表達(dá)

討 論

本研究在腹腔注射環(huán)磷酰胺（75 mg/kg，1次）后24 h，經(jīng)鼻腔接種流感病毒液所建立的流感病毒感染模型小鼠肺指數(shù)顯著增加，感染后7 d小鼠肺組織中病毒載量水平顯著高于病毒組，說明感染流感病毒后，免疫抑制小鼠肺部損傷較正常小鼠嚴(yán)重，病程延長；小鼠腦指數(shù)顯著增加，腦組織除出現(xiàn)皮質(zhì)水腫外，海馬組織也出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死，且感染后皮質(zhì)水腫無自愈傾向，表明環(huán)磷酰胺的應(yīng)用有利于小鼠流感相關(guān)性腦病的發(fā)生。

多項(xiàng)研究［4-9］表明：流感相關(guān)性腦病的發(fā)病機(jī)制與血漿和腦脊液中高水平的細(xì)胞因子（IL-6、IL-10和TNF-α）有關(guān)，支持急性“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的主要假說。即機(jī)體感染流感病毒后過度的促炎細(xì)胞因子與趨化因子引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫病理損傷，是發(fā)生流感相關(guān)性腦病的免疫機(jī)制之一［10］。本研究表明：環(huán)磷酰胺腹腔注射，再感染A型流感病毒后小鼠腦組織勻漿中IL-6和TNF-α含量水平及海馬和皮質(zhì)中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)均顯著升高。說明經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后的小鼠感染流感病毒后，腦組織中炎癥因子IL-6和TNF-α均釋放增加，且炎癥因子含量水平與腦組織損傷密切相關(guān)。本課題組前期研究證實(shí)流感病毒感染后，機(jī)體肺部產(chǎn)生炎癥的同時(shí)，肺組織及腦組織中JAK1-STAT1信號(hào)通路激活及下游炎癥因子表達(dá)水平失衡［11］，這可能又是流感病毒感染后發(fā)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的分子機(jī)制之一。

由于流感相關(guān)性腦病常發(fā)生于兒童，兒童較成人血腦屏障發(fā)育不完善，流感病毒破壞血腦屏障導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常也被認(rèn)為是流感相關(guān)腦炎的可能發(fā)病機(jī)制。孫桂蓮［12］等通過檢測流感病毒相關(guān)腦病患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）水平發(fā)現(xiàn)MMPs可能參與了流感腦病的發(fā)病。在炎性因子作用下，MMPs可通過水解蛋白作用破壞血腦屏障基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接（tight junction，TJ）［13］。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是一種多細(xì)胞血管結(jié)構(gòu)，將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血循環(huán)分隔開來，血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的TJ是BBB的重要構(gòu)成部分［14］。BBB的功能基礎(chǔ)是內(nèi)皮細(xì)胞間的TJ蛋白，通過TJ蛋白的變化可發(fā)揮閘門及柵欄樣的調(diào)控作用。ZO-1是TJ蛋白之一，它的表達(dá)水平能夠很好地反應(yīng)血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺聯(lián)合流感病毒應(yīng)用于小鼠時(shí)，與單用病毒比較，小鼠腦組織中ZO-1蛋白水平顯著下降，說明小鼠血腦屏障的完整性遭到一定程度的破環(huán)，有利于流感相關(guān)性腦病的發(fā)生。