基金項(xiàng)目：

貴州省科技廳平臺(tái)人才項(xiàng)目［20185216］。

作者簡(jiǎn)介：

陳菊（1979—），女，苗族，碩士，副教授，研究方向?yàn)橹胁菟幏矫娼虒W(xué)及基礎(chǔ)研究。E-mail：511285737@qq.com

通信作者：

【摘? 要】

目的：研究豬鬃草總黃酮提取工藝，分析其抗氧化活性。方法：利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選豬鬃草總黃酮超聲波提取工藝的最佳條件，并測(cè)定豬鬃草總黃酮提取物對(duì)·OH和DPPH自由基的清除能力。結(jié)果：豬鬃草總黃酮超聲波提取的最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶33 g/mL，超聲提取時(shí)間21 min，超聲次數(shù)2次，該條件下總黃酮的提取率為6.17%；抗氧化試驗(yàn)中，豬鬃草總黃酮對(duì)·OH和DPPH自由基均有清除效果，對(duì)·OH清除率為45.09%，對(duì)DPPH清除率為63.12%。結(jié)論：Box-Behnken分析法優(yōu)化豬鬃草總黃酮提取工藝是可行的，豬鬃草總黃酮具有較好的抗氧化能力。

【關(guān)鍵詞】

豬鬃草；總黃酮；超聲提取；響應(yīng)面法；抗氧化性

【中圖分類號(hào)】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）20-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320010

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Adiantum

capillus-veneris by Response Surface Method

CHEN Ju

Qiandongnan Vocational and Technical College for Nationalities，Kaili 556000，China

Abstract：

Objective The extraction technology and antioxidant activity of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were studied. Methods With Box-Behnken response surface method，the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were optimized .The antioxidant capacity of total flavonoids to·OH and DPPH·free radical were adopted. Results The optimum extraction conditions was as follows： material-liquid ratio 1∶33 （g/mL）， extraction time 20min， extraction times 2 times. Under these conditions， the average extraction rate of polysaccharides reaches 6.17%.The total flavonoids in Adiantum capillus-veneris had good antioxidant effect on·OH radicals and DPPH radicals，and the scavenging rate was 45.09% and 63.12%. Conclusion The response surface method is feasible to optimize extraction process of Adiantum capillus-veneris total flavonoids and the total flavonoid had good antioxidant activity.

Keywords：

Adiantum Capillus-veneris；Total Flavonoids；Ultrasonic-assisted Extraction；Response Surface Methodology；Antioxidant Activity

豬鬃草為鐵線蕨科（Adiantaceae）植物鐵線蕨（Adiantum capillus-veneris）及團(tuán)羽鐵線蕨（Adiantum capillus-junonis Rupr）［1］，又名豬毛漆、鐵絲草、魚鱗草［2］，常生于溪邊隱濕處，廣泛分布在貴州境內(nèi)，其中在貴州省黔東南地區(qū)民間常用來(lái)治療尿路感染及結(jié)石，具有較好的療效。豬鬃草性涼，味微苦，以全草入藥，可清熱祛風(fēng)、利尿消腫、補(bǔ)腎止咳，用于治療感冒咳嗽、腰酸背痛、跌打損傷、尿結(jié)石、乳腮炎、腎炎、血淋、遺精等［2-6］。據(jù)《貴州民間方藥集》記載豬鬃草中含黃酮類、糖類、揮發(fā)油和鞣質(zhì)等多種物質(zhì)。黃酮是藥用植物中一類多功能的天然活性物質(zhì)，具有抗心腦血管病、抗腫瘤、抗糖尿病等作用［7］。由于黃酮類化合物特有的理化性質(zhì)和特殊結(jié)構(gòu)，使得它能選擇性地抑制體內(nèi)酶的活性，而具有抗氧化性［8］，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到藥品、食品和化妝品中。

響應(yīng)面分析法是一種能確定多因素系統(tǒng)的試驗(yàn)方法，它采用多元二次回歸方程來(lái)擬合試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)［9］。目前，響應(yīng)面法優(yōu)化黔東南地區(qū)豬鬃草總黃酮的提取研究未見報(bào)道，本研究擬在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲波提取豬鬃草總黃酮進(jìn)行優(yōu)化，并就其清除·OH和DPPH自由基的能力進(jìn)行研究，為該地區(qū)豬鬃草提取物的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考和依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑? 豬鬃草購(gòu)于黔東南州民族藥材市場(chǎng)，由我院楊海莉副教授鑒定為鐵線蕨科植物鐵線蕨，新鮮的豬鬃草用自來(lái)水沖掉泥沙，然后在蒸餾水下沖洗干凈，再用定性濾紙吸干表面水分，置于110℃烘箱內(nèi)殺青，60℃下烘干至恒重。烘干后的豬鬃草經(jīng)粉碎，并過(guò)篩，即得豬鬃草粉末，室溫下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：標(biāo)準(zhǔn)品蘆?。℉PLC＞98%）購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，DPPH自由基、 H2O2、維生素C及其他試劑均為分析純。蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

主要儀器：電熱鼓風(fēng)干燥箱（DUG-90764型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV8000S型，上海元析儀器有限公司）；電子分析天平［MS204S型，梅特勒托利多（上海）儀器有限公司］；超聲波清洗器（SK8200HP型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（SYG-6型，常州朗越儀器制造有限公司）；循環(huán)水式真空泵［SHZ-D（Ⅲ）型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司］。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備? 準(zhǔn)確稱取105℃條件下，干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6.55 mg，加無(wú)水乙醇適量使其溶解并定容到20mL容量瓶中，搖勻，得0.3275mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL，分別放入25mL的容量瓶中，先各加入0.5mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻并靜置6min，再各加入0.5mL的10% 硝酸鋁溶液，充分搖勻放置6min，再分別加入5mL的 4%氫氧化鈉溶液，最后用70%的乙醇定容至刻度，搖勻。常溫下放置15min，然后在500 nm處測(cè)定吸光度A值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/mL）與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（如圖1所示），計(jì)算出回歸方程：A=12.837C+0.15，相關(guān)系數(shù)R=0.999，表明在0.0028～0.0817mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2? 豬鬃草總黃酮超聲提取工藝及得率計(jì)算? 準(zhǔn)確稱取豬鬃草粉末適量，加70%乙醇浸泡30min后，進(jìn)行超聲波提取，過(guò)濾，濾液用70%乙醇定容于50mL容量瓶中，搖勻，得樣品溶液。精密吸取樣品溶液2.00mL，放置于20mL容量瓶中，同“1.2.1節(jié)”操作加入5% NaNO2、10%Al（NO3）3和4%的NaOH定容，在510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)得的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算豬鬃草中黃酮的含量，然后計(jì)算豬鬃草黃酮提取率：

豬鬃草總黃酮提取率（%）=豬鬃草總黃酮質(zhì)量豬鬃草質(zhì)量×100%

1.2.3? 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 固定提取工藝中其他因素水平，選取料液比（1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL）、超聲提取時(shí)間（5min、10min、20min、30min、40min）和超聲次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次）為影響因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考究各單因素變化對(duì)總黃酮提取率的影響，以確定響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素取值范圍。

1.2.4? 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、超聲提取時(shí)間（B）、超聲次數(shù)（C）為考察因素，各設(shè)定3個(gè)水平，以-1、0、1分別編碼，采用Box提出的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定超聲提取豬鬃草總黃酮的最優(yōu)工藝，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.5? 豬鬃草總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1? 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定? 參考張琳等［10］的方法稍以改動(dòng)，將1.2.2節(jié)豬鬃草黃酮提取液進(jìn)行濃縮，用蒸餾水稀釋濃縮液并配成0.05mg/mL、0.15mg/mL、0.25mg/mL、0.35mg/mL、0.45mg/mL、0.55mg/mL、0.65mg/mL7個(gè)不同濃度的樣品溶液，取7支比色管，先各加入2.0mL的 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、不同質(zhì)量濃度的豬鬃草總黃酮溶液及6 mmol/L雙氧水溶液，充分搖勻，25℃條件下放置10min后，再加2.0mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，搖勻并放置于37℃水浴條件下反應(yīng)30min ，然后分別在510 nm測(cè)定不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液的吸光度M1；同時(shí)測(cè)定用蒸餾水代替水楊酸乙醇溶液的吸光度 M2和用蒸餾水代替黃酮溶液的吸光度M0，試驗(yàn)采用維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)下面公式計(jì)算出豬鬃草總黃酮對(duì)·OH清除率：

羥基自由基清除率（%）=1-（M1-M2）M0×100%

1.2.5.2? 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定? 參考王世彬等［11］的方法，在2.5mL濃度為0.2 mmol/L 的DPPH乙醇溶液中分別加入不同質(zhì)量濃度的豬鬃草總黃酮溶液2.0mL，搖勻后，在25℃條件下避光反應(yīng)30min，于紫外-可見分光光度計(jì)517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度N1，同時(shí)測(cè)定2.5mL無(wú)水乙醇與2.0mL不同質(zhì)量濃度豬鬃草總黃酮溶液混合液的吸光度N2、以及用2.0mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液與2.5mL0.2 mmol/LDPPH溶液反應(yīng)的吸光度 N0。試驗(yàn)以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算豬鬃草總黃酮對(duì)DPPH·清除率：

DPPH自由基清除率（%）= 1-（N1-N2）N0×100%

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素試驗(yàn)分析? 單因素料液比、超聲時(shí)間和超聲次數(shù)對(duì)豬鬃草總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

由圖2a看出，隨著溶劑用量的增加，豬鬃草總黃酮提取率也增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶30時(shí)，提取率最大，超過(guò)1∶30之后，提取率逐漸下降。料液比過(guò)大時(shí)不但提取溶劑的用量增加，而且不利于濃縮，所以選擇料液比在1∶30附近進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖2b可知，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率呈增加趨勢(shì)， 30min后，豬鬃草總黃酮提取率反而下降。這也許是由于超聲時(shí)間太短，提取不充分，黃酮類化合物還沒有完全溶出，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)部分溶劑會(huì)揮發(fā)，同時(shí)溶液中的非黃酮類物質(zhì)逐漸增多，導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇超聲時(shí)間在30min左右為宜。

由圖2c可知，超聲提取1次時(shí)，豬鬃草總黃酮提取率明顯較低，超聲提取2次時(shí)提取率達(dá)最高，繼續(xù)增加提取次數(shù)，提取率不再增加并開始下降。因此，宜選擇提取次數(shù)在2次左右。

2.2? 響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與方差分析? 用自變量A、B、C分別表示料液比（g/mL）、超聲提取時(shí)間（min）和超聲次數(shù)3個(gè)影響因素，Y為響應(yīng)值表示豬鬃草總黃酮提取率，采用分析軟件設(shè)計(jì)，共17個(gè)試驗(yàn)， 1～12為析因試驗(yàn)，其余13～17五個(gè)試驗(yàn)為中心試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3，回歸模型可靠性分析見表4。

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式分析，可建立如下二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=6.06+0.93A+0.35B+0.35C-0.11AB+0.52AC-0.63BC-1.79A2-0.16B2-0.51C2

表3方差分析顯示，模型P<0.0001，表明二次回歸方程模型高度顯著；失擬項(xiàng)P＝0.1058＞0.05，差異不顯著，表明該殘差均由隨機(jī)誤差所引起。表4中的回歸模型決定系數(shù)R2=0.9878，表明98.78%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)是合理的，說(shuō)明該回歸模型與實(shí)際測(cè)量值擬合得較好。因此可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，該二次回歸方程的一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2均達(dá)顯著水平以上，交互項(xiàng)中除AB項(xiàng)的交互作用不顯著外，其他BC和AC項(xiàng)兩項(xiàng)交互作用達(dá)也都顯著水平。因此，影響超聲提取豬鬃草黃酮的主次因素為A＞B＞C，即料液比＞超聲提取時(shí)間＞超聲次數(shù)。

根據(jù)回歸模型擬合結(jié)果，通過(guò)軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到豬鬃草總黃酮超聲波提取的最佳條件為：料液比1∶33.27g/mL，超聲時(shí)間20.27min，超聲次數(shù)2.46 次，此條件下豬鬃草黃酮提取率為6.29%。為方便試驗(yàn)操作，將工藝條件調(diào)整為料液比1∶33g/mL，超聲時(shí)間21min，超聲次數(shù)2次。在調(diào)整后的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得豬鬃草黃酮提取率為6.17%，接近模型預(yù)測(cè)值，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較好的擬合性，證明了響應(yīng)面分析法優(yōu)化豬鬃草總黃酮提取工藝的可行性。

2.3? 豬鬃草總黃酮抗氧化活性分析

2.3.1? 對(duì)·OH自由基的清除效果? 由圖3可知，在所試質(zhì)量濃度0.05～0.65mg/mL范圍內(nèi)，羥基自由基的清除率隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，兩者之間成正比例關(guān)系，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.55mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)最大，為45.09%。與同濃度的維生素C相比較，豬鬃草總黃酮清除·OH自由基的能力雖然弱于維生素C清除·OH自由基的能力，但也具有較好清除·OH自由基的能力。

2.3.2? 對(duì)DPPH自由基的清除效果? 由圖4可知，豬鬃草總黃酮在質(zhì)量濃度0.05～0.65mg/mL范圍內(nèi)，隨著豬鬃草總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH自由基的能力增強(qiáng)，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.65mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除力可達(dá)63.12%。與相同濃度的維生素C相比較，雖然豬鬃草總黃酮清除DPPH自由基的能力沒有維生素C清除DPPH自由基的能力強(qiáng)，但豬鬃草總黃酮也具有一定清除DPPH自由基的能力。

3? 結(jié)論

目前黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有超聲波提取法［12］、微波提取法［13］、回流提取法［14］等。鑒于超聲波提取法具有提取率高、操作簡(jiǎn)單、試劑使用量少的優(yōu)點(diǎn)［15-16］，此次研究采用超聲波提取豬鬃草總黃酮。研究考察了料液比、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)對(duì)豬鬃草總黃酮提取率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面分析法建立了影響因素與提取率間的數(shù)學(xué)模型方程，最終確定了超聲波提取豬鬃草總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶33g/mL，超聲時(shí)間21min，超聲次數(shù)2次，在此條件下豬鬃草總黃酮的平均提取率為6.17%，與預(yù)測(cè)值6.29%接近。

該研究從清除·OH和DPPH自由基的能力研究了豬鬃草總黃酮的抗氧化活性，并以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，在豬鬃草總黃酮質(zhì)量濃度在0.05～0.65mg/mL范圍內(nèi)，隨著豬鬃草總黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除·OH和DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.55mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率為45.09%；當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.65mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率的為63.12%。

綜上所述，采用響應(yīng)面法優(yōu)化豬鬃草總黃酮的提取工藝是合理可靠的，可用于豬鬃草總黃酮的提取。本研究結(jié)果表明，豬鬃草總黃酮具有很好的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑資源進(jìn)行開發(fā)利用。相關(guān)研究結(jié)果為豬鬃草總黃酮的提取及抗氧化活性成分的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。然而，有關(guān)豬鬃草總黃酮體內(nèi)抗氧化性以及抗氧化作用的機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：202-02-03? 編輯：劉? 斌）