林燕玲 洪鈴冰 丘志龍 王晨煒 蔡增宏 楊曉燁 曾敏潔 張偉云

基金項(xiàng)目：福建省衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2019-CXB-26）；廈門市醫(yī)療衛(wèi)生指導(dǎo)性項(xiàng)目（3502Z20224ZD1309）；廈門醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（X202212631016，X202212631025）；廈門醫(yī)學(xué)院校級一流課程項(xiàng)目（XBJK2021027）；廈門醫(yī)學(xué)院教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目-金課建設(shè)培育計(jì)劃（XBJK2019013）。

作者簡介：林燕玲（1999—），女，漢族，本科，研究方向中藥質(zhì)量控制技術(shù)與分析。E-mail： 1131727690@qq.com

通信作者：張偉云（1980—），女，漢族，博士，教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向藥物分析、中藥活性成分及其作用機(jī)理。E-mail： zhangwy@xmu.edu.cn

【摘? 要】? 目的：探討澤瀉醇A對人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）葡萄糖吸收活性的影響。方法：使用CCK-8法（Cell Counting Kit-8）測定HepG2細(xì)胞活力，利用2-NBDG（2-Deoxy-2-［（7-nitro-2，1，3-benzoxadiazol-4-yl）amino〗-D-glucose）法測定細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力，采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，從而考察不同濃度的澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響。結(jié)果：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1～10 μmol/L范圍內(nèi)，澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞活力無明顯影響。糖吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明澤瀉醇A在不同程度上具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖吸收的能力。結(jié)論：澤瀉醇A可在一定程度上促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，提示澤瀉醇A可能為澤瀉降血糖的活性成分之一。

【關(guān)鍵詞】? 澤瀉醇A；HepG2細(xì)胞；CCK-8；2-NBDG；葡萄糖吸收

【中圖分類號】R285.5??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）20-0020-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320006

Effect of Alisol A on Glucose Absorption in Vitro

LIN Yanling1? HONG Lingbing1? QIU Zhilong1? WANG Chenwei1? CAI Zenghong1

YANG? Xiaoye1? ZENG? Minjie1? ZHANG Weiyun1，2*

1.Department of pharmacy， Xiamen Medical College/Xiamen Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Bio-engineering，

Xiamen 361023，China;

2.College of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350122， China

Abstract：Objective To investigate the effect of Alisol A on the glucose absorption activity of human hepatoma cells （HepG2 cells）.Methods Cell Counting Kit-8 method （CCK-8） was used to determine the viability of HepG2 cells， and 2-NBDGmethod was used to determine the glucose absorptioncapacity of cells. HepG2 cells were cultured in different media， and the fluorescence intensity of cells was detected by flow cytometry， so as to investigate the effects of different concentrations of alisol A on the glucose absorption of HepG2 cells. Results CCK-8 experiment showed that alisol A had no obvious effect on the viability of HepG2 cells in the range of 1 ～ 10 μmol/L. The results of glucose absorption experiment showed that alisol A had the ability to promote the glucose absorption of HepG2 cells in different degrees.Conclusion Alisol A can promote the glucose absorption of HepG2 cells to a certain extent. It suggested that Alisol A may be one of the active ingredients of Alisma orientalis in hypoglycemic.

Keywords：Alisol A; HepG2Cells; CCK-8; 2-NBDG; Glucose Absorption

澤瀉是澤瀉科植物東方澤瀉Alisha Orientale （Sam.） Julep.或澤瀉Alisma plantag-aquatica Linn.的干燥塊莖。主產(chǎn)于福建、四川、江西、廣東等地，是川、閩的道地藥材。澤瀉性寒，味甘、淡，具有降濁化脂、利水滲濕、泄熱的功效［1］。研究［2-6］表明，澤瀉具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗炎等作用。澤瀉含有多種化學(xué)成分，包括三萜類、二萜類、揮發(fā)油、含氮化合物、苯丙素和其他成分。澤瀉醇A是澤瀉中主要的一種活性三萜類成分，有報(bào)道［7］提到澤瀉醇A對3T3-L1脂肪細(xì)胞具有降血糖的作用，但尚未有研究對HepG2細(xì)胞的降血糖作用進(jìn)行探討。HepG2細(xì)胞是一種具有正常肝細(xì)胞生物活性的人源肝癌細(xì)胞，表面存在眾多高親和力的胰島素受體，當(dāng)胰島素受體數(shù)目下降到一定程度時，HepG2細(xì)胞對胰島素作用產(chǎn)生抵抗，抵抗程度與胰島素水平和作用時間成正比［8］，且HepG2細(xì)胞具有無限增殖，易于體外培養(yǎng)的特點(diǎn)，故利用此細(xì)胞來研究澤瀉醇A對體外葡萄糖吸收的影響。羅格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，可改善胰島素抵抗，從而降低血糖。羅格列酮以胰島素作為輔助因子才能降低血糖，屬于胰島素增敏劑［9］，在2型糖尿病患者的治療中廣泛應(yīng)用。因此本研究以澤瀉醇A為研究對象，以羅格列酮為陽性對照藥，探究澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響，以期為澤瀉醇A降血糖作用的開發(fā)利用提供初步的理論依據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FC 500 流式細(xì)胞儀（美國 Becton Dickinson公司）。

1.2? 材料? 澤瀉醇A（純度HPLC≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；羅格列酮、胰島素、CCK-8試劑、葡萄糖熒光示蹤劑2-［N-（ 7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl） amino］-2- deoxy-D-glucose（2-NBDG）均購自美國安諾倫生物科技有限公司；葡萄糖（純度GC≥99.5%，SIGMA-ALDRICH公司）；胰蛋白酶（美國gibco公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline， PBS）均購自北京蘭杰柯科技有限公司。

2? 方法

2.1? HepG2細(xì)胞培養(yǎng)? 將HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2? CCK-8法測定細(xì)胞活力? 參考文獻(xiàn)［10-12］方法，將細(xì)胞以3000個/孔接種于96孔板，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對照組、1 μmoL/L澤瀉醇A組和10 μmol/L澤瀉醇A組，給藥后培養(yǎng)1 h，每孔加入10%CCK-8溶液，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后于 450 nm處測定各孔吸光度值。設(shè)置空白對照組的吸光度為100%，計(jì)算1 μmol/L和10 μmoL/L澤瀉醇A組的細(xì)胞活力。

2.3? 澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收能力的檢測探究? 澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收能力的影響，利用葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG結(jié)合流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞熒光強(qiáng)度。參考文獻(xiàn)［13，14］方法，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液稀釋到1×105 個/ mL，接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對照組、含羅格列酮的陽性對照組（羅格列酮濃度分別為1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L）以及含澤瀉醇A的藥物組（澤瀉醇A濃度分別為1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L）。以上各組分別使用4種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，即無血清DMEM低糖培養(yǎng)基（5.5 mmoL/L）、無血清DMEM高糖培養(yǎng)基（30 mmoL/L）、含1 μmoL/L胰島素的無血清DMEM低糖培養(yǎng)基和1 μmoL/L胰島素的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2個復(fù)孔，其中一孔加入10 μmoL/L的2-NBDG，另外一孔不加2-NBDG，已扣除細(xì)胞和藥物本身的背景熒光強(qiáng)度。加藥結(jié)束后，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。隨后加入4 ℃的PBS重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，使用流式細(xì)胞儀在波長為488 nm下測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。設(shè)置空白對照組熒光強(qiáng)度為100%。

2.4? 數(shù)據(jù)處理? 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3? 結(jié)果

3.1? 澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞活力的影響? 與空白對照組相比，澤瀉醇A在1 μmoL/L和10 μmoL/L濃度下均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞活力無明顯影響（圖1）。

3.2? 澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低糖條件下，與空白對照組相比， 1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L羅格列酮和1 μmoL/L澤瀉醇A均能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，其中羅格列酮的吸收能力略高于澤瀉醇A（圖2）。

在低糖含胰島素的條件下，與空白對照組相比， 1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L羅格列酮和1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L澤瀉醇A均能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，且澤瀉醇A與相對應(yīng)濃度的羅格列酮促進(jìn)葡萄糖吸收能力差異不大，其中澤瀉醇A和羅格列酮均在濃度為5 μmoL/L時HepG2細(xì)胞對葡萄糖吸收的效果尤為明顯（圖3）。

在高糖條件下，與空白對照組相比，1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L羅格列酮均能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，而澤瀉醇A僅在5 μmoL/L濃度下能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，在1 μmoL/L和10 μmoL/L濃度下無促進(jìn)作用（圖4）。

在高糖含胰島素的條件下，與空白對照組相比，5 μmoL/L和10 μmoL/L羅格列酮能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，其中5 μmoL/L羅格列酮促進(jìn)作用更明顯；5 μmoL/L和10 μmoL/L澤瀉醇A也能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，其中10 μmoL/L澤瀉醇A促進(jìn)作用更顯著，但1 μmoL/L羅格列酮和1 μmoL/L澤瀉醇A均無促進(jìn)作用（圖5）。

4? 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，嚴(yán)重高血糖會出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀：多飲、多尿、多食和體重減輕。糖尿病還會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、心腦血管疾病以及糖尿病腎病等，給患者的身心健康帶來嚴(yán)重的影響，增加其致殘、致死率等［15-16］。近30多年來，我國糖尿病患病率顯著增加。根據(jù)我國最新全國性糖尿病流行病學(xué)調(diào)查情況匯總，以世界衛(wèi)生組織（WHO）診斷標(biāo)準(zhǔn)，我國18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%，且目前糖尿病以2型糖尿病為主，1型糖尿病和其他類型糖尿病較少見［17］。因此，尋找一款治療2型糖尿病的藥物至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多學(xué)者［18-20］研究中草藥并通過動物藥理實(shí)驗(yàn)證明其有降糖效果，研究發(fā)現(xiàn)中草藥中許多活性成分如三萜類、植物多糖、生物堿、苷類以及中藥多肽等降糖效果顯著，廣泛用于2型糖尿病的治療。

研究［7，21］表明，澤瀉具有促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖吸收能力。Li Q等［22］研究表明澤瀉醇A具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。澤瀉醇A作為澤瀉中主要的一種活性三萜類成分，可能為澤瀉降血糖的活性成分之一。本研究先采用CCK-8法測定細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1～10 μmoL/L范圍內(nèi)，澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞活力無明顯影響。再采用葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG，利用流式細(xì)胞儀測定澤瀉醇A對HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響，采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，以不同濃度的澤瀉醇A和羅格列酮對HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基加入胰島素處理的條件下，1 μmoL/L、5 μmoL/L和10 μmoL/L澤瀉醇A在低糖培養(yǎng)基中以及5 μmoL/L和10 μmoL/L澤瀉醇A在高糖培養(yǎng)基中均能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，提示澤瀉醇A可能有促進(jìn)葡萄糖吸收的潛力，同時提示澤瀉醇A可能與羅格列酮一樣同屬于胰島素增敏劑［9］，但尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。在培養(yǎng)基未加入胰島素處理的條件下，1 μmoL/L澤瀉醇A在低糖培養(yǎng)基中以及5 μmoL/L澤瀉醇A在高糖培養(yǎng)基中均可促進(jìn)HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，提示澤瀉醇A可能有降血糖的作用。后續(xù)仍需進(jìn)一步的探究具體的機(jī)理，可采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［23］探究澤瀉醇A的治療潛能和作用機(jī)制，或者探究葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（Sgk1）等糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA水平［24］，進(jìn)一步解釋澤瀉醇A的降血糖機(jī)制。

綜上，研究表明澤瀉醇A能促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收能力，可能具有降血糖的潛能，以期為澤瀉醇A降血糖作用的開發(fā)利用提供初步的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-02-02? 編輯：劉? 斌）