汪單蘭 魯小慧 譚妮 蘇夢婷 龔羽婷 何貴*

惠普爾病是一種罕見的傳染病，可表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、體重減輕、關(guān)節(jié)炎等多系統(tǒng)非特異性癥狀，基礎(chǔ)免疫低下或缺陷通常會導(dǎo)致更復(fù)雜的臨床表現(xiàn)［1-2］?；萜諣栶B(yǎng)障體（Tropheryma whipplei）是細胞內(nèi)寄生菌，基因組大小約0.9Mbp；為惠普爾病的病原體，可表現(xiàn)出臨床癥狀，也可表現(xiàn)為無癥狀攜帶者［1，3］。常規(guī)的細菌培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)、PCR 檢測方法不易檢出，很難診斷這種感染。由于感染癥狀的非特異性，該細菌在鑒別診斷中很常見。宏基因二代測序技術(shù)（Metagenomic nextgeneration Sequencing，mNGS）經(jīng)過近10 年的發(fā)展，在臨床檢驗醫(yī)學(xué)中逐漸被認可。相較于常規(guī)的病原體檢測方法，mNGS 檢測具有耗時短、能夠同時檢測多種病原體、靈敏度高、特異性好等特點［4］。目前，采用mNGS 技術(shù)檢測惠普爾養(yǎng)障體的文獻報道并不多。

1 臨床資料

1.1 一般資料回顧性分析2020 年9 月-2023 年6 月期間在本院進行mNGS 檢測的樣本，共計2531例。樣本采集遵循無菌操作原則。檢測對象年齡范圍為1-100 歲，平均值為（50.73±20.89）歲?；颊叩哪挲g、性別和樣本類型等基本信息從朗伽系統(tǒng)獲取。本研究遵循《赫爾辛基宣言》中的倫理原則，經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（SYSKY-2023-806-01）。

1.2 方法（1）宏基因二代測序技術(shù) 樣本類型包括肺泡灌洗液、痰液、外周血、腦脊液、胸腹水和組織等。不同類型樣本的前處理方法不完全相同，樣本前處理后提取核酸。通過質(zhì)控的核酸再片段化、pre-PCR 和PCR 擴增建庫。文庫質(zhì)控后，再pooling 文庫和上機測序。二代測序使用的平臺為illumina NextSeq 550，采用單端測序方法，讀長75nt 或40nt。（2）宏基因生信分析 測序下機的fastq數(shù)據(jù)，過濾低質(zhì)量序列后，使用Burrows-Wheeler 工具與人類參考基因組（hg19）比對，提取未比對上hg19 的序列。將去除宿主序列的數(shù)據(jù)，通過宏基因組數(shù)據(jù)庫進行微生物分類注釋。（3）系統(tǒng)發(fā)育樹分析mNGS 是全基因測序技術(shù)，由mNGS 測序數(shù)據(jù)分析進化親緣關(guān)系時，選用了基于單核苷酸多態(tài)性（SNP）的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。首先從fastq數(shù)據(jù)中提取惠普爾養(yǎng)障體序列，然后用megahit v1.2.9［5］將惠普爾養(yǎng)障體序列拼接成contigs。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的另外19 株惠普爾養(yǎng)障體基因組序列從NCBI 下載［6］。然后，用snippy v4.4.0 建索引、比對和call SNP 分析，最后用FastTree v2.1.11［7］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 統(tǒng)計方法分類變量用百分比表示。服從正態(tài)分布的連續(xù)變量用（±s）表示。采用t檢驗或Pearson 檢驗方法進行比較分析。P＜0.05 表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在2531 例mNGS 樣本中，共檢測出18 例惠普爾養(yǎng)障體，結(jié)果如圖1-A 所示，陽性檢測率為0.71%。其中，呼吸系統(tǒng)來源的mNGS 樣本例數(shù)為1090 例，惠普爾養(yǎng)障體陽性檢測率為1.55%（17 例/1090 例），與文獻報道的陽性檢測率相近［8］。圖1-A 中，總reads 指mNGS 測序檢測到的惠普爾養(yǎng)障體序列數(shù)；reads 百分數(shù)指惠普爾養(yǎng)障體序列數(shù)與所測到的細菌或?qū)倏傂蛄袛?shù)的百分數(shù)。t檢驗比較分析惠普爾養(yǎng)障體陰性與陽性患者的年齡有無差異，P值為0.52，無顯著差異，見圖1-B 所示。

圖1 mNGS 對惠普爾養(yǎng)障體的檢測結(jié)果

Pearson 檢驗比較分析惠普爾養(yǎng)障體陰性與陽性患者的性別有無差異，計算得χ2為7.57，P值＜0.05，差異顯著，表示女性是惠普爾養(yǎng)障體的易感人群，數(shù)據(jù)見表1。將mNGS 樣本類型分為呼吸系統(tǒng)來源和其他來源兩大類。其中，呼吸系統(tǒng)來源樣本類型包括肺泡灌洗液、肺組織和痰液，其他來源樣本類型包括外周血、腦脊液、胸腹水等。比較分析惠普爾養(yǎng)障體陰性與陽性結(jié)果的樣本類型有無差異，經(jīng)Pearson 檢驗計算得出χ2為19.51，P值＜0.05，差異顯著，表示惠普爾養(yǎng)障體在呼吸系統(tǒng)易感，數(shù)據(jù)見表2。表1 和表2 中，小括號內(nèi)的數(shù)值為理論頻數(shù)。

表1 惠普爾養(yǎng)障體感染與性別的關(guān)系

表2 惠普爾養(yǎng)障體感染與樣本類型的關(guān)系

由20 株惠普爾養(yǎng)障體（基因組信息［9］見表3）的基因組序列構(gòu)建基于SNP 的進化樹分析。其中1 株為本科室mNGS 檢出的惠普爾養(yǎng)障體，命名為Guangzhou1；另外19 株基因組序列從NCBI 下載。構(gòu)建進化樹序列比對時，選用了基因組完整的Twist 作為參考基因組。構(gòu)建成的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示，包含3 個主要分支，來自中國廣州的Guangzhou1 和來自法國的2 株Slows、Pneumo30 位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個子段內(nèi)，與法國來源的這2株菌親緣關(guān)系更近。有文獻報道深圳來源的惠普爾養(yǎng)障體與來自德國的TW08/27 親緣關(guān)系更近［9］；這提示，惠普爾養(yǎng)障體進化親緣關(guān)系與地理起源關(guān)系不顯著。

表3 株普爾養(yǎng)障體基因組信息

圖2 株普爾養(yǎng)障體進化樹分析

3 討 論

惠普爾養(yǎng)障體屬于放線菌目纖維素單胞菌科養(yǎng)障體屬，是細胞內(nèi)寄生菌，難以培養(yǎng)檢出。該細菌擴增復(fù)制速度非常慢。在2000 年-2020 年期間，文獻中關(guān)于該菌的檢測方法主要為PCR 檢測、免疫組織化學(xué)；樣本來源于消化系統(tǒng)、心臟、關(guān)節(jié)、腦等組織，以消化系統(tǒng)為主。近5 年開始出現(xiàn)使用mNGS 檢測惠普爾養(yǎng)障體的文獻報道。

在2023 年7 月3 日以“whipplei mNGS”、“whipplei Metagenomic”為關(guān)鍵詞在pubmed 檢索出15 篇文獻，以“惠普爾宏基因”為關(guān)鍵詞在知網(wǎng)檢索出8 篇文獻。其中，以呼吸系統(tǒng)樣本為主。我們統(tǒng)計顯示惠普爾養(yǎng)障體在呼吸系統(tǒng)的檢出率高于其他類型樣本。由于消化道標本存在污染其他樣本的高風險，臨床mNGS 不建議用于檢測糞便、肛拭子等消化道樣本。該文章中，消化系統(tǒng)來源的樣本少于10 例，故無法統(tǒng)計消化系統(tǒng)的陽性檢出率情況。

進化樹分析可用于研究菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，也可以在疾病爆發(fā)期間識別病原體的來源。在這項研究中，我們報道了一個Guangzhou1的基因組序列，它是使用宏基因組測序數(shù)據(jù)組裝而成。另外19 株惠普爾養(yǎng)障體基因組數(shù)據(jù)從NCBI 下載。我們對這20 株惠普爾養(yǎng)障體的核酸序列進行比對、提取單核苷酸多態(tài)性信息后，再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。研究確定了菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。并發(fā)現(xiàn)，即使是來源于不同地理區(qū)域的惠普爾養(yǎng)障體也有密切的發(fā)育關(guān)系，菌株與其地理起源之間沒有相關(guān)性，這與文獻報道一致［9］。

總之，我們使用宏基因組測序技術(shù)（mNGS），回顧性分析難以培養(yǎng)檢出的惠普爾養(yǎng)障體的陽性率和檢出率高的好發(fā)部位。此外，從中國廣州獲得一個惠普爾養(yǎng)障體基因組組裝contigs 序列，并采用進化樹分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。因此，我們認為mNGS 技術(shù)有助于檢測和分析難以培養(yǎng)檢出的微生物。