蘇小婷 張明生

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上第三大常見(jiàn)惡性腫瘤和第二大惡性腫瘤死亡原因[1-2]。免疫治療的出現(xiàn)為惡性腫瘤治療帶來(lái)新的希望,其對(duì)黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等不同類(lèi)型的惡性腫瘤臨床療效顯著[3-4]。免疫治療只對(duì)少數(shù)高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)型CRC效果顯著,而對(duì)占95%以上的微衛(wèi)星穩(wěn)定/錯(cuò)配修復(fù)功能完整(MSS/pMMR)型CRC并不敏感,也就是常說(shuō)的“冷腫瘤”狀態(tài)[5]。所以,目前如何提高M(jìn)SS/pMMR型CRC患者的免疫治療療效,將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁崮[瘤”是腸癌免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。許多研究表明抗腫瘤免疫反應(yīng)受腸道菌群影響,通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群可改善抗腫瘤免疫反應(yīng)[6]。但是,腸道菌群是否影響抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)單抗對(duì)MSS型CRC的治療效果還需要進(jìn)一步的探索。抑瘤腸菌(TSE)是由與腫瘤免疫相關(guān)的特殊腸道細(xì)菌和抗腫瘤免疫促進(jìn)物等組成的藥物,可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡進(jìn)而促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。CT26細(xì)胞屬于MSS型小鼠CRC細(xì)胞系,對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的敏感性不高[7]。本研究構(gòu)建了MSS型CRC荷瘤小鼠模型,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了TSE聯(lián)合抗PD-1單抗治療CRC的療效的影響并對(duì)其作用機(jī)制做了初步探索。

材料與方法

1.材料:6～8周齡,體重18～20 g的雌性BALB/c小鼠,購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,在同濟(jì)醫(yī)院科研大樓動(dòng)物中心的無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)別的屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26購(gòu)自尚恩生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%EDTA胰蛋白酶消化液均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;小鼠CD8抗體購(gòu)自英國(guó)ABcam公司;TSE購(gòu)自博吉弘康(嘉興)生物醫(yī)藥有限公司;抗PD-1單克隆抗體購(gòu)自Leinco公司。小鼠流式抗體LIVE/DEAD(FVS510)、CD45(APC-CY7)、CD3(APC)、CD4(PE)、CD8a(FITC)均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。

2.方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng):CT26腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

(2)建立小鼠皮下移植瘤模型[8]:將之前擴(kuò)增的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用PBS洗滌、稀釋后制備腫瘤細(xì)胞懸液,濃度為5×106個(gè)/ml,置于冰盒中保存,以保證腫瘤細(xì)胞活力。提前一天用剃毛刀將小鼠右背下側(cè)的毛發(fā)剃光,并用耳標(biāo)對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記。用1 ml胰島素針吸取200 μl細(xì)胞懸液皮下注射至小鼠右背下側(cè)的部位。

(3)測(cè)量小鼠皮下移植瘤的體積和監(jiān)測(cè)小鼠體重:用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量小鼠皮下移植瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑,腫瘤體積=(最長(zhǎng)徑×最短徑2)/2;每隔2天測(cè)量小鼠腫瘤大小和稱(chēng)重。

(4)分組及處理:皮下注射后的5～7天,當(dāng)小鼠皮下移植瘤體積生長(zhǎng)到50～100 mm3時(shí),將所有小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、TSE單藥組(TSE組)、αPD-1單藥組(αPD-1組)、TSE聯(lián)合αPD-1組(聯(lián)合組),每組小鼠各10只。處理方式:對(duì)照組每2天腹腔注射1次生理鹽水,并每天予200 μl生理鹽水灌胃處理;TSE組每2天腹腔注射1次生理鹽水,并每天予200 μl TSE灌胃處理(TSE≥120億CFU/ml);αPD-1組每2天腹腔注射1次αPD-1 5 mg/kg,并每天予200 μl生理鹽水灌胃處理;聯(lián)合組每2天腹腔注射1次αPD-1 5 mg/kg,并每天予200 μl TSE灌胃處理。所有小鼠均連續(xù)處理14天。

(5)腫瘤組織樣本的獲取和染色:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以頸椎脫臼法處死小鼠,獲取皮下移植瘤,于PBS中漂洗后用濾紙吸干并進(jìn)行稱(chēng)重及拍照記錄腫瘤大體圖片。各組均取適量腫瘤組織置于4%多聚甲醛中放置24～48 h,脫水、石蠟包埋、脫蠟、切片,再行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化染色。HE染色用于確證實(shí)驗(yàn)所取組織為腫瘤組織,并可以觀察結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)特征。免疫組化染色用于檢測(cè)腫瘤組織中的CD8+T細(xì)胞,用CD8一抗孵育好的切片用DAB試劑盒進(jìn)行染色,等切片脫水后,再使用中性膠進(jìn)行固定,然后在顯微鏡下觀察。用白光掃描儀采集圖像,用NDP.View2軟件分析圖像。

(6)流式細(xì)胞術(shù):將分離的小鼠皮下移植瘤組織和脾臟剪碎、研磨制成勻漿,將含IV型膠原酶(1 mg/ml)、透明質(zhì)酸酶(0.01 mg/ml)、DNase1(0.002 mg/ml)的混合消化酶置于37 ℃恒溫消化45 min,消化完成后加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂紅,多次離心后制成單細(xì)胞懸液,然后使用200目濾網(wǎng)洗滌和過(guò)濾以去除雜質(zhì)。采用固定活力染色510區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,再用抗小鼠流式抗體進(jìn)行染色。染色樣品在CytoFLEX-3激光13色流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析,并使用FlowJo 10.0軟件分析制圖。

結(jié) 果

1.4組小鼠皮下移植瘤體積比較:對(duì)照組、TSE組、αPD-1組及聯(lián)合組小鼠皮下移植瘤平均體積依次減小[(1 314.09±267.75)mm3、(855.89±145.38)mm3、(470.04±98.21)mm3、(261.85±76.68)mm3,P<0.05],見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠離體的皮下移植瘤組織體積比較

2.4組小鼠皮下移植瘤組織HE染色和免疫組化染色結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,αPD-1組和聯(lián)合組有大面積的腫瘤壞死組織。免疫組化染色結(jié)果顯示,對(duì)照組、TSE組、αPD-1組及聯(lián)合組小鼠皮下移植瘤組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)量依次升高[(14.83±4.26)、(68.17±9.13)、(122.50±13.26)、(192.67±29.68),P<0.001]。見(jiàn)圖2。

圖2 4組小鼠皮下移植瘤組織HE染色和CD8+T細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果(A、E:對(duì)照組;B、F:TSE組;C、G:αPD-1組;D、H:聯(lián)合組;A、B、C、D:HE染色,×200;E、F、G、H:免疫組化染色,×200)

3.4組小鼠皮下移植瘤組織和脾臟組織中CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞與CD3+CD4+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞比較:皮下移植瘤組織流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,αPD-1組小鼠CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞高于對(duì)照組,聯(lián)合組小鼠CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞高于對(duì)照組、TSE組及αPD-1組(P<0.05);而TSE組小鼠CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞與對(duì)照組及αPD-1組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠皮下移植瘤組織中CD3+CD4+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞和脾臟組織中CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠皮下移植瘤組織和脾臟組織CD3+CD8+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞與CD3+CD4+T細(xì)胞/CD45+細(xì)胞比較

討 論

CRC具有高發(fā)病率和不良預(yù)后的特征,是人類(lèi)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一[9-10]。局限性CRC的5年生存率為91%,轉(zhuǎn)移性CRC的五年生存率不超過(guò)20%[11]。惡性腫瘤的免疫治療對(duì)不同類(lèi)型惡性腫瘤患者顯示出明顯的療效,包括治療后病情的長(zhǎng)期緩解,并有希望治愈小部分已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤患者。但腸癌目前的免疫治療進(jìn)展并不順利,不如其他惡性腫瘤取得的效果顯著,很大原因是大部分CRC為MSS/pMMR型,如何提高免疫治療在MSS/pMMR型CRC的療效一直是臨床亟待解決的問(wèn)題。

近來(lái)關(guān)于腫瘤與腸道菌群的研究越來(lái)越多,普遍認(rèn)為腸道微生物群是動(dòng)物和人類(lèi)惡性腫瘤免疫治療療效相關(guān)的關(guān)鍵因素[12-13]。腸道菌群與免疫治療療效息息相關(guān)[14],改善腸道菌群的分布有可能提高免疫治療的療效[15-16]。調(diào)節(jié)腸道菌群的主要方法有糞菌移植(FMT)、口服益生菌、益生元等,直接運(yùn)用活共生物種或細(xì)菌菌群。腸道菌群容易受到遺傳和外部環(huán)境因素的嚴(yán)重影響,而不同地區(qū)的微生物環(huán)境通常存在相當(dāng)大的差異,導(dǎo)致腸道微生物群結(jié)構(gòu)和組成的變化[17]。

由于一個(gè)人的腸道微生物組失調(diào)不一定反映另一個(gè)人的腸道微生物組失調(diào),因此,有時(shí)FMT不一定可以促進(jìn)抗PD-1單抗的抗腫瘤效應(yīng)[18]。FMT通過(guò)復(fù)雜的方式發(fā)揮作用,難以預(yù)測(cè)FMT結(jié)果,且FMT后存在未知病原體擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[19]。此外,許多問(wèn)題需要系統(tǒng)和科學(xué)的評(píng)估,如劑量、給藥途徑和這種療法的長(zhǎng)期療效。目前,腸道菌群療法缺乏明顯的便利性和重復(fù)性,臨床上也沒(méi)有統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)。TSE是通過(guò)科學(xué)方法篩選出的9種細(xì)菌,分別是長(zhǎng)雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、青春雙嗜酸乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌嗜熱鏈球菌、兩歧雙歧桿菌,以固定的比例和劑量開(kāi)發(fā)出的食品級(jí)產(chǎn)品(食品生產(chǎn)許可證編號(hào)為SC10632117100037),已被證實(shí)不僅可預(yù)防疾病,還有參與主動(dòng)免疫調(diào)節(jié)的功效。

雖然TSE可改善腸道微生物群的失衡,但其是否能與腫瘤免疫治療產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用還并不明確,有待進(jìn)一步研究。因此,在本研究中我們通過(guò)構(gòu)建MSS型CRC荷瘤小鼠模型,觀察TSE聯(lián)合抗PD-1單抗治療MSS型CRC能否比單純免疫治療產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果及其可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明,αPD-1組和聯(lián)合組的腫瘤增殖速度低于其他兩組,同時(shí)聯(lián)合組的抑瘤作用顯著強(qiáng)于αPD-1單藥組。通過(guò)操縱腸道微生物群來(lái)改善腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞浸潤(rùn)是一個(gè)研究較多的領(lǐng)域,但仍停留在初級(jí)階段[20]。有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群促進(jìn)抗PD-1單抗治療CRC的效果依賴(lài)于CD8+T細(xì)胞,腸道菌群可影響腫瘤微環(huán)境,增加腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn),可將腫瘤微環(huán)境重新編程為免疫治療敏感的“熱”狀態(tài)[21]。在本研究中,抗PD-1單抗只能誘導(dǎo)腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)量輕度增加,這可能是抗PD-1單抗單藥治療效果不佳的原因之一[22]。然而,當(dāng)抗PD-1單抗與TSE聯(lián)合使用時(shí),與單藥組相比,TSE聯(lián)合αPD-1組顯著增加了腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn),體現(xiàn)了TSE良好改善腫瘤免疫微環(huán)境的作用。

TSE能有益地調(diào)節(jié)腸道菌群并增強(qiáng)MSS型CRC荷瘤小鼠的抗PD-1單抗功效,CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加是其中一個(gè)機(jī)制[23]。還有很多問(wèn)題并不清楚,包括腸道菌群種類(lèi)的改變和相互影響、具體有哪些細(xì)胞因子或信號(hào)通路的參與,臨床能否重復(fù)出同樣的結(jié)果等,均為我們即將開(kāi)展的研究。TSE具有菌群組成明確,劑量統(tǒng)一,服用方便,安全可靠等特點(diǎn),克服了以往腸道菌群治療的缺陷。我們的研究也證實(shí)了TSE聯(lián)合抗PD-1單抗能夠提高免疫治療的療效和改善腫瘤微環(huán)境,使“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”,為抗PD-1單抗治療MSS型CRC提供了一個(gè)新思路,是一種很有前景的治療策略,具有重要的臨床意義。