黃澤琪 張昆

七氟醚（sevoflurane，Sev）是嬰兒最常用的揮發(fā)性麻醉劑之一。隨著兒科手術(shù)數(shù)量和類型的增加，早期和重復(fù)暴露于七氟醚的情況迅速增加。許多研究表明，發(fā)育中的大腦暴露于七氟醚會(huì)導(dǎo)致成年期長(zhǎng)期神經(jīng)認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)障礙［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒期的靈長(zhǎng)類動(dòng)物暴露于七氟醚可引起海馬CA1 區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化，引起長(zhǎng)期行為缺陷［2］。此外，臨床報(bào)告表明，接受麻醉的嬰兒表現(xiàn)出長(zhǎng)期行為和記憶障礙，這些缺陷與突觸功能和神經(jīng)元回路的紊亂有關(guān)［3］。

CRMP2（collapsin response mediator protein 2，CRMP2）為崩塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在神經(jīng)元極性建立和軸突導(dǎo)向中起重要作用。神經(jīng)元極化是神經(jīng)元的小突起分化成軸突和樹突的階段，增加CRMP2 的表達(dá)能夠改變海馬神經(jīng)元的極化，并在神經(jīng)元中誘導(dǎo)多軸突［4］。同時(shí)，CRMP2 活性受到磷酸化狀態(tài)的精確調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動(dòng)物模型中，在EAE 的發(fā)作高峰期，病變周圍的軸突中磷酸化的CRMP2 增加［5］。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)七氟醚能夠引起CRMP2 不同位點(diǎn)的磷酸化引起神經(jīng)發(fā)育異常。但CRMP2 是否為七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)毒性途徑的確切靶點(diǎn)，目前尚未可知。

因此，本研究擬采用海馬定位注射技術(shù)，調(diào)控SD 幼鼠海馬CRMP2 的表達(dá)，研究CRMP2 在七氟醚所致發(fā)育大鼠遠(yuǎn)期記憶功能障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑SD 大鼠七氟醚暴露密封裝置，電熱恒溫水浴箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），冰凍切片機(jī)（Leica），微量注射器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），熒光顯微鏡Leica DMi8（Germany），七氟醚（雅培有限公司），野生型CRMP2 腺病毒（WT-CRMP2）（和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司），CRMP2 抗體（CST）；β-actin 抗體（Santa Cruz）。

1.2 動(dòng)物與分組出生3 天的SD 幼鼠（postnatal day 3，P3）購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中山大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件編號(hào)：SYSU-IACUC-2023-000306

1.2.1 SD 幼鼠海馬定位注射 8 只P5 幼鼠通過微量注射器將2 ul 臺(tái)盼藍(lán)稀釋液通過海馬體表定位進(jìn)行注射染色，10 min 后處死取出大腦組織，切片顯微鏡觀察臺(tái)盼藍(lán)注射位置。

1.2.2 海馬轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRMP2 腺病毒效率 6 只P5幼鼠隨機(jī)分成WT-NC 組和WT-CRMP2 組，將WTNC 和帶有熒光蛋白GFP 的WT-CRMP2 腺病毒稀釋成1.0×109，將2 ul 病毒注射進(jìn)海馬區(qū)，3 天后處死，部分取海馬組織行Western-blot 檢測(cè)CRMP2 表達(dá)，部分取大腦組織切片，熒光顯微鏡下觀察感染率。

1.2.3 場(chǎng)景恐懼記憶實(shí)驗(yàn)分組 30 只P5 幼鼠隨機(jī)分別為Air+WT-NC 組，Sev+WT-NC 組，Sev+WTCRMP2 組，腺病毒注射后養(yǎng)至P7，進(jìn)行air 或Sev暴露4 h，P31-P32 進(jìn)行情景恐懼實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法（1）SD 幼鼠海馬定位注射位置的確定將臺(tái)盼藍(lán)溶于4%生理鹽水中，過濾待用。P5 幼鼠用高濃度Sev 迅速麻醉后，用微量注射器從前囟向后2-3 mm，向左或向右1-2 mm，深度1-2 mm，注射2 ul 臺(tái)盼藍(lán)溶液染色，注射后密切觀察幼鼠的呼吸、皮膚顏色等生命體征。（2）幼鼠Sev 暴露模型建立根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，將Sev 組幼鼠置于密封箱中，經(jīng)氧氣將Sev 輸送至密封箱中，氣體檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)Sev、O2和CO2濃度，維持2.8%的Sev 濃度。air 組幼鼠置于另一玻璃箱，通入空氣。兩組動(dòng)物玻璃箱均置于36℃水浴箱中，暴露4 小時(shí)。

1.4 Western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá)海馬定位注射3 天后將幼鼠處死，冰上分離幼鼠大腦海馬組織，加入裂解液勻漿后提取蛋白，BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)平各組蛋白濃度，行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入CRMP2 和β-actin 抗體。

1.5 組織冰凍切片SD 幼鼠大腦海馬腺病毒注射后3 天后處死，取大腦組織固定、漂洗和脫水后，放入OCT 包埋劑中冷凍和保存，切片機(jī)切取大腦組織，熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白觀察腺病毒表達(dá)情況。

1.6 場(chǎng)景恐懼記憶實(shí)驗(yàn)將P31 大鼠放置于帶有電擊的試驗(yàn)箱中，適應(yīng)120 秒后，分別在120 秒、180 秒、240 秒、300 秒和360 秒時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行白噪音刺激（2000Hz；90dB），持續(xù)30 s，并在聲音刺激最后2s 同時(shí)給予持續(xù)2 s 的足部電擊（1mA），以建立恐懼記憶模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后讓動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)繼續(xù)停留2 分鐘后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。24 h 后將大鼠放回實(shí)驗(yàn)箱，記錄大鼠木僵時(shí)間（8 min）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPad 9 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。用單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)多個(gè)組均數(shù)間進(jìn)行比較，并采用Turkey 檢驗(yàn)對(duì)各組行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 確定SD 幼鼠海馬定位注射位置以幼鼠頭部前囟為原點(diǎn)，向左或向右偏1 mm，向后2.5 mm，進(jìn)針2 mm，行海馬定位注射臺(tái)盼藍(lán)溶液染色，大體解剖可見海馬區(qū)有臺(tái)盼藍(lán)溶液。冰凍切片顯微鏡下見海馬區(qū)有穿刺孔徑，孔徑附近有臺(tái)盼藍(lán)染料（圖1）。

圖1 A、B 分別為×0、×40 倍數(shù)下的大腦組織切片

2.2 WT-CRMP2 腺病毒轉(zhuǎn)染效率與對(duì)照組相比，WT-CRMP2 組CRMP2 的表達(dá)未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組無法檢測(cè)到綠色熒光。WT-CRMP2 組中海馬和大腦皮質(zhì)區(qū)均檢測(cè)到綠色熒光（圖3），表明大腦皮質(zhì)和海馬均感染了腺病毒，并成功表達(dá)了CRMP2。

圖2 病毒轉(zhuǎn)染后Western-Blot 的檢測(cè)結(jié)果

圖3 病毒轉(zhuǎn)染后免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果（×0）

2.3 WT-CRMP2 腺病毒對(duì)七氟醚誘導(dǎo)的大鼠恐懼實(shí)驗(yàn)的影響在恐懼實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練中，大鼠在每個(gè)時(shí)間段的“木僵”時(shí)間逐漸增加，且大鼠在各個(gè)階段的“木僵”時(shí)間百分比相近，未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4 A）。24 h 后行記憶檢測(cè)，與Air+WT-NC 組相比，Sev+WT-NC 組的大鼠“木僵”時(shí)間明顯降低（P＜0.001）。與Sev+WT-NC 組相比，Sev+WT-CRMP2 組大鼠“木僵”時(shí)間明顯恢復(fù)（P＜0.01）（圖4 B）。

圖4 A 每個(gè)訓(xùn)練階段木僵時(shí)間的百分比；B 記憶檢測(cè)時(shí)木僵時(shí)間的百分比；**P＜0.01；***P＜0.001。

3 討 論

3.1 大鼠海馬成功轉(zhuǎn)染腺病毒并表達(dá)了CRMP2海馬位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，是參與學(xué)習(xí)和記憶的重要腦區(qū)。同時(shí)，海馬在體表的位置較易定位，本研究通過臺(tái)盼藍(lán)染料顯示了海馬在體表的定位，后續(xù)通過此定位進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。由于腺病毒轉(zhuǎn)染效率高，表達(dá)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染3-4 天表達(dá)達(dá)到高峰，因此，本研究選擇腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染并在表達(dá)高峰期檢測(cè)CRMP2 表達(dá)，結(jié)果沒有明顯變化?？赡苁且?yàn)樵撓俨《編в猩窠?jīng)元特異性-syn 序列，無法感染除神經(jīng)元以外的細(xì)胞。且提取的蛋白不僅有神經(jīng)元，還有大量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證感染效率，我們構(gòu)建了帶有-GFP 序列的WT-CRMP2 腺病毒，免疫熒光結(jié)果顯示海馬和皮質(zhì)均有綠色熒光，說明腺病毒成功轉(zhuǎn)染海馬并表達(dá)了CRMP2。

3.2 促進(jìn)CRMP2 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了七氟醚所致的遠(yuǎn)期記憶功能障礙CRMP2 在神經(jīng)元中參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐的動(dòng)力學(xué)以及突觸組裝、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和鈣離子穩(wěn)態(tài)等［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，在海馬神經(jīng)元中過表達(dá)的CRMP2，突觸蛋白表達(dá)增多，興奮性突觸后電流振幅和頻率增強(qiáng)，樹突棘形成和成熟增多［7］。Fu 等人發(fā)現(xiàn)反復(fù)短期七氟醚暴露會(huì)導(dǎo)致突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)下降，海馬可塑性功能障礙，引起大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力受損［8］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚能夠引起不同位點(diǎn)CRMP2 磷酸化，引起大鼠學(xué)習(xí)和長(zhǎng)期記憶功能損害。與本次研究結(jié)果相符，促進(jìn)CRMP2 的表達(dá)改善了七氟醚誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)期記憶功能障礙，提示七氟醚可能是通過干擾CRMP2 的功能，參與大鼠遠(yuǎn)期記憶功能障礙。

綜上所述，本研究通過在新生幼鼠海馬轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRMP2 腺病毒，發(fā)現(xiàn)七氟醚誘導(dǎo)新生大鼠遠(yuǎn)期記憶功能障礙的機(jī)制可能與抑制CRMP2 表達(dá)有關(guān)。