鄧雅文 張智賢 陳百計(jì) 段朝暉 謝曉英

萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌（VREfm）是醫(yī)院獲得性感染和疾病控制和預(yù)防中心重點(diǎn)監(jiān)控的病原菌，約占衛(wèi)生保健相關(guān)腸球菌感染的三分之一［1］。VREfm 在中國(guó)的患病率相對(duì)較低。近兩年全國(guó)耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌（VREfm）發(fā)病率從2.2%升至3.2%（http：//www.chinets.com/），我院數(shù)據(jù)亦從13.3%升至26.4%（http：//www.carss.cn/），由此可見(jiàn)我院的VREfm 發(fā)病率近兩年快速上升且顯著高于全國(guó)平均水平，這對(duì)醫(yī)院耐藥菌感染控制帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。通常多重耐藥菌在ICU 被檢出的比例比其他科室高，然而目前還缺乏我院VREfm 的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。在本研究中，我們選擇ICU 進(jìn)行了一項(xiàng)單中心研究，以評(píng)估我院ICU 中VREfm 的流行傳播情況。

1 臨床資料

1.1 一般資料2022 年6 月至2023 年7 月從ICU患者細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本中分離的21 株VREfm 納入研究，同一個(gè)患者選第一次符合條件的菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株屎腸球菌ATCC29212 購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。本研究經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SYSKY-2023-469-01）。根據(jù)國(guó)家立法和制度要求，本研究不需要受試者法定監(jiān)護(hù)人/近親屬的書(shū)面知情同意。從醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集的患者年齡、性別、Charlson評(píng)分、合并癥、住院時(shí)間、標(biāo)本類(lèi)型。ICU 科室含普通ICU、急診ICU（EICU）、心血管內(nèi)科ICU（CCU）、心血外科ICU、神經(jīng)科ICU、兒科ICU（PICU）。

1.2 方法（1）VREfm 鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)全部菌株復(fù)蘇后經(jīng)Vitek MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行重新鑒定，藥敏試驗(yàn)采用Vitek2 全自動(dòng)微生物分析儀的GP67 卡以及手工KB 法（替考拉寧）進(jìn)行檢測(cè)，藥敏結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2023 年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，替加環(huán)素采用歐洲抗微生物藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)。（2）分子流行病學(xué)選取耐藥基因vanA、vanB、vanD、vanM 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳，對(duì)陽(yáng)性基因送測(cè)序并在PUBMED 進(jìn)行確認(rèn)。屎腸球菌7 個(gè)管家基因（atpA、ddI、gdh、purK、gyd、pstS、adk）的引物序列和反應(yīng)條件參考MLST網(wǎng)站（https：//pubmlst.org/）。所有PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，并通過(guò)MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//efaecium.mlst.net）進(jìn)行序列型（sequence type，ST）比對(duì)分析。用Mega11 分析軟件構(gòu)建最小生成樹(shù)分析各菌株之間的親緣關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)于單個(gè)患者的人口學(xué)和臨床特征，分類(lèi)變量用數(shù)字和百分比進(jìn)行匯總，連續(xù)變量用（±s）進(jìn)行描述。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。采用Mega11 軟件對(duì)不同背景下的相關(guān)STs 采用BURST 算法進(jìn)行最小生成樹(shù)（MLST）分析。

2 結(jié) 果

2.1 VREfm 在ICU 的流行情況我院ICU 患者VREfm 患病率在2022 年下半年和2023 年上半年分別為12.12%和33.33%。VREfm 陽(yáng)性患者年齡（65± 15）歲，最常見(jiàn)的標(biāo)本類(lèi)型為尿液和血液（n=5；23.81%），普通ICU 的患者攜帶VREfm 的比例最高（n=10；47.62%），腦血管疾病和糖尿病是常見(jiàn)的并存病（n=7；33.33%），見(jiàn)表1。PCR 結(jié)果顯示，21株實(shí)驗(yàn)菌株均檢出vanA 基因。見(jiàn)表2。

表1 2022 年-2023 年ICU 感染VREfm 患者的人口學(xué)特征及臨床特征

表2 21 株VREfm 分子流行病學(xué)及抗生素耐藥譜

2.2 抗菌藥物敏感性21 株菌均經(jīng)Vitek MS 質(zhì)譜儀重新鑒定確認(rèn)且均表現(xiàn)出多重耐藥。菌株耐藥率分別為：萬(wàn)古霉素（100%）、利奈唑胺（0%）、替加 環(huán) 素（9.52%）、青 霉 素（100%）、四 環(huán) 素（90.48%）、氨芐西林（100%）、紅霉素（76.19%）、左氧氟沙星（100%）、環(huán)丙沙星（95.24%）、呋喃妥因（85.71%）、替考拉寧（100%）。見(jiàn)表2。

2.3 分離株的遺傳分布利用7 位點(diǎn)MLST 將所有VREfm 菌株分為3 個(gè)STs，且均為CC17 克隆群。21株菌株中優(yōu)勢(shì)STs為ST80（n=16，76.19%），其次是ST78（n=3，14.29%）和ST2460（n=2，9.52%）。2022 年下半年分離的VREfm 的STs 均為ST80，在2023 年出現(xiàn)了其他STs 菌株的流行。見(jiàn)表2。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果提示三種STs 有相同的起源，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相同STs菌株內(nèi)部親緣關(guān)系較近。見(jiàn)圖1。

圖1 21 株VREfm MLST 方法聚類(lèi)圖

3 討 論

近幾十年來(lái)，VREfm 在ICU 的定植或感染率從13.01%到34.25%不等［2］，北京某大型教學(xué)三甲醫(yī)院ICU 患者定植比例也達(dá)31.1%［3］。本研究中，我院VREfm 檢出率高于全國(guó)平均水平，且患者呈現(xiàn)年齡大、病情重、合并疾病多等特點(diǎn)，為VRE 的傳播提供了有利條件。腸球菌的糖肽耐藥是由van 基因簇介導(dǎo)的，其中vanA 和vanB 基因在世界范圍內(nèi)報(bào)道最多。vanM 基因在2006 年在我國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，目前流行于北京、上海和杭州等城市，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)該基因的存在，這表明廣州地區(qū)的VREfm 與其他大型發(fā)達(dá)城市有差異。

攜帶vanA 抗性基因的菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧都具有高水平的耐藥性，稱(chēng)為vanA 表型［4，5］，本研究中VRE 基因型與耐藥表型一致。三種不同基因型耐藥性有區(qū)別，ST2460 菌株對(duì)TGC 和高水平鏈霉素耐藥，屬于高耐藥菌株，而ST78 菌株對(duì)呋喃妥因和四環(huán)素敏感，其抗生素耐藥性沒(méi)有其他兩個(gè)型別的嚴(yán)重。由此可見(jiàn)分子流行病學(xué)研究對(duì)VREfm 的防治有重要的意義，臨床需重視高耐藥菌株的流行且要根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗生素，提高抗菌效果。

我院ICU 優(yōu)勢(shì)STs 是ST80，但因菌株數(shù)量少尚不能判斷是否有ST80 基因型VREfm 的爆發(fā)。ST80 是國(guó)外醫(yī)院中比較常見(jiàn)的STs［6］，國(guó)內(nèi)近兩年才可查到深圳有該型別的流行［7］。廣州和深圳經(jīng)濟(jì)和人員往來(lái)頻繁，由此推測(cè)ST80 可能存在相鄰城市間傳播流行，這與北京、杭州等城市的VREfm 流行情況有差異，因此我國(guó)南方地區(qū)在控制VREfm 的傳播流行和治療上需要尋找更有針對(duì)性的對(duì)策。我院ICU 分離的VREfm 均屬于克隆復(fù)合體（CC）17，這個(gè)復(fù)合群是醫(yī)院內(nèi)傳播的主要克隆群［8］，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)描述的一致。MLST 聚類(lèi)分析結(jié)果提示可能存在同一醫(yī)院的同一病房或不同病房之間循環(huán)克隆傳播，必須予以高度關(guān)注。

我們的研究分析了近兩年ICU 住院患者VREfm 的攜帶/感染情況，發(fā)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)較少見(jiàn)的ST80 型別VREfm 的流行，為研究整個(gè)南方地區(qū)VREfm 流行和防控提供重要參考。