張安妮,劉阿慧,張學(xué)紅

胚胎發(fā)育的關(guān)鍵在于正常受精,然后才開始早期有絲分裂[1]。然而,在輔助生殖助孕過程中部分患者表現(xiàn)為反復(fù)受精障礙[2]。2018年Sang等[3]首次報道了WEE2基因突變導(dǎo)致的反復(fù)受精失敗,強調(diào)了WEE2基因在卵母細胞成功受精過程中發(fā)揮的重要作用。本文重點總結(jié)WEE2基因的定位、結(jié)構(gòu)、功能,及其與不孕突變相關(guān)的研究進展,探討WEE2在卵母細胞減數(shù)分裂中的分子作用機制。

1 WEE2調(diào)控卵母細胞減數(shù)分裂的機制

1.1 WEE2基因的功能

WEE激酶蛋白家族包括3個成員:WEE1、MYT1和WEE2[4]。WEE1作為從屬于絲氨酸/蘇氨酸家族的蛋白激酶,編碼含647個氨基酸的蛋白質(zhì),定位于細胞核,是細胞周期G2/M 檢查點的關(guān)鍵調(diào)控因子,通過磷酸化周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)的第15位酪氨酸實現(xiàn)G2/M期阻滯,為DNA修復(fù)提供時間[5]。MYT1是一種特殊的神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用,與其相關(guān)的疾病包括室周白質(zhì)軟化癥和科芬-西里斯綜合征9型。此外,定位在細胞質(zhì)的MYT1以膜結(jié)合激酶的身份抑制細胞周期推進[6-7]。

WEE2基因作為WEE1基因的同源體,也稱為WEE1B,編碼的卵母細胞特異性蛋白酪氨酸激酶是WEE激酶蛋白家族中高度保守的一員[8]。WEE2蛋白由567個氨基酸組成,分子量為62 kD,其在人體組織中首次發(fā)現(xiàn)于男性睪丸,后因多種研究指明WEE2在維持小鼠卵母細胞減數(shù)分裂停滯方面發(fā)揮重要作用,且依賴母體表達而將其歸類為母源性基因[9],后已證實與卵母細胞反復(fù)受精失敗密切相關(guān)[4]。WEE2在卵母細胞減數(shù)分裂周期中穩(wěn)定存在,參與生發(fā)囊(germinal vesicle,GV)階段停滯、中期退出和原核形成的過程,其定位隨功能需要而發(fā)生“核漿轉(zhuǎn)位”的變化,表達水平在受精后急速下降。WEE2的功能在不同物種之間高度保守,可通過磷酸化細胞周期蛋白2(cell division control protein 2,Cdc2)的酪氨酸(tyrosine,Tyr)第15位點以抑制Cdc2活性,從而抑制細胞周期蛋白B1-細胞周期蛋白2復(fù)合物(又稱成熟促進因子,mature promoting factor,MPF)活性。正常受精卵內(nèi)含父源、母源兩個原核,WEE2突變后MPF活性過高會導(dǎo)致患者原核形成失敗、受精障礙。

1.2 WEE2在不同物種卵母細胞減數(shù)分裂時期的定位

哺乳動物的卵母細胞在胎兒期啟動第一次減數(shù)分裂且停滯在GV時期。促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰在排卵前作用于卵泡體細胞并促進減數(shù)分裂的恢復(fù),該過程以生發(fā)泡破裂(GV break down,GVBD)作為形態(tài)學(xué)標志[10]。進入第一次減數(shù)分裂中期的卵母細胞染色體逐漸排列整齊,等紡錘體完成組裝并遷移至皮質(zhì)區(qū)后開啟第一次減數(shù)分裂后期[11]。待第一極體排出后卵母細胞進入第二次減數(shù)分裂,再次阻滯在分裂中期。隨后,在精子進入排卵期卵母細胞卵漿后,鈣振蕩啟動了卵母細胞激活過程,包括皮質(zhì)顆粒胞吐、通過皮質(zhì)反應(yīng)阻斷多精子、第二次減數(shù)分裂、遺傳物質(zhì)復(fù)制、第二極體排出和原核形成等事件[12]。

Nakanishi等[13]通過Northern印跡分析方法檢測WEE2 mRNA在正常人體組織中的分布,發(fā)現(xiàn)其在睪丸中的含量最豐富。女性WEE2 mRNA僅在成熟卵母細胞中表達,且其水平在受精后立即下降[14]。WEE2蛋白在細胞核與細胞質(zhì)中均有分布,且突變常影響WEE2在核漿之間的運輸。近年來相繼證實WEE2在小鼠、豬和恒河猴等不同物種卵母細胞中存在且以相似機制調(diào)節(jié)減數(shù)分裂[15]。馬浚仁等[16]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性WEE2 mRNA 在小鼠卵母細胞受精后的各個時期均有表達,WEE2蛋白活性隨著細胞周期的進程而變化,在G1期保持平穩(wěn),進入S期后表達逐漸增高,隨后在M期迅速下降。G1期和S期WEE2蛋白主要集中分布于細胞核,在G2期彌散分布于細胞漿,在G2末期至M期又重新分布于細胞核。顯微注射外源性WEE2 和細胞分裂周期蛋白25B(cell division cycle protein 25B,CDC25B)至小鼠卵母細胞細胞質(zhì)中,結(jié)果提示二者在調(diào)節(jié)過程中存在“核漿轉(zhuǎn)位”,且具體定位與內(nèi)源性WEE2分布相同。后續(xù)研究證實,核輸出信號(nuclear export signal,NES)和核定位信號(nuclear localization signal,NLS)是此轉(zhuǎn)位實現(xiàn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為調(diào)控小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程所必需[17]。

Shimaoka等[18]檢測了WEE2在豬組織細胞中的定位,結(jié)果顯示豬的WEE2基因存在NLS和NES,并在減數(shù)分裂停滯的卵母細胞中發(fā)現(xiàn)了其唯一的核定位。核定位可能用于維持WEE2的區(qū)域高濃度,在該機制下僅需少量WEE2即可發(fā)揮維持卵母細胞減數(shù)分裂停滯的全部功能。Hanna等[4]用長雙鏈RNA干涉下調(diào)恒河猴WEE2基因的表達,結(jié)果顯示卵母細胞重新開始停滯在GV期的減數(shù)分裂,檢測結(jié)果表明WEE2 mRNA主要表達于恒河猴卵巢內(nèi)的卵母細胞,含量隨排卵進程而累積;而在睪丸中含量微小。WEE2蛋白在GV完整卵母細胞中有特定的核定位,通過降低cAMP濃度的方式抑制非人靈長類動物卵母細胞的減數(shù)分裂進程。

1.3 WEE2調(diào)控卵母細胞阻滯與恢復(fù)的機制

WEE2在卵母細胞的成熟中發(fā)揮著重要作用。受精過程的完成依賴于卵母細胞的成熟,哺乳動物卵母細胞經(jīng)歷兩次阻滯后方可成熟,首次阻滯在排卵前的減數(shù)分裂I期(meiosis phase I,MI),MI完成后卵母細胞進入減數(shù)分裂II期(meiosis phase II,MII),再次阻滯后完成受精。WEE2基因主要在GV期停滯、MII中期退出和原核形成過程中通過參與從PKA到MPF的信號通路來調(diào)控減數(shù)分裂[19-20]。

1.3.1 WEE2在GV期停滯中的作用 GV期WEE2作為獨特的卵母細胞特異性激酶,以失活Cdc2的方式抑制MPF,維持第一次阻滯。WEE2介導(dǎo)的Cdc2去磷酸化對MPF失活至關(guān)重要[21]。MPF由催化亞單位CDK1/ CDC2和調(diào)節(jié)亞單位細胞周期蛋白B(Cyclin B)組成,是目前人們普遍接受的“細胞周期發(fā)動機學(xué)說”中的核心部件,MPF的調(diào)節(jié)主要通過WEE2是否磷酸化tyr15從而抑制CDK1/CDC2活性來發(fā)揮作用[22]。

1.3.2 WEE2在MII期退出、原核形成中的作用 在小鼠及人類卵母細胞中,若WEE2下調(diào),MPF的升高會導(dǎo)致MII期退出及原核形成的失敗,導(dǎo)致受精失敗。受精后人類WEE2主要參與MII期卵母細胞阻滯的恢復(fù)。精子誘導(dǎo)卵母細胞進行一系列Ca2+振蕩后鈣離子濃度急劇升高,鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMKII)被激活從而磷酸化激活靜息狀態(tài)的WEE2。活化WEE2通過磷酸化Cdc2的第15位酪氨酸使其活性降低導(dǎo)致MPF失活,使得卵母細胞完成MII期退出及原核形成的過程。

WEE2可通過CaMKII的磷酸化效應(yīng)激活,也有部分磷酸酶如細胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle protein 25A,CDC25A)和CDC25B等使其失活。相關(guān)研究表明,CDC25B通過去除由WEE激酶家族催化的抑制性磷酸化來激活MPF,促進細胞周期進程,是小鼠卵母細胞減數(shù)分裂的關(guān)鍵啟動因子。PKA是一種cAMP依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以通過平衡WEE2激酶和CDC25磷酸酶活性來形成MPF活性的雙向調(diào)節(jié)環(huán),其活性降低會導(dǎo)致WEE2無法磷酸化而失活,抑制了CDK1活性同時激活MPF,導(dǎo)致后續(xù)GVBD、減數(shù)分裂恢復(fù)等步驟的失敗[23]。因此,維持高水平活性PKA在減數(shù)分裂中很重要[24]。在哺乳動物的卵母細胞中,高濃度的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)使減數(shù)分裂停滯在MI前期的雙線期[25]。排卵前LH峰觸發(fā)卵泡信號極聯(lián),降低卵漿cAMP水平從而導(dǎo)致PKA失活,導(dǎo)致CDC25B轉(zhuǎn)移到細胞核,積累的CDC25B可導(dǎo)致穿梭到細胞核中的MPF碎片的去磷酸化和活化[13]?；罨腗PF促進WEE2轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)。WEE2的易位進一步促進核MPF的激活。隨后,CDC25B可能從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì),WEE2也從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核。兩者的相互易位是卵母細胞第一次分裂的先決條件,這種核漿轉(zhuǎn)位受 PKA失活及MPF活化調(diào)節(jié)。后期細胞周期蛋白B降解促使MPF失活,失活的MPF強制執(zhí)行Ca2+指令,減數(shù)分裂恢復(fù),停滯在MII的卵母細胞繼續(xù)成熟[26]。自此原核形成、合子發(fā)育、胚胎細胞的有絲分裂開始進行[26]。

2 WEE2在不孕突變中的研究進展

在Sang等[2]2018年的實驗研究中,4名女性的反復(fù)受精失敗具體表現(xiàn)為卵母細胞原核形成障礙,但在卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)術(shù)后第二極體均可正常排出。這項研究首次顯示W(wǎng)EE2突變與人類低受精率事件之間的關(guān)聯(lián),確定了4種遵循孟德爾常染色體隱性遺傳模式的4種純合突變表型,分別為p.Asp234His、p.Thr493Asnfs*39、p.His337Tyrfs*24和p.Glu75Valfs*6,受影響個體均存在純合子功能缺失突變或純合子移碼蛋白截短突變。在后續(xù)研究中注射WEE2 RNA后的突變卵母細胞可成功受精并形成囊胚[3]。目前已報道WEE2與受精失敗相關(guān)的22個突變,包括移碼、剪切、缺失等,WEE2突變在完全受精失敗(total fertilization failure,TFF)病例中起重要作用。但WEE2在人類受精過程中的機制尚不完全清楚,需要確定新的突變。

劉頓等[27]報道了世界首例WEE2基因純合突變的男性案例,通過全外顯子測序技術(shù)鑒定了WEE2在c.G585C(p.K195N)位點的純合錯義突變,證實該基因突變僅影響女性生殖,對男性生育無不良影響;且雜合子不致病,唯純合突變導(dǎo)致卵母細胞受精障礙。目前并沒有證據(jù)表明WEE2變異和男性不育相關(guān),只有一項研究假設(shè),WEE2 反義RNA1(WEE2-AntiSense RNA 1,WEE2-AS1)的增加可能會下調(diào)WEE2表達,從而改變精子成熟的自然時間,增加異常精子細胞的數(shù)量[28]。

ICSI已成為通過體外受精治療各種形式的男性因素不育和先前周期受精失敗最有效的方法[29]。目前,改善ICSI后某些受精失敗病例結(jié)局的方法有人工卵子激活術(shù)(artificial oocyte activation,AOA)[30]。Zhao等[28]報告ICSI-AOA無法挽救存在WEE2突變女性患者的反復(fù)受精失敗,因此確診攜帶突變的女性可以避免ICSI或ICSI-AOA的重復(fù)治療。此外,有研究將WEE2 RNA注射到具有WEE2突變患者的卵母細胞中,可在體外成功受精以及形成囊胚[3]。但考慮由于注射后卵母細胞中轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)數(shù)量尚不確定,胚胎質(zhì)量可能會受到影響等其他生物安全因素,其在臨床中的應(yīng)用仍有待進一步探索。

3 小結(jié)

本文系統(tǒng)分析總結(jié)了WEE2基因在不同物種卵母細胞減數(shù)分裂各時期的定位情況,及其在卵母細胞GV期停滯、MII期退出和原核形成過程中的作用及相關(guān)機制,不僅為原核形成失敗患者的基因診斷揭示了一個潛在的靶點,而且為不孕癥女性的治療提供了遺傳咨詢證據(jù)。