方元平,徐俊偉,劉 勝,劉辰哲,向 福

(1．經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃岡 438000;2．黃岡師范學(xué)院 李時(shí)珍大健康研究院,湖北 黃岡 438000;3．湖北省中科產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,湖北 黃岡 438000)

鄂東大別山地區(qū)被譽(yù)為中原地區(qū)的物種資源庫(kù)和生物基因庫(kù),也是湖北境內(nèi)幸存的唯一一塊較完整的華東植物區(qū)系代表地,誕生了“醫(yī)藥雙圣”李時(shí)珍、“北宋醫(yī)王”龐安時(shí)等五大名醫(yī)[1]。該地區(qū)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,復(fù)雜的地理環(huán)境,獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì)為藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了有利條件,盛產(chǎn)葛根、魚(yú)腥草、茯苓等藥材[2]。大別山地區(qū)的葛根資源豐富,據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,葛根的年產(chǎn)量在 2 萬(wàn)噸以上,與葛根相關(guān)的產(chǎn)業(yè)鏈已逐步成為促進(jìn)大別山革命老區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要手段[3]。

酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng),酒幾乎滲透到人們生活的各個(gè)領(lǐng)域。隨著全民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,飲酒已經(jīng)成為危害全國(guó)人民身體健康的第三大行為危險(xiǎn)因素[4-6]。相較于現(xiàn)代的化學(xué)藥物治療方法,中藥材作為天然藥物,具有副作用小、效果顯著、成本較低等優(yōu)勢(shì),在飲酒所引起的疾病或傷害中可以發(fā)揮不可替代的治療作用[7]。隨著市場(chǎng)上各種天然類制品的研發(fā),利用藥食同源的中藥材研制解酒類功能保健品將成為未來(lái)發(fā)展的新趨勢(shì)[8-10]。

近年來(lái)的研究結(jié)果顯示,具有解酒保肝作用的方劑能顯著降低血清中轉(zhuǎn)氨酶活性[11-13]?，F(xiàn)代研究表明,魚(yú)腥草[14]、葛根[15-17]、枳椇子[18-20]和茯苓[21-22]的提取物均能顯著抑制大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性,減少急性酒精中毒的醒酒時(shí)間。同時(shí)查閱中醫(yī)典籍,選取魚(yú)腥草、葛根、枳椇子和茯苓四種藥食同源的藥用植物制備湯劑[23],研發(fā)解酒類功能保健品。本研究以葛根、魚(yú)腥草、茯苓、枳椇子四種藥用植物為材料,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法對(duì)葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的配伍比例進(jìn)行優(yōu)化,旨在研發(fā)能顯著抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方,為葛根等大別山特色藥用植物資源的科學(xué)開(kāi)發(fā)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)腥草、葛根、枳椇子、茯苓、新鮮豬肝:黃岡市市售;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測(cè)試盒:南京建成生物工程研究所;葛根枳椇子壓片糖果:北京同仁堂興安保健科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī):浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠;全自動(dòng)煎藥壺:康雅順電器有限公司;UV1901CS型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方藥液的制備工藝

準(zhǔn)確稱定充分干燥至恒定質(zhì)量的葛根、魚(yú)腥草、茯苓和枳椇子,相繼放入全自動(dòng)煎藥壺中。加入適量蒸餾水,使之浸沒(méi)藥材,水平面超過(guò)藥材表面2～3 cm。靜置30 min,使藥材濕潤(rùn)變軟,內(nèi)部細(xì)胞組織變得疏松膨脹。煎煮完成后,待藥液冷卻,4000 r/min離心10 min,取上清液[24-26],放入 4 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

查閱文獻(xiàn)[27],在505 nm波長(zhǎng)下,繪制谷丙轉(zhuǎn)氨酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合公式Y(jié)=-0.018234851+453.80261X-781.85836X1.5+3398.7434X2.5-2394.9714X3(X為絕對(duì)OD值,Y為ALT活力),R2>0.99。

利用新鮮豬肝制備1%的組織勻漿,以1∶10的比例加入10倍體積的藥液,制成樣品。參考文獻(xiàn)中記載的方法處理樣品[27],在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。

1.3.3魚(yú)腥草復(fù)方配伍的單因素試驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)藥典》的推薦用量[28],準(zhǔn)確稱定充分干燥至恒定質(zhì)量的葛根、魚(yú)腥草、枳椇子和茯苓,設(shè)置藥用量為3 g、6 g、9 g、12 g、15 g,自變量藥材取設(shè)定的5個(gè)用量水平,其他藥材取中間用量9 g,以谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性為指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn)[29],每組煎煮藥液做三個(gè)平行樣。由此考察各自變量用量對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響。

根據(jù)多篇文獻(xiàn)報(bào)道[30-31],基于研制解酒類功能保健品的研究目的,設(shè)置對(duì)照組。中國(guó)中藥行業(yè)的老字號(hào)北京同仁堂在市場(chǎng)上暢銷的直暢飲(葛根枳椇子壓片糖果)具有顯著的解酒保肝藥理作用,因此,設(shè)置等量蒸餾水的空白對(duì)照組和等量葛根枳椇子壓片糖果溶液的陽(yáng)性對(duì)照組。用 GraphPad Pism 和 SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4魚(yú)腥草復(fù)方配伍的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

為了進(jìn)一步探討葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的配伍比例,根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理[32],以魚(yú)腥草(X1)、葛根(X2)、茯苓(X3)和枳椇子(X4)為自變量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性為響應(yīng)值,用-1,0,1 編碼每一個(gè)變量的低、中、高試驗(yàn)水平,如表1所示。利用Design Expert 和Excel等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn),確定葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的最佳配伍比例。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)腥草復(fù)方配伍的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1魚(yú)腥草對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

葛根、茯苓和枳椇子的用量固定為9 g,魚(yú)腥草用量分別為3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五組單因素試驗(yàn)以及等量蒸餾水的空白對(duì)照組和等量葛根枳椇子壓片糖果溶液的陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 魚(yú)腥草對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響注:a～e表示0.01水平上的差異顯著性

由圖1可知,當(dāng)魚(yú)腥草含量較低時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平隨著魚(yú)腥草用量的升高而降低,魚(yú)腥草水平為6 g時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平達(dá)到最低,為(40.58±1.15)卡門氏單位(P<0.01),繼續(xù)增加魚(yú)腥草用量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平開(kāi)始升高。這可能是由于魚(yú)腥草含量較低時(shí),有效成分溶出,影響谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性,當(dāng)魚(yú)腥草含量較高時(shí),溶出成分濃度的升高降低對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響[33-34]。因此,魚(yú)腥草的含量對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響顯著,宜選6 g。

通過(guò)對(duì)以魚(yú)腥草用量為自變量的單因素試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行差異性分析,單因素試驗(yàn)組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制效率均顯著高于空白對(duì)照組,但低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。

2.1.2葛根對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

魚(yú)腥草、茯苓和枳椇子的用量固定為9 g,葛根用量分別為3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五組單因素試驗(yàn)以及等量蒸餾水的空白對(duì)照組和等量葛根枳椇子壓片糖果溶液的陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 葛根對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響注:a～f 表示 0.01 水平上的差異顯著性

由圖2可知,隨著葛根用量的增大,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平持續(xù)降低,葛根水平為12 g時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性最低,為(41.19±0.37)卡門氏單位(P<0.01),繼續(xù)增加葛根用量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平緩慢升高。這可能是由于葛根含量的增加,葛根總黃酮類成分、葛根多糖、葛根多肽等成分之間發(fā)生相互作用,對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的抑制作用降低[35]。因此,葛根的含量對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響顯著,宜選12 g。

通過(guò)對(duì)以葛根用量為自變量的單因素試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行差異性分析,單因素試驗(yàn)組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制效率均顯著高于空白對(duì)照組,但低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。

2.1.3茯苓對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

魚(yú)腥草、葛根和枳椇子的用量固定為9 g,茯苓用量分別為3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五組單因素試驗(yàn)以及等量蒸餾水的空白對(duì)照組和等量葛根枳椇子壓片糖果溶液的陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 茯苓對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響注:a～f 表示 0.01 水平上的差異顯著性

由圖3可知,當(dāng)茯苓含量較低時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平隨著茯苓含量的升高而降低,茯苓水平為6 g時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平達(dá)到最低,為(41.2±0.82)卡門氏單位(P<0.01),繼續(xù)增加茯苓用量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平緩慢升高。這可能是由于茯苓多糖等有效成分的溶出達(dá)到飽和,繼續(xù)加大茯苓用量,有效成分相互作用,谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性水平開(kāi)始升高[36]。因此,茯苓的含量對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響顯著,宜選6 g。

通過(guò)對(duì)以茯苓用量為自變量的單因素試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行差異性分析,單因素試驗(yàn)組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制效率均顯著高于空白對(duì)照組,但低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。

2.1.4枳椇子對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

魚(yú)腥草、葛根和茯苓的用量固定為9 g,枳椇子用量分別為3 g、6 g、9 g、12 g、15 g的五組單因素試驗(yàn)以及等量蒸餾水的空白對(duì)照組和等量葛根枳椇子壓片糖果溶液的陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 枳椇子對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響注:a～e表示0.01水平上的差異顯著性

由圖4可知,當(dāng)枳椇子含量較低時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平隨著枳椇子用量的升高而降低,枳椇子水平為6 g時(shí),谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平達(dá)到最低,為(41.09±0.88)卡門氏單位(P<0.01),繼續(xù)增加枳椇子用量,谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性水平開(kāi)始升高。這可能是由于枳椇子含量較低時(shí),有效成分溶出,持續(xù)抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性,當(dāng)枳椇子含量較高時(shí),成分之間相互作用,對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的抑制作用降低[37]。因此,枳椇子對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響顯著,宜選6 g。

通過(guò)對(duì)以枳椇子用量為自變量的單因素試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行差異性分析,單因素試驗(yàn)組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制效率均顯著高于空白對(duì)照組,但低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 魚(yú)腥草復(fù)方配伍的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的配伍比例進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。表1的結(jié)果用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合。響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面回歸模型方差分析

二元回歸多項(xiàng)式的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖5,其中響應(yīng)面和等高線形狀可直觀反映各因素的影響程度、交互作用及模型的極值情況,橢圓表示交互作用強(qiáng),圓形則交互作用較弱。由圖5可知,魚(yú)腥草與葛根、魚(yú)腥草與茯苓、魚(yú)腥草與枳椇子、葛根與茯苓及茯苓與枳椇子的等高線圖中心區(qū)域均呈橢圓形,說(shuō)明交互作用明顯。葛根與枳椇子的等高線圖中心區(qū)域呈圓形,說(shuō)明交互作用較弱。用Design Expert 8.0.6軟件自動(dòng)求解魚(yú)腥草復(fù)方最佳配伍為:魚(yú)腥草9 g,葛根10.85 g,茯苓3 g,枳椇子7.76 g,谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性理論預(yù)測(cè)值為32.98卡門氏單位。

圖5 魚(yú)腥草、葛根、茯苓和枳椇子交互作用對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響的響應(yīng)面及等高線

2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮實(shí)際操作,葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的最佳配伍修正為:魚(yú)腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g。其他條件固定,在修正后的最佳條件下測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力為(32.82±0.63)卡門氏單位,相比于理論預(yù)測(cè)值,其差值為0.49%,表明擬合的二元多項(xiàng)式模型對(duì)實(shí)際工藝操作具有一定的指導(dǎo)和預(yù)測(cè)作用。

相比于對(duì)照組,最佳配伍比例組對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性高達(dá)44.58 %的抑制率,且抑制效果顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

單因素試驗(yàn)的結(jié)果表明,魚(yú)腥草、葛根、茯苓和枳椇子對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響顯著(P<0.01),適宜配伍比例為:魚(yú)腥草6 g,葛根12 g,茯苓6 g,枳椇子6 g。但通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)的進(jìn)一步優(yōu)化,復(fù)方的最佳配伍比例為:魚(yú)腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g,在此條件下,抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的效果最佳,為(32.82±0.63)卡門氏單位,且高于陽(yáng)性對(duì)照組的抑制效果(P<0.01),可能具有良好的解酒效果。

本研究圍繞大別山地區(qū)的葛根等特色藥用植物資源,基于多篇文獻(xiàn)及中醫(yī)典籍以研制解酒類功能保健品的研究目的,設(shè)計(jì)了葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方,以谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性作為指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn),優(yōu)化葛根-魚(yú)腥草解酒復(fù)方的配伍比例。魚(yú)腥草9 g,葛根11 g,茯苓3 g,枳椇子8 g的配伍比例具有顯著的抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的效果,可能具有良好的解酒功效,為開(kāi)發(fā)利用大別山的特色藥用植物資源提供了試驗(yàn)依據(jù)。