殷祥燁，姜偉乾，韓愚弟，韓 巖

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心整形修復(fù)科，北京 100853

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞惡性增殖引起的一種皮膚惡性腫瘤[1]。在所有皮膚癌中，其發(fā)病率僅次于基底細(xì)胞癌，病死率僅次于黑色素瘤[2]。近年來，cSCC的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，高齡、日光照射等常見因素均可誘發(fā)cSCC，給人們的健康帶來了極大的威脅[3-4]。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南建議，對(duì)于無法接受手術(shù)治療的晚期cSCC患者，其治療方案首選為放療聯(lián)合順鉑的整體治療方案，不能接受放療者可采用帕博利珠單抗或西米普利單抗進(jìn)行免疫治療。靶向治療方案雖具有良好的安全性和有效性，但因缺乏臨床試驗(yàn)結(jié)果，目前仍未被列入cSCC的指南和共識(shí)[5]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在多種惡性腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化起重要作用[6]。西妥昔單抗(cetuximab，Cet)是一種單克隆抗體藥物，對(duì)EGFR具有高特異性。鑒于其優(yōu)秀的抗腫瘤效果和出色的安全性，已被用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療[7-8]。有研究表明，EGFR在cSCC中為高表達(dá)狀態(tài)，通過下調(diào)EGFR的表達(dá)可抑制cSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[9]。據(jù)此，本研究擬探討Cet對(duì)高表達(dá)EGFR的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431增殖和凋亡的影響，以期為臨床中無法接受手術(shù)治療的cSCC患者提供一種安全有效的治療可能。

材料與方法

1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431購(gòu)自武漢普諾賽公司，人永生化表皮細(xì)胞Ha-Cat購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。A-431細(xì)胞在添加10%(V/V)胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖(4.5 g/L葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HaCat細(xì)胞在添加10%(V/V)胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM低糖(1.0 g/L葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37℃，5% (V/V) CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)或接種于細(xì)胞板中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑 Cet購(gòu)自德國(guó)默克公司。Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)、Dimethyl sulfoxide (DMSO)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(4.5 g/L葡萄糖)、DMEM低糖培養(yǎng)基(1.0 g/L葡萄糖)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。抗EGFR抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，抗GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。RIPA裂解緩沖液及BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

3 主要儀器 CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)，超凈工作臺(tái)(天津泰斯特公司)，Spectra Max M8酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)，凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Tanon 4800 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能生命科學(xué)有限公司)，Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)。

4 細(xì)胞EGFR表達(dá)量篩查分析 運(yùn)用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org)，篩查并分析其所收錄的41種正常組織和腫瘤細(xì)胞系中EGFR的表達(dá)情況。

5 Western blot檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá) 向A-431細(xì)胞和HaCat細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心15 min，提取A-431細(xì)胞和HaCat細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離等量的蛋白質(zhì)，并通過凝膠電泳儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。應(yīng)用含5%脫脂牛奶的TBS-T溶液封閉PVDF膜1 h，隨后與EGFR一抗及GADPH一抗孵育過夜。最后，將PVDF膜洗滌3次，并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體在室溫下孵育2 h。Western blot圖像采用Gel成像系統(tǒng)，在膜頂部添加200 μL ECL化學(xué)發(fā)光試劑，檢測(cè)目的蛋白條帶。

6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將A-431細(xì)胞以8 × 103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)組用Cet以0.025 μg/mL ~ 200 μg/mL的濃度處理細(xì)胞48 h，對(duì)照組加入同等體積的PBS溶液。在每孔中加入10 μL的MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h，吸棄上清液體，每孔中加入200 μL的DMSO溶液，37℃恒溫條件下中低速震蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm和570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值，并計(jì)算各藥物濃度下的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)孔-對(duì)照孔)/(對(duì)照孔-空白孔)] × 100%[10]。

7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將A-431細(xì)胞接種于12孔板上(3 × 105/孔)。孵育12 h后，分別用PBS、Cet(150μg/mL)處理細(xì)胞24 h。消化、收集各組細(xì)胞，離心去除上清液，以PBS洗滌細(xì)胞，應(yīng)用1 ×binding buffer重懸細(xì)胞，先后加入Annexin V-FITC和PI，在37℃條件下避光孵育15 min。即刻用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

8 統(tǒng)計(jì)分析方法 本研究的每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示。數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行分析處理。組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EGFR在A-431細(xì)胞中的表達(dá)情況 A-431細(xì)胞來源于1例85歲的老年女性cSCC患者，是目前應(yīng)用最廣泛、最具代表性的商品化cSCC細(xì)胞系[11]。為研究A-431細(xì)胞中EGFR的表達(dá)情況，我們對(duì)人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的41種正常組織及腫瘤細(xì)胞系的EGFR表達(dá)情況進(jìn)行了篩查分析。結(jié)果表明，在所有正常及腫瘤組織細(xì)胞中，A-431細(xì)胞的EGFR表達(dá)量排名第1，且遠(yuǎn)高于其余各種細(xì)胞(圖1A)。隨后，我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)的A-431細(xì)胞及對(duì)照組HaCat細(xì)胞進(jìn)行了EGFR表達(dá)情況的對(duì)比。結(jié)果表明，A-431細(xì)胞中EGFR的表達(dá)量遠(yuǎn)高于HaCat細(xì)胞(圖1B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431的EGFR呈高表達(dá)狀態(tài)，且表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常表皮及器官組織細(xì)胞，是研究Cet靶向治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌的最優(yōu)選擇。

圖1 EGFR在各種細(xì)胞中的表達(dá)情況 A：人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的41種正常組織及腫瘤細(xì)胞系的EGFR表達(dá)鑒定；B：Western blot檢測(cè)A-431細(xì)胞及HaCat細(xì)胞EGFR表達(dá)情況Fig.1 Expression of EGFR in cells A: Identification of EGFR expression in 41 normal tissues and tumor cell lines included in human protein map database; B: Expression of EGFR in A-431 and Hacat cells detected by Western blot

2 MTT法檢測(cè)Cet對(duì)A-431細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，用Cet (0.025 μg/mL、0.25 μg/mL、2.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)處理A-431細(xì)胞48 h，A-431的細(xì)胞生存率隨Cet濃度的增加而降低。在200 μg/mL Cet濃度下，A-431的細(xì)胞生存率僅為38.65%(P＜0.01；圖2)。這表明與對(duì)照組相比，Cet可顯著抑制A-431細(xì)胞增殖，充分發(fā)揮單藥抗腫瘤作用。

圖2 Cet對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431增殖的影響Fig.2 Effect of Cet on the proliferation of A-431 cells detected by MTT assay

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cet對(duì)A-431細(xì)胞凋亡的影響我們通過Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染法在A-431細(xì)胞中對(duì)不同組別的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，Cet組在150 μg/mL濃度下，細(xì)胞凋亡率達(dá)29.85%，而空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為10.44%(P＜0.01；圖3A、圖3B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cet可通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。

圖3 Cet對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431凋亡的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cet及對(duì)照組處理后A-431細(xì)胞的凋亡情況；B：A-431細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)Fig.3 Effect of Cet on apoptosis of A-431 cellsA: Apoptosis of A-431 cells detected by flow cytometry; B: Statistics of apoptosis rate of A-431 cells

討 論

cSCC是發(fā)病率最高的皮膚惡性腫瘤之一，男性發(fā)病率為9% ~ 14%，女性發(fā)病率為4% ~ 9%[12]。由于人口壽命延長(zhǎng)以及多種因素(如日光照射等常見致癌)的影響，近些年cSCC患病率顯著增加[13]。雖然大部分cSCC患者可通過切除腫瘤或局部放療的方式獲得良好預(yù)后，但也有一部分患者表現(xiàn)出局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的傾向[14]。美國(guó)明尼蘇達(dá)州的一項(xiàng)研究表明，cSCC的局部復(fù)發(fā)通常發(fā)生在初次診斷后的2年內(nèi)。手術(shù)切除后，具有高風(fēng)險(xiǎn)特征的患者有13% ~ 41%的局部區(qū)域復(fù)發(fā)率和7% ~ 16%的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，而涉及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的cSCC患者10年生存率低于20%[15]。

考慮到種種不良預(yù)后，人們單獨(dú)提出了晚期cSCC的概念[16]。晚期cSCC包括局部晚期cSCC(lacSCC)和(或)轉(zhuǎn)移性cSCC (mcSCC)。lacSCC定義為局部晚期進(jìn)展(腫瘤已深入到皮下組織、肌肉或神經(jīng))且不再適合行手術(shù)或放射治療的cSCC。mcSCC是指已經(jīng)擴(kuò)散到原始位置外的相鄰皮膚、淋巴結(jié)或其他器官的腫瘤類型[17-18]。NCCN指南指出，手術(shù)治療是目前根治cSCC的首選方法[5]，但部分晚期cSCC患者無法通過手術(shù)得到有效治療[17]。隨著cSCC發(fā)病率的不斷提高，疑難、晚期的病例愈發(fā)多見，晚期cSCC患者治療方式的選擇在過去10年中發(fā)生了重大變化。

考慮到疾病嚴(yán)重程度、腫瘤位置和患者合并癥等因素，目前晚期cSCC患者大多采用基于順鉑的化學(xué)療法或姑息性治療方案。不過這類治療方法持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、不良反應(yīng)程度重，嚴(yán)重影響了患者的依從性，從而限制了治療效果[5,19]。隨著免疫治療、靶向治療等新興治療方式的出現(xiàn)，晚期cSCC患者的治療有了新的選擇。與傳統(tǒng)化療藥物相比，這些藥物具有程度更輕的不良反應(yīng)，在晚期疾病患者中可能具有更好的治療有效性和耐受性[20]。

EGFR是一種致癌受體蛋白酪氨酸激酶，可啟動(dòng)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。EGFR過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已在多種類型的惡性腫瘤中觀察到了EGFR的高表達(dá)[21]。目前，基于抗EGFR的靶向治療方案已成為結(jié)直腸癌等諸多高表達(dá)EGFR實(shí)體瘤的一線治療選擇[22]。為探究EGFR在cSCC中的表達(dá)情況，有研究者通過免疫組織化學(xué)染色的方式對(duì)cSCC組織樣本進(jìn)行研究，結(jié)果表明EGFR在85.7%的cSCC細(xì)胞中過度表達(dá)[16]。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR的表達(dá)在cSCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與cSCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[23-24]。目前已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制EGFR的表達(dá)可作為cSCC的有效治療策略[9,25-26]。

Cet是一種嵌合免疫球蛋白G1單克隆抗體，與EGFR的外部域結(jié)合后可誘導(dǎo)EGFR內(nèi)化和降解，阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[27]。鑒于其優(yōu)異的安全性和抗腫瘤作用，已被批準(zhǔn)用于RAS基因野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(2005年)以及晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(2020年)的治療中。雖然Cet的療效和安全性已在結(jié)直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療中得到證實(shí)，但目前有關(guān)Cet治療cSCC的研究還相對(duì)缺乏，其對(duì)cSCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚不明確。

本研究通過人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)篩查分析發(fā)現(xiàn)，EGFR在A-431細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)超其余各種細(xì)胞，是EGFR表達(dá)量最高的細(xì)胞。我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了A-431細(xì)胞和HaCat細(xì)胞中EGFR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示， 與HaCat相比，A-431細(xì)胞中EGFR確實(shí)為高表達(dá)狀態(tài)。這一結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道的cSCC中EGFR表達(dá)情況高度一致，符合Cet靶向治療的基本條件，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。

抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Cet抗腫瘤的主要作用方式。在我們的研究中，MTT結(jié)果顯示隨著Cet濃度的提高，A-431細(xì)胞的生存率逐漸降低，200 μg/mL的Cet濃度處理48 h后，A-431的細(xì)胞生存率僅為38.65%(P＜0.01)。該結(jié)果充分表明，Cet單藥可對(duì)A-431細(xì)胞的增殖造成影響，且藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力呈濃度依賴性。我們?cè)趹?yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析Cet誘導(dǎo)A-431細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，150 μg/mL的Cet濃度處理24 h后，有29.85%的A-431細(xì)胞凋亡，是對(duì)照組細(xì)胞凋亡率的2.86倍(P＜0.01)。這說明Cet單藥使用時(shí)，可通過影響細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)通路，誘導(dǎo)A-431細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用。

綜上，我們證明了Cet對(duì)EGFR高表達(dá)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A-431有較強(qiáng)的增殖抑制作用，并可誘導(dǎo)A-431細(xì)胞凋亡，有望成為晚期cSCC治療的新選擇。但Cet治療cSCC的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究，并且需臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和藥物療效。

作者貢獻(xiàn)殷祥燁：完成實(shí)驗(yàn)，論文撰寫；姜偉乾、韓愚弟：論文修改；韓巖：論文的選題、審閱及修改。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：xiangyeyin301@163.com。