孫 莉，江 源，黃登亮，侯 靜，張耀剛，田美媛，李志琴，童思賢，姜 軍

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，青海西寧 810001；2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院科研管理部，青海西寧 810001；3 青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海西寧 810001

肺癌是一種常見的呼吸道腫瘤，在我國肺癌新增病例和死亡人數(shù)均居所有惡性腫瘤之首[1]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC最為常見，占所有肺癌患者的80% ~ 85%[2]。雖然手術(shù)、放化療、生物免疫療法、分子靶向藥物等療法可延長部分肺癌患者的生存期，但治療的效果較為有限，肺癌的總體5年生存率目前仍在15%左右[3]，因此亟須探索肺癌診療的新思路和新策略。腫瘤的重要特征之一是代謝異常[4]，腫瘤細胞代謝重塑引起乳酸累積，腫瘤組織中乳酸濃度可高達20 ~30 mmol/L，平均濃度約10 mmol/L[5]。研究顯示，乳酸可作為代謝供能物質(zhì)參與NSCLC細胞三羧酸循環(huán)。在急性炎癥模型小鼠中，乳酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Mg2+釋放而參與急性炎癥過程中的組織損傷[6]。此外乳酸通過組蛋白乳酸化修飾調(diào)節(jié)巨噬細胞基因表達且改變細胞特性[7]，上調(diào)小膠質(zhì)細胞中糖酵解基因表達促進阿爾茨海默病進展[8]。因此，乳酸可作為代謝底物、信號分子和表觀遺傳修飾因子發(fā)揮重要生物學(xué)功能。乳酸作為代謝產(chǎn)物，對NSCLC細胞糖酵解是否具有反饋調(diào)節(jié)作用還不明確。本研究將探索乳酸對NSCLC細胞A549糖酵解的影響，并分析乳酸處理后A549細胞生物學(xué)特性的變化情況。

材料與方法

1 材料 人非小細胞肺癌細胞A549細胞株購于上海中科院細胞庫。乳酸(貨號：L6402)購自默克生命科學(xué)公司；DMEM(貨號：2230805)購自Gibco公司；糖酵解壓力檢測試劑盒(貨號：103020-100)和細胞增殖E-Plate檢測板(貨號：00300600890)購自安捷倫公司；HK1一抗(貨號：#2024)和PKM2一抗(貨號：#4053)購自CST公司；G6PD一抗(貨號：ab210702)和LDHA一抗(貨號：ab52488)購自Abcam公司；β-actin一抗(貨號：sc-47778)購自Santa Cruz公司。

2 細胞培養(yǎng)及處理 人非小細胞肺癌細胞A549用含10%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)基在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，分別加入終濃度為5 mmol/L和10 mmol/L的乳酸處理A549細胞24 h后，收集細胞并檢測糖酵解壓力、線粒體底物選擇以及細胞增殖、遷移和周期等生物學(xué)特征。

3 細胞代謝分析儀(Seahorse XFe96)檢測糖酵解壓力和線粒體底物選擇 每孔接種80 μL A549細胞懸液(細胞數(shù)為1.2 × 104)，糖酵解壓力測定實驗乳酸濃度設(shè)置為0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L；分析線粒體底物選擇時乳酸濃度設(shè)置為0 mmol/L、10 mmol/L，每組設(shè)置3個復(fù)孔；37°C、5% CO2培養(yǎng)24 h后，按照糖酵解壓力檢測試劑盒和線粒體底物選擇分析試劑盒說明書實時測定各組活細胞在生理溫度(37°C)下的耗氧率和細胞外酸化率。細胞外酸化率是糖酵解的關(guān)鍵指標(biāo)，可在不損傷細胞的情況下了解培養(yǎng)細胞糖酵解壓力水平；線粒體底物選擇分析實驗對于參與細胞氧化的3種主要線粒體底物(葡萄糖、谷氨酰胺和長鏈脂肪酸)，利用特異性抑制劑的不同組合，分析其依賴性、容量和靈活性。檢測完成后，用Hoechst 33258標(biāo)記細胞核并計數(shù)，對糖酵解壓力分析結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

4 實時無標(biāo)記細胞分析(real time cellular analysis，RTCA)系統(tǒng)檢測細胞的遷移與增殖能力 細胞株在進行細胞增殖實驗前1 d進行細胞傳代，實驗時滿足細胞滿度在60% ~ 80%，從培養(yǎng)箱中取出細胞，進行消化、離心后，使用完全培養(yǎng)基配制成實驗需要的細胞濃度；檢測E-Plate 16 VIEW板基線后，將細胞加入E-Plate 16 VIEW孔板；用于增殖和遷移檢測的細胞接種量分別為1.2 × 104/孔和5 × 104/孔。乳酸濃度設(shè)置為0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L；每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種細胞后，將E-Plate 16 VIEW孔板在超凈臺中室溫放置30 min使細胞充分沉降，再將E-Plate 16 VIEW孔板放到RTCA儀器中。編輯樣本信息和測定條件，開始實時動態(tài)檢測細胞遷移和增殖曲線。

5 qPCR和Western blot檢測相關(guān)基因和蛋白表達 提取RNA后，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR擴增反應(yīng)。引物序列由上海生工公司合成，并讀取Ct值，以2-△△Ct表示目的基因mRNA的相對表達水平；qPCR引物序列見表1。Western blot測定相關(guān)蛋白表達水平，細胞經(jīng)裂解后取總蛋白，進行10% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入含5%脫脂奶粉的PBS和一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜，加二抗，37℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，成像系統(tǒng)采集圖像并分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶。

6 流式細胞儀檢測細胞周期 每支流式管中加入1 × 106個細胞，加入1 mL 70%乙醇，渦旋混勻，4℃固定30 min，450 g離心5 min，棄上清，加1 mL PBS重懸細胞，450 g離心5 min后倒掉上清，加100 μL PBS，再加入1 μL RNase A (10 mg/mL)和5 μL PI(終濃度50 μg/mL)，渦旋混勻，避光孵育15 min，加1 mL PBS重懸細胞，450 g離心5 min，棄上清，加入400 μL PBS重懸上機。

7 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料以表示，所有實驗均重復(fù)3次，符合正態(tài)分布與方差齊性的兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey’s檢驗，依時間變化資料采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳酸對A549細胞糖酵解水平和線粒體底物選擇的影響 由Seahorse XFe96細胞代謝分析儀實時監(jiān)測細胞外酸化率所得的糖酵解功能曲線(圖1A)和參數(shù)指標(biāo)的計算公式(圖1B)可計算出細胞的糖酵解水平、糖最大酵解能力和糖酵解儲備等參數(shù)。結(jié)果顯示，5 mmol/L和10 mmol/L乳酸處理后A549細胞的糖酵解水平(F=84.85，P＜0.000 1；圖1C)、最大糖酵解能力(F=334.6，P＜0.000 1；圖1D)和糖酵解儲備(F=233.7，P＜0.000 1；圖1E)均降低，且加入乳酸濃度越高，糖酵解能力下降越顯著。因此，乳酸對A549細胞的糖酵解代謝具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。由于糖酵解和線粒體代謝緊密關(guān)聯(lián)，在觀察到乳酸對糖酵解的影響后，進一步通過線粒體底物選擇分析乳酸對線粒體代謝的影響；線粒體底物選擇的結(jié)果顯示：10 mmol/L乳酸處理后A549細胞對葡萄糖(圖1F)的利用無顯著改變，對脂肪酸的依賴性增強(圖1H)(P=0.018)，對谷氨酰胺(圖1G)的氧化能力減弱(P=0.019)；提示在A549細胞代謝中，乳酸可能在有些方面具有與谷氨酰胺相似的功能。因此，乳酸對A549細胞的糖酵解有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，且引起線粒體代謝底物改變。

2 qPCR和Western blot檢測糖酵解相關(guān)基因表達水平 為探索乳酸影響糖酵解水平的分子機制，我們分析了部分葡萄糖代謝相關(guān)基因的表達水平。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，乳酸處理后的A549細胞中G6PD的蛋白水平顯著下降(P=0.007)，且10 mmol/L乳酸處理組下降較5 mmol/L乳酸處理組更為顯著。 隨著乳酸處理的濃度升高，PKM2和HK1的蛋白水平微弱降低，LDHA蛋白水平略微升高(圖2A ~ 圖2B)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。qPCR結(jié)果顯示，乳酸處理后的A549細胞中HK3(P=0.048)、LDHA(P＜0.001)、LDHB(P＜0.001)(圖2C)基因mRNA水平均降低，且乳酸處理濃度越高，上述基因表達下降越顯著。qPCR實驗中10 mmol/L乳酸處理的A549細胞HK3基因Ct值太大無法進行統(tǒng)計分析，但也說明10 mmol/L乳酸處理后A549細胞中HK3基因mRNA水平下調(diào)。而PKM基因mRNA水平在兩個乳酸處理組的A549細胞中均上調(diào)(P＜0.001)，可能是PKM蛋白水平下降引起的反饋調(diào)節(jié)所致。上述結(jié)果顯示，乳酸引起葡萄糖代謝酶基因表達下調(diào)，可能是乳酸處理組A549細胞糖酵解水平下降的原因。

3 乳酸對A549細胞的遷移、增殖和周期的影響增殖和遷移能力是腫瘤細胞的重要生物學(xué)特征。RTCA系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，5 mmol/L和10 mmol/L乳酸處理后，A549細胞遷移能力減弱(F=177.3，P＜0.001；圖3A)；隨乳酸處理濃度升高，A549細胞增殖減弱(F=646.7，P＜0.001；圖3B)。以上結(jié)果提示，乳酸能夠降低A549細胞的增殖和遷移能力。進一步通過流式細胞術(shù)測定比較正常培養(yǎng)A549細胞(圖3C)和10 mmol/L乳酸處理組A549細胞(圖3D)的細胞周期變化，結(jié)果顯示相對于正常培養(yǎng)A549細胞，10 mmol/L乳酸處理的A549細胞G1期細胞增多(t=5.145，P=0.001)，S期(t=4.994，P=0.001)和M期(t=3.569，P=0.007)細胞減少(圖3E)。因此，A549細胞的遷移和增殖能力隨乳酸處理濃度增加而下降。

圖3 乳酸處理后A549細胞遷移、增殖曲線和細胞周期分析結(jié)果A：細胞遷移曲線；B：細胞增殖曲線；C：對照組細胞周期圖；D：10 mmol/L乳酸處理組細胞周期圖；E：細胞周期分析柱狀圖Fig.3 Migration and proliferation curve and cell cycle analysis results of A549 cells after lactic acid treatmentA: Cell migration curve; B: Cell proliferation curve; C: The distribution of cell cycle in the control group; D: The distribution of cell cycle in the 10 mmol/L lactate treatment group; E: Analysis of the proportion of cells in the G0/G1 phase, S phase and G2/M phase in the control group and the treatment group

4 細胞周期與遷移相關(guān)基因mRNA水平 采用qPCR對細胞周期與遷移相關(guān)基因mRNA水平進行分析，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L乳酸處理組參與細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的CCND1(圖4B)以及參與細胞周期G2/M轉(zhuǎn)換的CCNB1(圖4A) mRNA水平受到抑制(P＜0.05)，10 mmol/L乳酸處理組參與細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的CCNE1(圖4C)、CCND1和CCNB1的mRNA表達下降更為顯著(P＜0.05)；而兩個乳酸處理組中CDK2較對照組mRNA水平均上調(diào)，尤其是5 mmol/L上調(diào)最為顯著(P＜0.05；圖4D)。CDK2是由G1期進入S期的關(guān)鍵性細胞周期蛋白依賴性激酶，其mRNA水平升高可能是CCNE1、CCND1和CCNB1抑制所引起的。分析細胞遷移相關(guān)基因mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，兩個乳酸處理組A549細胞中CDH1基因mRNA水平均升高(P＜0.05；圖4E)，10 mmol/L乳酸處理組中TWIST1基因mRNA水平顯著下調(diào)(P＜0.05；圖4G)，三組SNAI2基因mRNA水平無顯著變化(圖4F)。CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白抑制細胞遷移，而TWIST1促進細胞遷移。以上結(jié)果顯示，乳酸對A549細胞增殖和遷移的抑制作用可能通過調(diào)控細胞增殖、遷移相關(guān)基因表達而實現(xiàn)。

圖4 乳酸處理后細胞周期與遷移基因mRNA表達水平Fig.4 Cell cycle and migration gene mRNA expression levels after lactate treatment

討 論

當(dāng)前，腫瘤已成為危害人類健康和生命安全的頭號殺手，基于性別、地域和年齡等流行病學(xué)因素，肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的首要原因[9]，代謝重編程長期被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志之一[10]。約100年前，有研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的糖代謝方式就是在有氧條件下的高糖酵解水平，產(chǎn)生大量乳酸，這一現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)，大量科學(xué)家在癌癥糖酵解和乳酸代謝領(lǐng)域進行了更深入的研究。盡管糖酵解途徑產(chǎn)生的能量要比三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的能量少得多，但糖酵解依然是腫瘤細胞的主要代謝方式，為合成代謝提供了多種糖酵解中間體，滿足了癌細胞快速增長的需求[11]，與正常細胞相比這種代謝方式的改變導(dǎo)致的結(jié)果就是糖酵解的產(chǎn)物乳酸在腫瘤中的積聚，而長期以來乳酸對腫瘤細胞的作用并不明確。近年大量研究揭示了乳酸在腫瘤中的作用，其在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、代謝、衰老以及干細胞分化等過程中扮演著重要的角色[12-18]。乳酸還可以刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子，促進腫瘤細胞遷移和刺激血管生成，乳酸的濃度與放療抵抗呈正相關(guān)。乳酸與疾病預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，高乳酸水平是晚期肺癌患者死亡的獨立危險因素[19-20]。

本研究以人非小細胞肺癌 A549 細胞為研究對象，檢測并研究乳酸對A549糖酵解壓力、細胞增殖、遷移和周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸負(fù)調(diào)控A549細胞糖酵解水平，并引起線粒體代謝底物選擇變化。最新研究顯示，巨噬細胞中乳酸通過共價修飾糖酵解、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)等代謝途徑中的酶調(diào)節(jié)細胞代謝過程[21]，負(fù)反饋調(diào)節(jié)糖酵解代謝酶活性，本研究發(fā)現(xiàn)乳酸可能通過調(diào)節(jié)基因表達負(fù)調(diào)控A549細胞糖酵解；因此，乳酸對糖酵解的負(fù)調(diào)控作用具有普遍性，并可能通過不同調(diào)節(jié)方式實現(xiàn)。線粒體底物選擇分析實驗中，乳酸處理后A549細胞對谷氨酰胺的利用減少，谷氨酰胺是回補三羧酸循環(huán)的重要代謝物[18]，由于乳酸也可通過代謝轉(zhuǎn)化進入三羧酸循環(huán)，所以乳酸會減少A549細胞對谷氨酰胺的利用。除影響細胞代謝外，本研究還觀察到乳酸抑制A549細胞增殖和遷移，這似乎與乳酸對腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進作用相矛盾，但腫瘤細胞具有持續(xù)增殖、侵襲能力增強、免疫逃逸和代謝重塑等多種重要特征，僅根據(jù)增殖遷移能力的改變并不能反映乳酸對腫瘤細胞的整體作用。此外，處于增殖、遷移等不同狀態(tài)的細胞對營養(yǎng)物質(zhì)和能量的需求不同，而物質(zhì)能量變化通過細胞代謝實現(xiàn)，所以細胞的增殖和遷移能力與細胞代謝狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)，本研究中糖酵解水平下降與細胞增殖遷移能力減弱之間的聯(lián)系值得進一步探究。此外，我們觀察到乳酸引起細胞代謝、增殖遷移和相關(guān)基因表達的變化，而乳酸引起基因表達變化的分子機制還不明確。

綜上所述，外源乳酸引起A549細胞糖酵解能力降低、線粒體代謝底物選擇發(fā)生改變、細胞增殖及遷移能力減弱，這種變化可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達實現(xiàn)。但糖酵解水平下降與細胞增值遷移能力減弱之間的聯(lián)系，以及乳酸影響相關(guān)基因表達的分子機制還需進一步探索。

作者貢獻姜軍：項目監(jiān)督指導(dǎo)；孫莉：總體構(gòu)思，撰寫初稿；江源：方法設(shè)計；黃登亮：調(diào)查設(shè)計；候靜：資源提供；張耀剛：數(shù)據(jù)管理；田美媛：調(diào)查設(shè)計；李志琴、童思賢：項目管理。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：747495351@qq.com。