喻潔，楊秋怡，易嘉寧，曾杰

[湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院） 乳甲外科，湖南 長(zhǎng)沙 410005]

方法：采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-204-5p 過表達(dá)和敲低對(duì)PTC 細(xì)胞系TPC-1 細(xì)胞的侵襲能力影響；通過miRDB 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-204-5p 下游靶基因，并采用Western blot 實(shí)驗(yàn)、Transwell 實(shí)驗(yàn)、GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。

結(jié)果：Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p 的TPC-1 細(xì)胞侵襲能力明顯降低，而miR-204-5p 抑制的TPC-1 細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）。miRDB 網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，TNFRSF12A 可能為miR-204-5p 下游靶基因；Western blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p 的TPC-1 細(xì)胞TNFRSF12A 表達(dá)下調(diào)，而miR-204-5p抑制的TPC-1細(xì)胞TNFRSF12A表達(dá)上調(diào)；過表達(dá)TNFRSF12A的TPC-1細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，TNFRSF12A抑制的TPC-1 細(xì)胞的侵襲能力明顯降低；TNFRSF12A 可逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 對(duì)TPC-1 細(xì)胞侵襲能力的影響（均P＜0.05）。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，TNFRSF12A 是miR-204-5p 的靶基因。

結(jié)論：miR-204-5p可靶向結(jié)合TNFRSF12A mRNA的3'UTR抑制TNFRSF12A的表達(dá)，而PTC細(xì)胞中miR-204-5p表達(dá)下調(diào)，削弱了其對(duì)TNFRSF12A 表達(dá)的抑制，從而導(dǎo)致PTC 細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。

甲狀腺癌是全球最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，已成為惡性腫瘤第8 位，為女性第4 位高發(fā)癌癥，嚴(yán)重加重全球衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，而甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌的主要形式，約占所有甲狀腺癌患者的80%～85%[1]。PTC 的主要特征之一是能夠侵入鄰近結(jié)構(gòu)，例如淋巴管。大約有10%的患者在初診時(shí)已經(jīng)具有轉(zhuǎn)移病灶。盡管大多數(shù)PTC 在生物學(xué)行為上表現(xiàn)良好，但由于其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高，仍嚴(yán)重威脅人類健康。隨著對(duì)PTC 分子發(fā)病機(jī)制的深入研究，從基因水平探討PTC 的分子機(jī)制，分析PTC 發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的改變，尋找更加有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)PTC 的預(yù)防及治療至關(guān)重要。

microRNA（miRNA）是一類小型非編碼RNA，能夠識(shí)別特定目標(biāo)mRNA 的3' 非翻譯區(qū)域（3'UTR），并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA 的降解或抑制翻譯過程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用。細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)通路往往與關(guān)鍵miRNA 分子相互協(xié)調(diào)作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。Su 等[2]發(fā)現(xiàn)miR-200a 通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖；Kim 等[3]發(fā)現(xiàn)miR-155 能驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖，其表達(dá)情況與乳腺癌患者的生存密切相關(guān)；Larson等[4]通過高通量的檢測(cè)技術(shù)在前列腺癌中建立了與腫瘤惡性進(jìn)展相關(guān)的基因和miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；Chou 等[5]發(fā)現(xiàn)在肺癌中EGFR 信號(hào)可以通過Ras/ERK/Myc 信號(hào)通路誘導(dǎo)miR-7 的表達(dá)，而miR-7 通過其靶點(diǎn)EGFR 影響Akt 信號(hào)通路的活性；Nourmohammadi 等[6]發(fā)現(xiàn)在食道癌中miR-200c 可以通過Akt 信號(hào)通路使腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性；miR-21是一種致癌的miRNA，Dan 等[7]發(fā)現(xiàn)其在體外與乳腺腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，而體內(nèi)高水平的miR-21預(yù)示著乳腺癌患者預(yù)后不良，而下調(diào)miR-21 的表達(dá)可以改善乳腺癌的疾病進(jìn)展。由此可見，miRNA分子參與了腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控功能，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后起到了關(guān)鍵性的作用。

通過前期查閱文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)[8]和筆者在PTC 細(xì)胞中相關(guān)分子表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在PTC 中呈低表達(dá)，并可能作為關(guān)鍵分子在PTC 中發(fā)揮重要作用。因此，本研究進(jìn)一步探討miR-204-5p 對(duì)PTC侵襲能力影響的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選用PTC 細(xì)胞系TPC-1 細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)要求選用1640 培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1%谷氨酰胺，將細(xì)胞放置于5% CO2（v/v）的培養(yǎng)箱中孵育，設(shè)置溫度為37 ℃。

1.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞樣本后，用TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA 的純度和濃度。按照Invitrogen 公司“用于qRT-PCR 的M-MLV 第一鏈合成系統(tǒng)”操作說明，取1～3 μg 總RNA 建立20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。繼之，使用Invitrogen 公司的“Platinum SYBR Green qPCRSuperMix-UDG with ROX”試劑盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光擴(kuò)增。

1.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

電泳膠由上層膠（濃縮膠）和下層膠（分離膠）組成，下層膠可根據(jù)不同分子量大小配置濃度不一，可分為15%、12%、10%、8%不等，上層膠濃度為5%。將配備好的膠嵌入電泳槽中，向槽內(nèi)加滿1x 電泳液，取出玻璃槽中的梳子，分別加入待測(cè)樣本，在待測(cè)樣本臨近孔中加入1 μL Protein Marker，然后繼續(xù)在電泳盒中加入電泳液。接通電源即開始電泳。然后通過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜后顯影。將A、B顯影液按1∶1 體積提前配備好，將PVDF 膜浸潤(rùn)顯影液后，通過Bio-Rad 蛋白顯影成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光處理。根據(jù)曝光后蛋白條帶的清晰程度可手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光程序和曝光時(shí)間。

1.4 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

在24 孔板下室加入500 μL 含10%FBS 培養(yǎng)基。然后用鑷子將Transwell 小室置于24 孔板內(nèi)。每孔加入200 μL 細(xì)胞懸液到Transwell 上室中。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后可進(jìn)行固定染色。取出Transwell 小室，吸走培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭Matrigengel 和上室內(nèi)的細(xì)胞。在24 孔板干凈的孔中加入4%多聚甲醛600 μL，將小室放入后固定20～30 min。棄去固定液，將小室在盛有PBS 的6 cm 皿中刷洗1 遍。用0.1%結(jié)晶紫染色5～10 min，PBS 刷洗3 遍，除去未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。適當(dāng)風(fēng)干后，在10 倍顯微鏡下選取5 個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過miRDB 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-204-5p 與TNFRSF12A 3'UTR 結(jié)合位點(diǎn)，然后分別構(gòu)建TNFRSF12A 3'UTR野生型和突變型質(zhì)粒，過表達(dá)miR-204-5p 和加入miR-204-5p 抑制劑后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分別測(cè)量野生型和突變型TNFRSF12A 3'UTR 的熒光值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每次實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3 次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。研究結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析或t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同組間的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可視化分析用Graphpad軟件。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-204-5p對(duì)PTC細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p后，TPC-1 細(xì)胞的侵襲能力減弱（圖1A），而抑制miR-204-5p 表達(dá)后，TPC-1 細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)（均P＜0.05）（圖1B）。

2.2 miR-204-5p下游靶基因分析

通過生物信息學(xué)分析，TNFRSF12A 可能為miR-204-5p 調(diào)控的靶點(diǎn)，且可能為PTC 預(yù)后標(biāo)志物[8]。有研究[9]顯示，TNFRSF12A 與血管生成相關(guān)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展至關(guān)重要。同時(shí)Tanaka 等[10]報(bào)道了血管生成和抗血管生成因子之間的平衡與PTC 的明顯侵襲相關(guān)，提示了血管生成在PTC 中的重要性。故推測(cè)這兩者與PTC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-204-5p 對(duì)TNFRSF12A 的調(diào)控，用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了過表達(dá)或抑制miR-204-5p 后PTC 細(xì)胞中TNFRSF12A 的表達(dá)情況，結(jié)果表明：過表達(dá)miR-204-5p 后TPC-1 細(xì)胞中TNFRSF12A 表達(dá)降低，抑制miR-204-5p 后TPC-1 細(xì)胞中TNFRSF12A 表達(dá)升高（均P＜0.05）（圖2A-B）。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)表明：TNFRSF12A 可增強(qiáng)TPC-1 細(xì)胞侵襲能力，而敲低TNFRSF12A 后TPC-1 細(xì)胞的侵襲能力減弱（均P＜0.05）（圖2C-D）。同時(shí)，逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)TNFRSF12A 可部分逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 對(duì)TPC-1 細(xì)胞侵襲能力的影響（均P＜0.05）（圖2E）。同時(shí)，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn） 分析也表明TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達(dá)（圖2F）。

圖2 miR-204-5p 下游靶基因分析 A：過表達(dá)miR-204-5p 后TPC-1 細(xì)胞TNFRSF12A 蛋白表達(dá)水平降低；B：加入miR-204-5p 抑制劑后TPC-1 細(xì)胞TNFRSF12A 蛋白表達(dá)水平增高；C：TPC-1 細(xì)胞過表達(dá)TNFRSF12A 后侵襲能力增強(qiáng)；D：TPC-1 細(xì)胞敲低TNFRSF12A 后侵襲能力減弱；E：TNFRSF12A 可逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 降低TPC-1 侵襲能力的作用；F：GEPⅠA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明TNFRSF12A在PTC組織中高表達(dá)

2.3 miR-204-5p對(duì)ATNFRSF12A的調(diào)控關(guān)系分析

為了在分子水平驗(yàn)證miR-204-5p 對(duì)TNFRSF12A的調(diào)控，進(jìn)一步分析miR-204-5p 在TNFRSF12A 3'UTR 的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A），使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)該靶點(diǎn)功能進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，過表達(dá)miR-204-5p 降低了轉(zhuǎn)染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 細(xì)胞中的熒光素酶活性，而加入miR-204-5p 抑制劑增加了轉(zhuǎn)染野生型TNFRSF12A 3'UTR TPC-1 細(xì)胞中熒光素酶的活性（均P＜0.05），而對(duì)突變型TNFRSF12A 3'UTR 無明顯影響（均P＞0.05）（圖3B）。

圖3 miR-204-5p 對(duì)ATNFRSF12A 的調(diào)控關(guān)系分析 A：與miR-204-5p 相作用的野生型及突變型TNFRSF12A 3'UTR 序列；B：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染野生型或突變型TNFRSF12A 3'UTR后，過表達(dá)或加入miR-204-5p抑制劑對(duì)TPC-1細(xì)胞的影響

3 討 論

根據(jù)全球數(shù)據(jù)[11]表示，在過去的30 年間，甲狀腺癌的發(fā)病呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，而PTC 約占所有甲狀腺癌病例的85%左右。在碘缺乏或碘過量飲食的國(guó)家，它也是最常見的甲狀腺癌亞型[12]。PTC 可發(fā)生在任何年齡[13-14]，其發(fā)病的平均年齡為40 歲，且發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，女性更為多見，比例為2∶1～4∶1[15]。PTC 的發(fā)病機(jī)制及原因尚不明確，可能與放射線接觸史[16]、碘缺乏或遺傳等因素[17]相關(guān)。進(jìn)一步研究和探索PTC 發(fā)病的分子機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)PTC 的預(yù)防和治療有重要意義。

miRNA 通過抑制細(xì)胞質(zhì)中mRNA 的翻譯和（或）降解，以及改變細(xì)胞核中基因表達(dá)，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。miRNA 的失調(diào)已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)，與遺傳分析相比，關(guān)于miRNA 作為PTC 生物標(biāo)志物的應(yīng)用的研究有很多。目前，已經(jīng)有研究證實(shí)，與正常甲狀腺組織相比，PTC 始終與特定miRNA（例如miR-146b，miR-221 和miR-222）的過表達(dá)有關(guān)。這些miRNA 的表達(dá)顯然與指示腫瘤侵襲性的特征有關(guān)，例如甲狀腺癌侵犯、復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和BRAFV600E 突變等[19-20]。

筆者通過對(duì)相關(guān)的測(cè)序進(jìn)行分析，篩選出了潛在研究靶點(diǎn)（miR-204-5p、miR-7-2、miR-146b、miR-222），然后通過在PTC 癌組織和細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定miR-204-5p 為研究對(duì)象，并通過侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-204-5p 對(duì)PTC 細(xì)胞的影響，進(jìn)一步證實(shí)了miRNA 在PTC 進(jìn)展中的作用。由于目前研究的局限性，其他三種miRNA 在PTC 中的作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

結(jié)合到下游基因3'UTR 區(qū)域以此抑制下游基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制是miRNA 調(diào)控的最主要分子機(jī)制。以此為基礎(chǔ)，結(jié)合相應(yīng)的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，本研究篩選出了TNFRSF12A 可能作為miR-204-5p 調(diào)控靶點(diǎn)。 TNFRSF12A， 也被稱為Fn14，它是TNF 受體超家族中包含細(xì)胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域的最小個(gè)體。有研究報(bào)道TNFRSF12A 在肝癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高，其水平的升高與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[21-22]，TNFRSF12A 也被認(rèn)為是促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素[23]，但它與PTC 的相關(guān)研究較少。本研究中發(fā)現(xiàn)TNFRSF12A 在PTC 組織中高表達(dá)，結(jié)合miR-204-5p在PTC 組織中低表達(dá)，預(yù)示著miR-204-5p 可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制TNFRSF12A。本研究結(jié)果也證實(shí)了miR-204-5p 能通過結(jié)合TNFRSF12A 3'UTR 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其表達(dá)。

總之，miR-204-5p/TNFRSF12A 軸PTC 的侵襲與進(jìn)展中起了重要作用，機(jī)制為PTC 細(xì)胞中miR-204-5p 表達(dá)下調(diào)，削弱了對(duì)TNFRSF12A 表達(dá)的抑制，從而導(dǎo)致PTC 細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：曾杰實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、審核和修改論文；喻潔、楊秋怡負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)收集和處理；喻潔、易嘉寧負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和解釋；喻潔負(fù)責(zé)手稿寫作。