尉卓凡，寧智文，胡波，袁時(shí)芳

（1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 甲乳血管外科，陜西 西安710032；2. 西安電子科技大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安710126）

在世界范圍內(nèi)，乳腺癌已成為最常見的腫瘤，是女性癌癥患者死亡的主要原因[1]，通過生物標(biāo)志物早期識別其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況至關(guān)重要。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells， CTC） 最早由Ashworth 發(fā)現(xiàn)，其數(shù)量和生物學(xué)特征等包含著癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)的關(guān)鍵信息，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）的獨(dú)立預(yù)后因素之一[2]。CTC 的檢測為研究癌癥轉(zhuǎn)移提供了一種無創(chuàng)方法。作為CTC 臨床應(yīng)用研究最廣泛的腫瘤之一，已經(jīng)開發(fā)了各種針對乳腺癌CTC 的檢測方法。然而，傳統(tǒng)檢測方法大多無法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測過程[3]，不完整不準(zhǔn)確的檢測結(jié)果限制了CTC在臨床中的應(yīng)用。與之相比，微流控芯片為CTC的全面研究帶來了可能[4]，憑借在特異度、敏感度、通量、效率上的優(yōu)勢，微流控芯片具有將CTC實(shí)時(shí)檢測應(yīng)用于臨床的巨大潛力。其中三維（3D）打印技術(shù)可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的微流控芯片制造，從而獲取更多關(guān)于腫瘤有價(jià)值的信息，推動(dòng)CTC 從指導(dǎo)腫瘤預(yù)后到預(yù)測腫瘤進(jìn)展，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供前所未有的機(jī)會(huì)。本文對基于不同原理的CTC 檢測方法進(jìn)行總結(jié)，著重分析了乳腺癌CTC 的微流控檢測研究現(xiàn)狀及進(jìn)展，對3D 打印微流控芯片的廣闊應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 常見的CTC檢測方法與存在問題

外周血中的CTC 濃度非常低，大多數(shù)癌癥患者每毫升血液中僅1～10 個(gè)CTC[5]，因此需要高敏感度和高特異度的技術(shù)來檢測。根據(jù)CTC 區(qū)別于血細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)，常見的檢測方法大致可分為兩類，即基于生物特性和基于物理特性的方法。

1.1 基于生物特性的方法

基于CTC 的生物學(xué)特征，通常利用附著在磁性物質(zhì)表面的細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體等來篩選CTC。

陽性富集通過靶向CTC 表面的特異性抗原來實(shí)現(xiàn)，通常可實(shí)現(xiàn)高純度富集。CellSearch 系統(tǒng)使用涂有上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的鐵磁顆粒，對CTC 進(jìn)行免疫磁分離并計(jì)數(shù)[6]，Cristofanilli 等[7]檢測了177 例MBC 患者的血液樣本后得到結(jié)論：每7.5 mL 血液中CTC≥5 個(gè)的患者，其無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和總體生存期（overall survival，OS）更短。然而該方法易造成假陰性率高，現(xiàn)已停止生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。另外，CTC 經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 過程后會(huì)導(dǎo)致EpCAM 的下調(diào)或丟失[8]，從而逃避陽性富集系統(tǒng)，即使是使用多種抗體組合的AdnaTest，也無法完全解決CTC 抗原異質(zhì)性導(dǎo)致的假陰性問題[9]。陰性富集策略往往通過抗體靶向、消耗外周血細(xì)胞，最常用的是抗CD45 抗體[10]，以高敏感度反向捕獲缺乏充分表達(dá)EpCAM 的CTC。但單獨(dú)使用此方法時(shí)往往降低了細(xì)胞純度，故通常與其他方法結(jié)合使用，例如Wu 等[11]開發(fā)的CanPatrol 技術(shù)先裂解紅細(xì)胞（RBC），再用磁珠消耗CD45+的白細(xì)胞（WBC），在乳腺癌患者血液樣本中檢測到CTC 及腫瘤微栓子。但是這種方法可能導(dǎo)致CK+/CD45+或“雙陽性”細(xì)胞的CTC 被去除以致低估其數(shù)量[5]。常見的基于生物特性CTC 檢測技術(shù)及其應(yīng)用特點(diǎn)見表1。

表1 常見的基于生物特性CTC檢測方法總結(jié)Table1 Summary of common CTC detection methods based on biological characteristics

1.2 基于物理特性的方法

CTC 以尺寸、密度、可變形性及介電性與血細(xì)胞相區(qū)別，一些技術(shù)據(jù)此可以快速分離富集CTC而無需標(biāo)記。

Drucker 等[14]測試了幾種方法，其中RosetteSep?使用抗體將血樣中的PBMC 與RBC 交聯(lián)形成免疫玫瑰花結(jié)，然后密度梯度離心將其去除，在MDA-MB-231 細(xì)胞加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中CTC 的捕獲效率約為40%，在15/28 例MBC 患者的血樣中檢測到CTC，ScreenCell ?使用微濾器基于細(xì)胞大小差異分離CTC，在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為55%的回收率，并在8 例MBC 患者中的6 例檢測到CTC，這兩種設(shè)備在低至2 個(gè)CTC/mL 的水平下保證足夠的敏感度。但此類方法容易忽略較小的CTC 和與WBC 具有相似變形能力的CTC，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。密度梯度離心法利用了CTC 和WBC 的比重差異， 如Ficoll 法和OncoQuick 法，后者因結(jié)合了離心和過濾而具有更高的捕獲率[15]。另外，基于CTC 與血細(xì)胞之間介電性差異， ApoStream?通過介電泳（dielectrophoresis，DEP）進(jìn)行CTC 的富集[9]，Le Du等[16]在47 例乳腺癌患者的血樣中檢測CTC，并聯(lián)合其他細(xì)胞標(biāo)志物對CTC 進(jìn)行染色區(qū)分3 種CTC 表型（上皮型、間質(zhì)型、癌癥干細(xì)胞樣CTC）。此方法雖然可以分離出單個(gè)CTC，但處理效率較慢，且細(xì)胞純度較低，電場亦會(huì)影響細(xì)胞表面活性和表面特征，影響后續(xù)分析[17]。

基于免疫親和力的捕獲方法雖然特異度很高，但受限于CTC 表面標(biāo)志物的表達(dá)，迄今為止，CTC的異質(zhì)性使其無法使用通用的特異性抗體來富集。而物理方法擺脫了靶向特定抗原的限制，未經(jīng)抗體標(biāo)記的CTC 也更利于后續(xù)表征分析，但離心、稀釋等預(yù)處理步驟會(huì)損失部分CTC，捕獲的CTC 純度并不令人滿意[18]。以上大多數(shù)CTC 檢測技術(shù)非常耗時(shí)，需要熟練的操作人員和昂貴儀器。因此，需要開發(fā)新的檢測技術(shù)，使CTC 的檢測更加方便、準(zhǔn)確和高效。常見的基于物理特性CTC 檢測技術(shù)及其應(yīng)用特點(diǎn)見表2。

表2 常見的基于物理特性CTC檢測方法總結(jié)Table 2 Summary of common CTC detection methods based on physical characteristics

2 乳腺癌CTC的微流控芯片檢測

微流控技術(shù)在CTC 檢測中的應(yīng)用出現(xiàn)于最近十幾年，微流控技術(shù)以高通量和敏感度精確控制微米級的流體和細(xì)胞，旨在將所有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和功能集成到數(shù)十毫米尺寸的設(shè)備中，并以較低的成本和較短的分析時(shí)間對化合物進(jìn)行微處理和微量分析。與傳統(tǒng)方法相比，微流控芯片具有操作自動(dòng)化、消耗樣品少、敏感度高、通量大等優(yōu)勢，并可將過濾、離心、磁選等集成到微尺度中[20]。小型、集成化的微流控芯片實(shí)現(xiàn)了CTC 富集、分離和分析的一站式過程，顯著減少了處理時(shí)間并提高捕獲效率，為開發(fā)真正的即時(shí)診斷設(shè)備創(chuàng)造了可能。該技術(shù)對CTC 的檢測方法大致可分為兩類：基于標(biāo)記的檢測和無標(biāo)記的檢測。

2.1 基于標(biāo)記的檢測

基于標(biāo)記的方法依賴免疫親和原理，微流控芯片精確控制流體的流動(dòng)速度和方向，通過影響CTC 表面抗原與抗體的相互作用從而直接影響捕獲效率。針對不同的細(xì)胞表面抗原，此類方法可以進(jìn)一步分為正向富集或負(fù)向富集。

2.1.1 正向富集 基于CTC 的抗原表達(dá)，正向富集法最常用的是EpCAM。Nagrath 等[21]制作的CTCChip 利用具有EpCAM 抗體涂層的微柱，使用不同類型腫瘤患者的全血樣本中進(jìn)行測試，在115/116 個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了CTC，其中乳腺癌患者（n=10）全血樣本分離的CTC 數(shù)量為5～176 個(gè)/mL，捕獲的平均純度為60%。隨后又進(jìn)一步開發(fā)了人字形芯片（HB-Chip），通過產(chǎn)生微渦流使血細(xì)胞被動(dòng)混合，增強(qiáng)了CTC 與抗體包被芯片表面之間的相互作用，其捕獲效率比CTC-Chip 提升了26.3%。類似地，微柱陣列、混沌混合、幾何增強(qiáng)混合和波浪人字形結(jié)構(gòu)等微流控平臺，憑借幾何功能化微結(jié)構(gòu)可優(yōu)化免疫捕獲效率[22-24]。例如借助混沌混合[23]和波浪形HB 芯片[24]的優(yōu)點(diǎn)制作了T-μFS 微流體系統(tǒng)，將10～103個(gè)MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)于200 μL 全血中后捕獲，效率為83.3%～94.2%，且細(xì)胞存活率為94.6%，這為完整、自動(dòng)地捕獲和釋放高活性CTC 帶來可能[25]。免疫磁泳法多用EpCAM 抗體偶聯(lián)磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNP），隨后在磁場中富集與之結(jié)合的CTC。Wang 等[26]制備了含有抗EpCAM 抗體的水凝膠包被的MNP，將MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)入血液中模擬CTC 的捕獲，效率約96%，同時(shí)檢測了5 例癌癥患者和5 名健康志愿者提供的血樣，結(jié)果在患者血液樣本中發(fā)現(xiàn)1～12 個(gè)CTC，而在健康血液樣本中未檢測到CTC，初步證明了其在臨床實(shí)踐中的實(shí)用性。同樣，Wu 等[27]用中性粒細(xì)胞膜對免疫磁性納米顆粒進(jìn)行表面功能化得到Neu-IMNs，可以同時(shí)減少非特異性蛋白質(zhì)的吸附和WBC 的干擾，并增強(qiáng)與CTC 的相互作用，成功從19/20 個(gè)乳腺癌患者血液樣本中分離出具有高純度和高活力的CTC，將其培養(yǎng)并進(jìn)行了基因突變分析。正向富集依賴特定的標(biāo)記物保證了高敏感度和純度，然而一些低表達(dá)或不表達(dá)EpCAM 的“正常樣”CTC[28]會(huì)減弱檢測的敏感度，從而影響對腫瘤的監(jiān)測和治療效果的評估。

2.1.2 負(fù)向富集 負(fù)向富集靶向并去除背景細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)CTC 的分離。Mishra 等[29]提出了LPCTC-iChip，以慣性分離陣列設(shè)備去除RBC 和血小板，結(jié)合高梯度磁性細(xì)胞分選儀去除WBC 并富集CTC，該團(tuán)隊(duì)將熒光標(biāo)記的乳腺癌CTC 摻入健康供體的血樣中，回收率為（89.2±5.7）%，并對其進(jìn)行了分子分析。然而，此方法雖然降低了血細(xì)胞被誤識別為CTC 的可能性，但分離純度通常較低，因此通常需要多次分離過程[30]，而且磁場中背景細(xì)胞的移動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致部分CTC 丟失[31]。此外，Szczerba等[32]發(fā)現(xiàn)CTC-WBC 簇的存在將增大乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛能，負(fù)向富集法可能會(huì)意外去除與WBC 相關(guān)的CTC。基于標(biāo)記的技術(shù)常利用特異性抗體靶向捕獲CTC，但這種方法受限于細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)。另外，由于抗體不可逆結(jié)合且不易降解，抗體標(biāo)記也會(huì)影響CTC 的完整性和活力[33]，因此會(huì)影響后續(xù)分析。

2.2 基于無標(biāo)記的檢測

無標(biāo)記法旨在減少使用特異性抗體而導(dǎo)致的誤差，既不影響細(xì)胞活力和基因表達(dá)譜，更有利于CTC 的下游分析，并有望實(shí)現(xiàn)更高的捕獲率[34]。其中主動(dòng)分選需要借助外力，通常利用電場、磁場、聲波或者光學(xué)驅(qū)動(dòng)，而被動(dòng)分選使用特定的通道結(jié)構(gòu)、流體動(dòng)力或空間位阻來檢測CTC，?；诔叽缁驊T性力進(jìn)行分選。

2.2.1 主動(dòng)分選 主動(dòng)分選主要通過施加外力操縱細(xì)胞來分離CTC。基于細(xì)胞的電生理特性，DEP 利用介電粒子與電場之間的相互作用將CTC 分離、捕獲[9,35]。Jahangiri 等[36]在AC-CSC 芯片上施加低頻交流電場后，讓不同表型的乳腺癌細(xì)胞系（MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468）分別通過AC-CSC 芯片，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的極化程度相對更低，且不同表型的乳腺癌細(xì)胞有其特定的極化頻率，同時(shí)，將MDA-MB-231 細(xì)胞與WBC 混合來模擬患者血液樣本，捕獲了約90% 的腫瘤細(xì)胞。Varmazyari 等[37]利用基于DEP 的微流控裝置，在保證細(xì)胞活力的情況下將乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞與WBC 分離，回收率和純度分別接近95%和100%。類似地，不同細(xì)胞在聲場下受到不同的力，據(jù)此也可將CTC 分選、富集[33]。例如，Zhang 等[38]將交變頻率聲場應(yīng)用于微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了從外周血單核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中無損分離三種不同的腫瘤細(xì)胞（MCF-7、A549、HCT116），即使在CTC 與PBMC 大小相近情況下也能實(shí)現(xiàn)有效分離，有效率高達(dá)95%，而PBMC 的污染率僅1%，為驗(yàn)證該方法的臨床應(yīng)用可能性，在4 例不同類型和階段的癌癥患者中進(jìn)行測試，平均收集到75.5 個(gè)CTC/mL。光學(xué)微流體系統(tǒng)也可以用來分離CTC[39]。Hu 等[40]使用葉酸將同源RBC 與CTC 偶聯(lián)，得到的CC-RBC 具有更大的體積和折射率，因此在光流體系統(tǒng)中的激光照明下可被精確分離，將人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞添加到2 mL血樣中測試，保持CTC 膜和功能的完整性的同時(shí)，達(dá)到92%的純度和90%的回收率。

2.2.2 被動(dòng)分選 在一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)[41]中，Parsortix?系統(tǒng)基于細(xì)胞大小差異富集CTC，對216 例MBC 患者和205 名健康志愿者的外周血進(jìn)行測試，證明了該系統(tǒng)能夠富集CTC 并進(jìn)行后續(xù)下游分析，該系統(tǒng)已獲得FDA 批準(zhǔn)用于MBC 的CTC 富集。依賴物理屏障微結(jié)構(gòu)的建模往往很困難，而利用流體動(dòng)力學(xué)慣性效應(yīng)，即可實(shí)現(xiàn)連續(xù)和精確控制流體而無需調(diào)節(jié)任何微觀物理結(jié)構(gòu)。Akbarnataj 等[42]使用具有梯形橫截面的不同曲率半徑的螺旋微通道，利用慣性升力結(jié)合迪恩渦流產(chǎn)生的拖拽力將CTC 聚焦于內(nèi)部出口，在2.5 mL/min 的流速下實(shí)現(xiàn)90% 的效率，捕獲的MCF-7 細(xì)胞高度存活。Zhu等[43]制造了PJMJ 微流體分選儀，將腫瘤細(xì)胞（A549、H460、MCF-7、H226 細(xì)胞）加標(biāo)入WBC 中模擬臨床樣本，實(shí)現(xiàn)了90.57%～94.14%的高回收率和48.67%～79.05%的純度，并且成功從MBC 和肺癌患者的血液樣本中分離CTC，捕獲率為每5 mL 樣本7～226 個(gè)CTC，驗(yàn)證了其臨床實(shí)用性。

無標(biāo)記策略不會(huì)影響細(xì)胞活力及基因表達(dá)譜，更快的樣品處理確保了較大通量，然而CTC 的異質(zhì)性以及與背景細(xì)胞的重疊，導(dǎo)致其回收率和純度并不令人滿意。

3 新興的集成技術(shù)及3D打印微流控芯片

目前，對CTC 的研究已經(jīng)不限于單純枚舉數(shù)量，已有研究將基于各種原理的檢測手段集成在微流控芯片中，結(jié)合各自的優(yōu)勢并實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，在有效分離和富集CTC 后對其進(jìn)行分子表征，據(jù)此可以幫助闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找治療靶點(diǎn)及監(jiān)測藥物效應(yīng)等[44]。

Wang 等[45]設(shè)計(jì)了一種楔形微流控芯片，用免疫微粒標(biāo)記WBC 后在明場顯微鏡下區(qū)分CTC 并進(jìn)行全自動(dòng)化的計(jì)數(shù)、鑒定，將MCF-7、SK-BR-3 等細(xì)胞系摻入血液中，通過該芯片的形態(tài)識別可快速區(qū)分腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行捕獲。Lee 等[46]基于免疫磁泳和熒光標(biāo)記設(shè)計(jì)了Mag-Gradient 芯片，將MNP 與HER-2 結(jié)合，利用3 種生物標(biāo)志物（HER-2、ER 和PR）的差異性表達(dá)，對4 種不同亞型乳腺癌細(xì)胞系（BT-474、SK-BR-3、MCF-7 和MDA-MB-231） 的混合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，借助磁場和免疫熒光信號完成乳腺癌CTC 捕獲和分型。Green 等[47]使用一種雙模塊微流控設(shè)備PillarX，其中Pillar 裝置基于細(xì)胞大小和可變形性，而X-磁裝置使用偶聯(lián)EpCAM 抗體的MNP，二者串聯(lián)來捕獲CTC 簇和單個(gè)CTC，除使用MDA-MB-231 荷瘤小鼠進(jìn)行測試外，在6 例MBC患者的血樣（500 μL）中成功檢測出CTC（12～79 個(gè)）和CTC 簇（5～16 個(gè)）。Schwab 等[48]制造的MyCTC 芯片，能夠在同一集成化設(shè)備中對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲、培養(yǎng)擴(kuò)增和藥物敏感性測試，在加標(biāo)癌細(xì)胞系樣本中的回收率分別為95%～98%和97%～99%，并且成功在1 例MBC 患者血液樣本中捕獲了單個(gè)CTC 和CTC 簇。Lv 等[49]設(shè)計(jì)了一種近紅外（near infrared，NIR）光響應(yīng)微流控芯片，并通過側(cè)流微陣列（lateral flow microarray，LFM） 芯片和光熱響應(yīng)系統(tǒng)的組合，在保證高活性的前提下實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTC 的捕獲和無損釋放，將MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)到全血中以模擬患者血液樣本， 捕獲的純度為（90±2）%。

傳統(tǒng)的微流控設(shè)備基于光刻的制造工藝，復(fù)雜的制造步驟、昂貴的材料成本、耗時(shí)的制作過程均限制了微流控設(shè)備從實(shí)驗(yàn)室到實(shí)際臨床實(shí)施的轉(zhuǎn)化[50]。與之相比，3D 打印技術(shù)具有相對靈活性、直接性和快速原型制作的能力，能夠逐層打印出多種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，增加了微流控芯片的功能表面積，為精確和小型的微流控芯片制造提供便利[51]，此外，各種適宜的原材料的出現(xiàn)將不斷豐富微流控設(shè)備的應(yīng)用范圍，促進(jìn)其在研究和臨床環(huán)境中被廣泛接受。

Chen[52]等提出了一種3D 類河灣截面微流控芯片，主要利用剪切梯度升力與迪恩曳力實(shí)現(xiàn)CTC的慣性聚焦及富集，將熒光標(biāo)記的人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞摻入兔全血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其最佳回收率和富集比分別可達(dá)到95.0%和1.90。本課題組[53]使用4 臺商用3D 打印機(jī)設(shè)計(jì)并打印了矩形截面蛇形微流控芯片模型，模擬確定了最佳通道曲率和流速并成功聚焦MCF-7 細(xì)胞。最近，Chu 等[54]借助3D打印技術(shù)將WBC 捕獲通道和微濾裝置結(jié)合在同一微流體設(shè)備中，利用抗CD45 抗體捕獲WBC，同時(shí)用過濾器耗竭RBC、血小板等，由此分離富集CTC，將人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞摻入健康志愿者提供的全血中測試設(shè)備性能，腫瘤細(xì)胞的平均恢復(fù)率為91.4%，并且保持了完整性及活力，也在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者（前列腺癌、胰腺癌）的外周血樣本分離出CTC，表明該裝置適用于不同的臨床情境。

3D 打印微流控芯片可以為CTC 檢測和早期監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移開辟新機(jī)會(huì)，可以預(yù)測，3D 打印技術(shù)在未來將會(huì)成為微流控芯片制造領(lǐng)域最為重要方法之一，為CTC 檢測廣泛應(yīng)用于臨床提供有益的見解。

4 總結(jié)與展望

CTC 的檢測可以為乳腺癌的進(jìn)展提供有價(jià)值的臨床見解，監(jiān)測患者在治療期間的反應(yīng)并為治療方案的制定提供參考。微流控技術(shù)以其成本低廉、操作簡單、試劑消耗少、小型化、快速等獨(dú)特優(yōu)勢，越來越多地應(yīng)用于CTC 分離、鑒定和表征的各項(xiàng)研究中。3D 打印技術(shù)憑借設(shè)計(jì)靈活性，克服了微流控設(shè)備功能表面積有限的不足，為微流控芯片制造提出了一種更優(yōu)方案。在未來，期望微流控芯片將常規(guī)用于CTC 的即時(shí)檢測，這對研究乳腺癌及其轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要意義，將在癌癥的早期診斷、預(yù)后的觀察，以及患者的個(gè)性化治療方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：尉卓凡負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)論文框架，論文撰寫，根據(jù)修改意見進(jìn)行論文修訂；寧智文負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)，對論文中微流控等專業(yè)領(lǐng)域部分做出修改解釋；胡波負(fù)責(zé)協(xié)助確定研究選題，提供相關(guān)研究材料支持，論文修訂，對微流控領(lǐng)域相關(guān)知識提供見解與指導(dǎo)；袁時(shí)芳提出并確定研究選題，確定論文結(jié)構(gòu)框架，明確論文撰寫內(nèi)容，論文修訂，給予指導(dǎo)性意見。